Роль хорионического гонадотропина в дифференцировке интерлейкин-17-продуцирующих Т-лимфоцитов-хелперов (Th17) Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

2013 БИОЛОГИЯ Вып. 3

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

УДК 612.018:612.017.1:611.018.53

РОЛЬ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА В ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ ИНТЕРЛЕЙКИН-17-ПРОДУЦИРУЮЩИХ Т-ЛИМФОЦИТОВ-ХЕЛПЕРОВ (ГШ7)

С. А. Заморинаа, С. В. Ширшева> ь

а Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13; mantissa7@mail.ru ь Пермский государственный национальный исследовательский университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15; shirshev@iegm.ru; (342)2808431

Изучены эффекты хорионического гонадотропина (ХГ) на дифференцировку интерлейкин (1Ь)-17-продуцирующих лимфоцитов. Установлено, что на тимическом этапе гормон не влиял на количество предшественников ТЫ7 (CD4+CD161+) и на генерацию ТЫ7 (CD4+CD161+IL17A+), однако в низкой концентрации (10 МЕ/мл) увеличивал количество CD4+IL17A+-тимоцитов. На уровне периферических ТЫ7 гормон снижал количество CD4+ROR- Ф+- и CD4+ROR- <t+IL-17А+-лимфоцитов. Таким образом, ХГ является эффективным модулятором ТЫ7-лимфоцитов, оказывая разнонаправленные эффекты на тимическом и посттимическом этапах дифференцировки.

Ключевые слова: хорионический гонадотропин; интерлейкин-17; ТЫ7; тимоциты; Т-лимфоциты.

Введение

Хорионический гонадотропин (ХГ) - ключевой гормон беременности, активно участвующий в контроле иммунных процессов, сопровождающих гестацию. Однако регуляция активности относительно недавно открытой субпопуляции интерлейкин (]Ь)-17-продуцирующих лимфоцитов (Th17) со стороны ХГ практически не изучена.

Субпопуляция Th17 была впервые описана в 2005 г. L.E. Harrington и H. Park [Harrington et al., 2005; Park et al., 2005], которые независимо друг от друга опубликовали данные о том, что наивные Т-хелперы (Th) могут дифференцироваться в IL-17-продуциру-ющие клетки, образуя отдельную популяцию лимфоцитов. Клетка-предшественник может дифференцироваться в Th1, Th2, Т-регуляторные лимфоциты (Treg) и Th17 в зависимости от цитокиновых сигналов и до окончательной дифференцировки субпопуляции обладает пластичностью. В процессе формирования Th17 клетка-предшественник дифференцируется в Th17/Treg-интермедиаторную клетку, которая экспрессирует как мастер-регулятор Th17 -RORyt, так и мастер-регулятор T -регуляторных лимфоцитов - FOXP3 (forkhead box P3). Дальнейшая дифференцировка регулируется трансформирующим фактором роста -"(TGF--*): когда дендритная клетка активирована микроорганизмами, она продуцирует

IL-1'и IL-6, в этом случае сочетание TGF-'и IL-1f+IL-6 индуцируют дифференцировку по Th17 типу [Saito et al., 2010].

Основным транскрипционным фактором Th17 является RORyt (RORC2) (retinoid orphan nuclear receptor). Важную роль в развитии уже дифференцированных Th17 играет IL-23 и IL-21, в то время как TGF-'-в высоких концентрациях ингибирует развитие Th17. Однако в низких дозах, а также совместно с IL-6, TGF--- индуцирует дифференцировку наивных Т-клеток периферической крови в Th17 [Кетлинский, 2009]. Помимо этого, важным фактором дифференцировки этих клеток является IL-1P, который может усиливать действие IL-6 и IL-23. Из этих факторов складывается стимул для дифференциров-ки наивных Т-лимфоцитов в Th17. IL-4 и интерферон- °(IFN- ° способны ингибировать развитие Th17, но IL-17 не ингибирует дифференцировку Th1/Th2 [Кетлинский, 2009]. IL-17 (A и F), являясь основным цитокином Th17, вызывает синтез IL-1, IL-6, IL-8 и ряда других воспалительных факторов [Кологривова, Кологривова, Суслова, 2011]. Так, IL-17 участвует в развитии аутоиммунных заболеваний и остром отторжении трансплантата. Известно, что IL-17 играет важную роль в патофизиологии ревматоидного артрита [Xie, Wang, Li, 2012], в то время как во время беременности симптомы этого заболевания становятся менее выраженными.

