CC BY
16УДК 557.123:547.241].012.1
В.В. Белахов1, А.В. Догадина2, Б.И. Ионин3
Введение
Полиеновые макролидные антибиотики (ПМА) амфотерицин В, нистатин, пимарицин, кандицидин и другие широко применяются в современной микологической практике для лечения как поверхностных, так и глубоких микозов [1-3]. Однако ПМА, используемые для лекарственной терапии микозов, не в полной мере удовлетворяют потребности врачей-клиницистов из-за их ограниченной эффективности, обусловленной высокой токсичностью (главным образом, нефротоксичностью), нерастворимостью в воде, что приводит к низкой всасываемости из желудочно-кишечного тракта, а также снижением чувствительности к этим противогрибковым препаратам патогенных грибковых микроорганизмов [4-6]. Ввиду этого поиск новых производных ПМА с улучшенными медикобиологическими свойствами продолжается [7-9].
В качестве объекта исследования нами выбран тетраеновый макролидный антибиотик пимарицин, который широко применяется для лечения многих клинических форм кандидоза [10-12]. Ранее нами описаны гидро-фосфорильные [13] и 1\1-арилзамещенные [14] производные пимарицина. Продолжая исследования по получению полусинтетических производных пимарицина, мы изучили реакции этого полиенового антибиотика с хлорацетилен-диэтилфосфонатом. В предыдущих работах были описаны реакции хлорацетиленфосфонатов с первичными аминами, в результате которых получены фосфорилированные альдокетенимины [15, 16]. Эти реакции могут рассматри-
ХИМИЧЕСКАЯ
МОДИФИКАЦИЯ
ТЕТРАЕНОВОГО
МАКРОЛИДНОГО
АНТИБИОТИКА
ПИМАРИЦИНА
ДИЭТИЛХЛОРАЦЕТИЛЕН-
ФОСФОНАТОМ
Технион - Израильский институт технологии (химический факультет), Хайфа, Израиль;
Са нкт- Петербурский государственный технологический институт (Технический университет) Санкт-Петербург, Россия
Осуществлена химическая модификация тетраенового макролидного антибиотика пимарицина с помощью диэтилхлорацетиленфосфоната, приводящая к образованию соотвествующего фосфорилированного альдокетениминового производного этого антибиотика. Изучены физико-химические свойства и противогрибковая активность фосфорилированного альдокетениминового производного пимарицина в отношении дрожжеподобных грибов рода Candida.
Ключевые слова: полиеновые макролидные антибиотики, пимарицин, диэтилхлорацетиленфосфонат, химическая модификация, анти-фунгальная активность.
ваться как модельные для химической модификации ПМА с использованием хлорацетиленфосфонатов.
Экспериментальная химическая часть
Использовали пимарицин производства "Sigma" (США), полученный микробиологическим синтезом с помощью продуцента Streptomyces chattanoogensis. Хлорацети-лендиэтилфосфонат получен по методу, описанному в [15, 16]. Органические растворители перед использованием очищали по методикамз описанным в [17].
Спектры 1Н и С ЯМР получены на приборе "Bruker Ауапсе" (Германия) с рабочей частотой 500 МГц. Исследовали 15 % растворы в МеОН^4, внутренний эталон - ТМС. Спектры 31Р ЯМР получены на приборе "Bruker" АС-200 (Германия) с рабочей частотой 200 МГц. Химические сдвиги 5 31Р определены относительно внешнего стандарта 85 % Н3РО4. ИК-спектры регистрировали на приборе "Bruker vector 22" (Германия) в таблетках КВг. УФ-спектры сняты на спектрофотометре "Ultrospec 2100pro" ("Biochrom", Великобритания). Индивидуальность производного пимарицина 1 контролировали с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах Silica Gel 60 F254 (0,25 мм, "Merck", Германия) в системе растворителей: метанол-ацетон-уксусная кислота, 8 : 1 : 1. Вещество проявляли на хроматограммах с помощью УФ-света. В качестве сорбента использовали Silica Gel 60 (63-200 мм, "Merck", Германия).
1 Белахов Валерий Владимирович, канд. хим. наук, вед. науч. сотр., химический факультет, Технион - Израильский институт технологии, e-mail: chvalery@techunix.technion.ac.il
2 Догадина Альбина Владимировна, канд. хим. наук,вед. науч. сотр., каф. органической химии, e-mail: dog_alla@mail.ru
3 Ионин Борис Иосифович, д-р хим. наук, профессор, каф. органической химии, e-mail: borisionin@mail.ru
Дата поступления - 27 марта 2013 года
№(кетениминдиэтилфосфонат) пимарицин (І). К 2.0 г (0,003 моля) пимарицина, растворенного в 30 мл смеси безводных растворителей N,N-диметилформамида и пиридина (1 : 2), при перемешивании добавляли 0.6l г (0,003l моля) хлорацетилендиэтил-фосфоната в присутствии каталитического количества диметиламинопиридина. Реакцию проводили при -5 °С в течение 3 ч в атмосфере аргона. Контроль за ходом реакции осуществляли с помощью ТСХ. По окончании взаимодействия реакционный раствор фильтровали, приливали к фильтрату избыточное количество (300 мл) диэтило-вого эфира. К выпавшей маслянистой жидкости добавляли метанол (25 мл), полученную суспензию фильтровали, фильтрат пропускали через колонку, заполненную Silica gel. В качестве элюента использовали систему растворителей CHClз-Мe0Н-H20-NH40H, 15 : 10 : 0,3 : 0,05. Элюаты, содержащие целевой продукт, объединяли, концентрировали в вакууме, а остаток сушили в вакууме при 20 °С в течение 4 ч. Получали соединение І в виде мелких кристаллов белого цвета. Выход 59 %, т. пл. 163-167 °С (разл.), R 0.47. Спектр ЯМР 1Н (МеОН^), б, м.д.: 1.16 д (1Н, /6eq,7 11.0 Гц, ^6eq), 1.23 дд (1Н, Ji0ax,ii 11.2 Гц, Ji0axi0eq 12.4 Гц, H-10ax), 1.24 с (3Н, Н-6'-СНз), 1,27 т (6H, CH30-P, /нp 11,7 Гц), 1,32 с (3Н, 26-СНз), 1.55 д (1Н, /8ax, 8eq 14.2 Гц, H-8ax), 1.57 дд (1Н, Jl4ax,14eq 14.0 Гц, Jl4eq,15 2.0 Гц, Н-14ax), 1.66 с (1Н, ^8eq), 1.95 д (д, Ji0eq 11 4.8 Гц, H-10eq), 1.97 t (1Н, /12,13 10.5 Гц, Н-12), 2.05 дд (1Н, /6ax,6eq 14.4 Гц, /6ax,7 0.9 Гц, H-6ax), 2.20 дд (lH, /24ax, 24eq 13.5 Гц, /24ax, 25 11.0 Гц, H-24ax), 2.28 д (1H, /м«,, 15 3.5 Гц, H-14eq), 2.36 д (1H, /24eq, 25 5.6 Гц, H-24eq), 2.79 дд (1H, /5,6ax 1.8 Гц, /5 6eq 8.3 Гц, H-5), 3.12 д (1H, /45 1.5 Гц, H-4), 3.16 д (1H, /3'4' 9.0 Гц, H-3-), 3.21 д (1H, /5' 6'Me 6.5 Гц, H-50, 3.29 д (1Н, JW 3.5 Гц), 3.35 д (1H, /4'5' 9.0 Гц, H-4'), 3.64 дк (4H, CH20-P, /w 11,7 Гц), 3.98 д (lH, /2',з' 3.5 Гц, H-2'), 4.25 д (1H, /11,12 10.5 Гц, H-11), 4.28 дд (1H, /7,8ax 1.3 Гц, /7,8eq 10.2 Гц, H-7), 4.34 дд (1H, /13,14ax 8.4 Гц, /13,14eq 1.2 Гц, H-13), 4.38 д (1H, /1516 8.3 Гц, H-15), 4.53 д (1H, /Гг 1.0 Гц, H-1'), 4.68 д (1H, /25,26-Me 6.5 Гц, H-25), 5.56 дд (1H, />3,24ax 8.8 Гц, /23 24eq 2.5 Гц, H-23), 5.95 д (1H, /1617 15.2 Гц, H-
16), 6.05 дд (1H, /23 15.8 Гц, /24 0.6 Гц, H-2), 6.09 д (1H, /2223 15.4 Гц, H-22), 6.11 д (1H, /17 18 10 Гц, H-17), 6.15 c (1H, H-20), 6.17 c (1H, H-21), 6.20 c (1H, H-19), 6.38 д (1H, /3,4 7.5 Гц, H-3), 6.43 c (1H, H-18). Спектр ЯМР 13С, б, м.д.: l8.25 (С-6'), 20.63 (C-26), 40.2 (альдоуглеродный атом, 1/cp 214.7 Гц,), 41.16 (C-6), 42.61 (C-10), 43.10 (C-14), 44.54 (C-24), 47.83 (C-8), 56.48 (C-4), 57.16 (C-3'), 60.24 (C-5), 61.14 (C-12), 65.93 (C-5'), 68.22 (C-13), 68.64 (C-11), 69.53 (C-7), 71.92 (C-25), 73.08 (C-2'), 74.76 (C-4'), 75.39 (C-5), 81.58 (C-15), 99.73 (C-9), 100.84 (C-1'), 126.32 (C-2), 130.70 (C-16), 133.02 (C-17), 133.43 (C-18), 133.89 (C-19), 134.35 (C-20), 134.59 (C-21), 135.12 (C-22), 137.51 (C-23), 145.56 (C-3), 167.94 (C-1), 173.6 (дигональный углеродный атом углерода, 2/cp 7.5 Гц), 178.25 (C-27). Спектр ЯМР 31Р, б, м.д.: 25.7.