© Заморина С. А., Ширшев С. В., 2013

У здоровых людей в периферической крови уровень Thn-клеток составляет 0.64-1.4%. Уровень этих клеток в период беременности сопоставим с таковым у небеременных женшин, но есть данные о том, что в III триместре он ниже [Santner-Nanan et al., 2009]. Однако количество этих клеток в децидуальной оболочке выше, чем на периферии. Вероятно, это связано с необходимым усилением противо-микробного иммунитета.

Нормальная беременность сопровождается снижением Th17 в периферической крови в сравнении с небеременными женшинами [Santner-Nanan et al., 2009]. Повышение уровня Th17 может вести к преждевременным родам или спонтанному аборту [Saito et al., 2010]. Однако повышение IL-17 является следствием гибели плода во время прерывания беременности, но не причиной гибели. В частности, хроническое воспаление ведет к аборту с повышением уровня провоспалительных цитокинов, что влечет за собой изменение баланса между Treg/Th17.

Цель работы - изучение влияния ХГ на тимический и посттимический этапы дифференцировки Th17.

Материалы и методы

ХГ («Profasi», Италия) применяли в концентрациях 10 и 100 ME/мл (II-III и I триместр беременности, соответственно). Тимический этап изучали на тимоцитах (CD4+CD8+) детей до 1 года, выделенных из фрагментов тимуса, удаляемых в ходе сердечнососудистых операций. Посттимический этап изучали на выделенных методом магнитной селекции периферических СD4+-лимфоцитах небеременных женшин. Культуры клеток инкубировали с ХГ в полной питательной среде в течение 72 ч. при 372С в условиях 5% СО2, в присутствии стандартных индукторов Th17 (IL-1P (10 нг/мл, «eBioscience», США) и IL-6 (10 нг/мл, «eBioscience», США) [Acosta-Rodrigiez et al., 2007], магнитные частицы с анти-CD3/CD28 моноклональными антителами (Dynabeads Human T-activator CD3/CD28, «Invitrogen», США), и нейтрализуюшие анти-ИФН- о и анти-ИЛ-4 антитела (10 мкг/мл, «eBioscience», США). Число Th17 оценивали как процент CD4+-лимфоцитов, экспрессируюших ROR- 0 и 1Ь-17А в гейте CD4+-клеток, кроме этого на тимоцитах оценивали экспрессию CD161 (все антитела «eBioscience», США).

Для индукции дифференцировки Th17 из CD4-позитивных Т-лимфоцитов в культуры вносили аналогичные индукторы. После 72 ч. инкубации оценивали количество Th17 как процент CD4+-лимфоци-тов (FITC Anti-Human CD4) («eBioscience», США), экспрессируюших транскрипционный фактор ROR-О (Anti-Mouse/Human ROR-gamma-t-PE), ИЛ-17 (Anti-Human IL17A-PerCP-Cy5.5) («eBioscience», США). В ряде экспериментов количество Th17 также определяли по экспрессии хемокинового рецептора CCR6 CD4+IL 17A+(CD196; CCR6-PE)

(«eBioscience», США), поскольку Th17 постоянно экспрессируют этот рецептор [Annunziato et al., 2008]. Измерения проводили на проточном цитофлу-ориметре FACSCalibur («Becton Dickinson», США). В супернатантах культур параллельно оценивали уровень ИЛ-17 иммуноферментным методом про помощи набора («eBioscience», США).