Экспериментальная биологическая часть
В качестве препарата сравнения при проведении медико-биологических исследований использовали пима-рицин.
Определение противогрибковой активности производного пимарицина І в отношении дрожжеподобных грибов рода Candida (тест-культур и клинически выделенных штаммов) проводили методом серийных разведений в жидкой питательной среде. Метод основан на последовательном 2-кратном разведении изучаемых соединений. Минимальная фунгистатическая концентрация (МФсК) устанавливалась по результатам визуальной оценки интенсивности роста тест-культуры в опытных и контрольных пробирках на основании 3-кратных повторностей.
Результаты и обсуждение
На основе ранее изученных реакций [15, 16], а также с учетом последних достижений в химии кетеними-нов [18-21] нами разработана методика фосфорилирова-ния тетраенового макролидного антибиотика пимарицина, в которой в качестве фосфорилирующего агента использован хлорацетилендиэтилфосфонат.
Было показано, что химическая модификация пимарицина хлорацетилендиэтилфосфонатом протекает с высокой селективностью с образованием фосфорилиро-ванного альдокетениминового производного пимарицина 1, т.е. имеет место взаимодействие реагента с первичной аминогруппой микозамина (3-амино-3,6-дидезокси-й-
маннозой). Ранее нами была показана высокая селективность аналогичных реакций нистатина А1 с триалкилхлор-силанами, в результате которых образуются соответствующие 1\1-алкилсилильные производные этого тетраенового макролидного антибиотика [22].
Полученное производное пимарицина 1 представляет собой твердое вещество, не имеющее четкой температуры плавления и разлагающееся при нагревании. Это соединение легко растворяется в ДМСО и ДМФА, ограниченно растворяются в воде и водных растворах,
спиртах, пиридине и ацетоне, не растворяются в хлороформе, эфире, бензоле и гексане.
Структура фосфорилированного альдокетениминового производного пимарицина 1 подтверждена с помощью ЯМР (:Н, 13С и 31Р), ИК- и УФ-спектроскопии. В спектрах ПМР соединения 1 отмечаются сигналы протонов, присущие пимарицину, протоны этокси-групп представлены триплетными сигналами метильных групп (5
1.27 м.д.) и дублет-квартетными сигналами метиленовых групп (5 3.64 м.д.). Константа расщепления от атома фосфора [7нр(СИ20-Р)] составляла 11.7 Гц. Протон кетеними-новой группировки представлен дуплетом в области 5 3.29 м.д. с константой спин-спинового взаимодействия .^р 3.5 Гц, что согласуется с литературными данными [15]. В спектрах ЯМР 13С присутствуют сигналы атомов углерода, присущие пимарицину, а также наблюдается дублетный сигнал дигонального углеродного атома в слабом поле (5с
173.6 м.д.) с константой спин-спинового взаимодействия 2Jcp 7.5 Гц. Альдоуглерод представлен сигналом в сильном поле (5с 40.2 м.д.) с константой спин-спинового взаимодействия 1Jcp 214.7 Гц, что согласуется с литературными данными [15, 16]. Химический сдвиг фосфора 5р соединения 1 составлял 25.7 м.д., что соответствует обычной области резонанса ядер 31Р у sp2-гибридизированного углеродного атома [15, 16].