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием парного /-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

При изучении влияния ХГ на индукцию Th17 в культурах JL-1@- и IL-6-примированных тимоцитов установлено, что гормон в низкой концентрации увеличивал количество CD4+IL-17A+-тимоцитов в культуре, в то время как в высокой концентрации ХГ не оказывал подобного эффекта. Аналогично не выявлено влияния ХГ на уровень CD4+ROR- ° +, CD4+CD161+, а также CD4+CD161+IL-17A+ в культуре (рис. 1). Таким образом, ХГ стимулирует экспрессию IL17A в CD4-позитивных тимоцитах, этот эффект проявляется только при использовании низкой концентрации гормона. По-видимому, из-за того, что тимоциты характеризуются низкой экспрессией рецепторов для ХГ [Su et al., 2013] отсутствие эффекта высокой концентрации гормона, наблюдаемой в I триместре, объясняется десенситиза-цией его рецепторов, что делает возможным реализацию эффектов ХГ только в низкой концентрации.

а)

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

ХГ 10 ME/мл ХГ 100 ME/мл

ХГ 10 ME/мл ХГ 100 ME/мл

контроль ХГ 10 ME/мл ХГ 100 ME/мл

*

в)

0

Рис. 1. Влияние ХГ на тимический этап дифференцировки ТЫ7 (п=7):

а) CD4+IL17A+-тимоциты; б) CD4+ROR <1+-тимоциты; в) CD4+CD161+IL17A+-тимоциты; здесь и далее * - достоверные (р<0.05) по 1-критерию Стьюдента различия с контролем

В отношении посттимического этапа дифференцировки ТЫ7 показано, что ХГ снижал количество CD4+-лимфоцитов, экспрессирующих ROR-Ф (рис. 2). Кроме того, ХГ достоверно снижал уровень дубль-позитивных ROR- Ф+]Ь-17А+-лимфоцитов.

Оценка уровня ]Ь-17А в супернатантах фракционированных CD4+-клетках подтвердила угнетающий эффект ХГ на процессы дифференцировки ТЪ в ТЫ7 на уровне периферических Т-лимфоцитов (рис. 2г). Кроме этого, нами показано, что гормон достоверно снижает экспрессию хемокинового рецептора CCR6, необходимого для направленной миграции ТЫ7 в очаг воспаления (рис. 2в).

а) 1,4

, 1,2 2

! 1

1 0,8 г

* 0,6 «І 0,4 3 0,2

^ Г\

а 0

ХГ 10 МЕ/мл ХГ 100 МЕ/мл

б)

в)

3

2,5

2

' 1,5

1

о

0,5

0

2,5

контроль

ХГ 10 МЕ/мл ХГ 100 МЕ/мл

и + . < я г- я

1

а

и

* *

контроль

ХГ 10 МЕ/мл ХГ 100 МЕ/мл

Г) 350

300

Ч Л и Е 250

200

< 150

100

50

0

контроль ХГ 10 МЕ/мл ХГ 100 МЕ/мл

Рис. 2. Влияние ХГ на посттимический этап дифференцировки ТЫ7 (п=7):

а) CD4+IL17A+-лимфоциты; б) CD4+ROR <Г-лимфоциты; в) CD4+CCR6+IL17A+-лимфоциты; г) уровень ГЬ-17А в супернатантах культур

Важно отметить, что ХГ реализует ТЫ7-угне-тающий эффект вне зависимости от концентраций, т.е. на протяжении всего периода протекающей беременности. Таким образом, ХГ препятствует не только дифференцировке ТЮ в ТЫ7, но и угнетает их функциональную активность. С учетом того факта, что ХГ индуцирует экспрессию молекулы FOXP3 [Заморина, Ширшев, 2013], содержащей домен (кодируемый экзоном 2), ответственный за непосредственное связывание транскрипционных факторов семейства ROR [1сЫуата е! а1., 2008], можно предположить, что это создает условия для поляризации CD4+ Т-клеток в Treg, одновременно блокируя процессы дифференцировки в ТЫ7.

Таким образом, ХГ практически не влияет на тимический этап дифференцировки ТЫ7 и угнетает функциональную активность данных эффекторов на уровне периферических лимфоцитов.

Вероятно, продемонстрированное нами на уровне периферических Т-лимфоцитов ХГ-зависи-мое угнетение ТЫ7 способно предотвращать анти-фетальные реакции, тем самым участвуя в поддержании иммунной толерантности при беременности.

Работа поддержана программой Президиума РАН МКБ, 12-П-4-1017.

Библиографический список

Заморина С.А, Ширшев С.В. Хорионический гонадотропин - фактор индукции иммунной толерантности при беременности // Иммунология. 2013. № 2. С. 105-109.

Кетлинский С.А. ТЫ7 новая линия дифференцировки Т хелперов: обзор данных // Цитокины и воспаление. 2009. № 2. С. 3-15.

Кологривова И.В., Кологривова Е.Н., Суслова Т.Е. Молекулярные аспекты функционирования Т-хелперов 17 типа // Бюллетень сибирской медицины. 2011. № 4. С. 93-98.

я

*

2

Acosta-Rodriguez E.V. et al. Interleukins lbeta and 6 but not transforming growth factor-beta are essential for the differentiation of interleukin 17-producing human T helper cells // Nat. Immunol. 2007. Vol. 8. P. 942-949.

Annunziato F. et al. The phenotype of human Th17 cells and their precursors, the cytokines that mediate their differentiation and the role of Th17 cells in inflammation // Int Immunol. 2008. Vol. 20. P. 1361-136.

Harrington L.E. et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages // Nat. Immunol. 2005. Vol. 6. P. 1123-1132.

Ichiyama K. et al. Foxp3 inhibits RORyt-mediated IL-17A mRNA transcription through direct interaction with RORyt // J. Biol. Chem. 2008. Vol. 283. P. 17003-17008.

Park H. et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing

interleukin // Nat. Immunol. 2005. Vol. 6. Р. 1133— 1141.

Saito S. et al. Th1/Th2/Th17 and regulatory T-cell paradigm in pregnancy // Am. J. Reprod. Immunol. 2010. Vol. 63. P. 601-610.

Santner-Nanan B. et al. Systemic increase in the ratio between Foxp3+ and IL-17-producing CD4+ T cells in healthy pregnancy but not in preeclampsia // J. Immunol. 2009. Vol. 183. P. 7023-7030.

Su___S. et al. The compensatory expression of

reproductive hormone receptors in the thymus of the male rat following active immunization against GnRH // Gen. Comp. Endocrinol. 2013. Vol. 185, P. 57-66.

Xie Q., Wang S.C., Li J. IL-17: a potential therapeutic target for rheumatoid arthritis // Clin. Rheumatol. 2012. № 7. Р. 1145-1146.

Поступила в редакцию 21.10.2013

Role of human chorionic gonadotropin in differentiation of interleukin-17-producing T-

lymphocytes helpers

S. A. Zamorina, candidate of biology, senior researcher

Institute of ecology and genetics of microorganisms, Ural Branch of the RAS, 13, Golev Str., Perm, Russia, 614081, mantissa7@mail.ru S. V. Shirshev, doctor of medicine, professor

Institute of ecology and genetics of microorganisms, Ural Branch of the RAS, 13, Golev Str., Perm, Russia, 614081 Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; shirshev@iegm.ru; (342)2808431

Effects of human chorionic gonadotropin (hCG) on differentiation of interleukin (IL)-17-producing lymphocytes were analyzed. It was revealed that at thymic stage of differentiation this hormone did not affect the amount of Th17 (CD4+CD161+) precursors and Th17 (CD4+CD161+IL17A+) generation; however in low concentration (10 IU/ml) it raised the number of CD4+IL17A+-thymocytes. At the level of peripheral Th17 this hormone was found to reduce the quantity of CD4+ROR- °+- and CD4+ROR- °+IL-17A+-lymphocytes. Consequently hCG is an effective Th-17-lymphocyte modulator while rendering multidirectional effects at thymic and post-thymic stages of differentiation.

Key words: human chorionic gonadotropin; interleukin-17; Th17; thymocytes; T-lymphocytes.

Заморина Светлана Анатольевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН

Ширшев Сергей Викторович, доктор медицинских наук, профессор

ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН

ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»