В ИК-спектрах соединения 1 кроме полос поглощения, присущих пимарицину [23], обнаружены полосы поглощения в области 1232 см-1, характерные для фосфо-рильной группы Р=О. Кетениминовой группировке соответствует интенсивная полоса поглощения в области 2050 см-1. В электронных спектрах поглощения производного пимарицина 1 зафиксированы удельные показатели поглощения (Е1%1см) 712, 1105, 1020 при длинах волн 290, 303 и 318 нм соответственно, характерные для тетраено-вой сопряженной системы [23].
В связи с тем, что тетраеновый полиеновый антибиотик пимарицин, находит широкое применение для лечения многих клинических форм кандидоза [3-6], биологические испытания фосфорилированного альдокетениминового производного пимарицина 1 были проведены отношении 6 тест-культур дрожжеподобных грибов рода Candida. Так, биологическими исследованиями обнаружено, что соединение 1 обладало высокой антифунгальной активностью в отношении 6 тест-культур рода Candida, причем его противогрибковое действие в отношении Candida albicans и Candida utilis было на уровне пимарицина, в отношении Candida tropicalis и Candida krusei полученное производное 1 уступало пимарицину, а в отношении Candida parapsilosis и Candida guillermondii его антифун-гальная активность превышала исходный антибиотик (таблица). Дополнительными биологическими испытаниями выявлена выраженная антифунгальная активность соединения 1 в отношении различных клинических штаммов дрожжеподобных грибов рода Candida: Candida
albicans ATCC 90028, 58455, 89211, Candida tropicalis ATCC 20336, 58689, 59445, Candida krusei ATCC 5684102, Candida parapsilosis ATCC 22019, причем МфсК составляла от 3.12 до 12.5 мкг/мл (таблица).
Таблица. Минимальная фунгистатическая концентрация (МфсК) фосфорилированного альдокетениминового производного ___________________________________ пимарицина 1 (мкг/мл)
Тест-культура / штамм Соединение
1 пимарицин
Candida aibicans 1,56 1,56
Candida utilis 1,56 1,56
Candida tropicalis 6,25 3,12
Candida krusei 12,5 6,25
Candida parapsilosis 3,12 6,25
Candida quillermondii 3,12 6,25
Candida aibicans ATCC 90028 1,56 1,56
Candida albicans ATCC 58455 3,12 1,56
Candida aibicans ATCC 89211 1,56 3,12
Candida tropicalis ATCC 20336 3,12 3,12
Candida tropicalis ATCC 58689 6,25 6,25
Candida tropicalis ATCC 59445 6,25 3,12
Candida krusei ATCC 5684102 12,5 6,25
Candida parapsilosis ATCC 22019 3,12 6,25
Известно, что растворимость в воде пимарицина является низкой и составляет 30-50 мг/л [23-25], что существенно снижает его лекарственный эффект при лечении кандидозов различной этиологии. Нами показано, что растворимость в воде и водных растворах фосфорилиро-ванного альдокетениминового производного пимарицина 1 составляет 75-100 мг/л. Повышение растворимости полученного производного пимарицина 1 в 2-2,5 раза связано с введением фосфорильной группы, что согласуется с аналогичными результатами гидрофосфорильных произ-
водных этого тетраенового макролидного антибиотика, полученных нами ранее [13]. Известно, что большая растворимость ПМА в воде существенно увеличивает их терапевтическую эффективность и способствует в целом проявлению более приемлемых биофармацевтических свойств полусинтетических производных этих антифун-гальных антибиотиков [2, 7, 8].
Выводы
Таким образом, дальнейший поиск фосфорили-рованных альдокетениминовых производных пимарицина является перспективным направлением его химической модификации с целью получения антимикотиков с выраженным антифунгальным действием против возбудителей кандидоза.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 20092013 годы по теме "Создание новых полусинтетических производных и модификация существующих полиеновых макролидных антибиотиков с целью получения высокоэффективных противогрибковых лекарственных препаратов" (государственный контракт № 2012-1.5-12-000-1013005).
Литература
1. Успехи медицинской микологии. / Под ред. Ю.В. Сергеева // Материалы III Всероссийского конгресса по медицинской микологии. Москва: Национальная академия микологии. 2005. 336 с.
2. Antifungal Agents: Advances and Problems, Special Topic: Progress in Drug Research. // Е Jucker (Ed.). Basel: Birkhaeuser Verlag. 2003. 248 р.
3. Козлов СН, СтрачунскийЛ.С. Современная антимикробная химиотерапия. Москва: ООО "Медицинское информационное агентство". 2009. С. 19-23.
4. Климко Н.Н, Веселов А.В. Новые препараты для лечения инвазивных микозов // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2003. Т. 5. № 4. С. 342-353.
5. Климко Н.Н, Колбин А.С. Перспективы использования новых системных противогрибковых препаратов в педиатрии // Проблемы медицинской микологии. 2005. Т. 7. № 3. С. 3-11.
6. Веселов А.В. Системные антимикотики: состояние и перспективы // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2007. Т. 9. № 1. C. 73-80.
7. Шенин Ю.Д, Белахов В.В, Аравийский Р.А. Нистатин: методы получения, поиск производных и перспективы медицинского применения // Химико-фармацевтический журнал. 1993. Т. 27. № 2. С. 14-21.
8. Шенин Ю.Д, Белахов В.В. Амфотерицин В: свойства, химическое строение, поиск производных // Антибиотики и химиотерапия. 1997. Т. 42. № 4. C. 34-46.
9. Соловьева С.Е, Олсуфьева Е.Н, Преображенская М.Н. Химическое модифицирование противогрибковых макролидных полиеновых антибиотиков // Успехи химии. 2011. Т. 80. № 2. C. 115-138.
10. Omura S, Tanaka H. Production, Structure, and Antifungal Activity of Polyene Macrolides // In Book: Macrolide Antibiotics: Chemistry, Biology and Practice. / S. Omura (Ed.). New York: Academic Press. 1984. P. 351-404.
11. Шенин Ю.Д, Белахов В.В. Химия полиеновых макролидных антибиотиков. // Обзорная информация. Cерия "Лекарственные средства, экономика, технология и перспективы получения". Москва: ВНИИСЭНТИ. 1989. Вып. 6. 44 С.
12. Zotchev S.B. Polyene Macrolide Antibiotics and Their Application in Human Therapy // Current Medicinal Chemistry. 2003. Vol. 10. No. 3. P. 211-223.
13. Belakhov VV, Shenin Yu.D, Ionin B.I. // Synthesis of Hydrophosphoryl Derivatives of the Antifungal Antibiotic Pimaricin by the Kabachnik-Fields Reaction. // Russian Journal of General Chemistry. 2008. Vol. 78. № 2. P. 305-312.
14. Белахов В.В, Шенин Ю.Д, Ионин Б.И. Синтез и противогрибковая активность N-арилзамещенных производных пимарицина // Химико-фармацевтический журнал. 2010. Т. 44. № 9. С. 19-25.
15. Петров А.А, Догадина А.В, Ионин Б.И. [и др.] Арбузовская перегруппировка с участием галогенацетиленов - путь синтеза ацетиленовых фосфонатов и других фосфо-рорганических соединений // Успехи химии. 1983. Т. 52. №
11. С. 1793-1802.
16. Леонов А.А, Догадина А.В, Ионин Б.И, Петров А.А. Фосфорилированные альдокетенимины, синтез и свойства // Журн. общей химии. 1985. Т. 55. № 1. С. 32-39.
17. Armarego W.L.F, Chai C.L.L. Purification of Laboratory Chemicals. Oxford: Butterworth- Heinemann Press. 2012. 1024 р.
18. Tidwell T.T. Ketene Chemistry After 100 Years. Ready for a New Century // European Journal of Organic Chemistry. 2006. No. 3. P. 563-576.
19. Perst H. Products Class 17: Ketenimines // Science of Synthesis. 2006. Vol. 23. P. 781-898.
20. Alajarin M, Marin-Luna M, Vidal A. // European Journal of Organic Chemistry. 2012. No. 29. P. 5637-5653.
21. Lu P., Wang Ya. The Thriving Chemistry of Ketenimines // Chemical Society Reviews. 2012. Vol. 41. No. 17. P. 5687-5705.
22. Белахов В.В, Шенин Ю.Д. Синтез и противогрибковая активность N-триалкилсилильных производных нистатина // Химико-фармацевтический журнал. 2008. Т. 42. № 6. С. 15-18.
23. Brik H. Natamycin. // In Book: Analytical Profiles of Drug Substances. New York: Academic Press, Inc. 1981. Vol. 10. P. 513-561.
24. Schaffner CP, Mechlinski W Polyene Macrolide Derivatives. II. Physical-Chemical Properties of Polyene Macrolide Esters and Their Water Soluble Salts // Journal of Antibiotics. 1972. Vol. 25. No. 4. P. 259-260.
25. Koontz J.L, Marcy J.E. Formation of Natamy-cin:Cyclodextrin Inclusion Complexes and Their Characterization // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2003. Vol. 51. No. 24. P. 7106-7110
