Синтез и биологические свойства 2,3,16,17,18,19-гексагидроолигомицина а Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

Macrolides Макролиды

Макрогэтэроцмклы

http://macroheterocycles.isuct.ru

Paper Статья

DOI: 10.6060/mhc160964o

Синтез и биологические свойства 2,3,16,17,18,19-гексагидроолигомицина А

О. А. Омельчук,аЬ@1 Н. М. Белов,а В. Б. Цветков,сДе Н. Э. Грамматикова,^ Л. Н. Лысенкова,а А. М. Королев,а О. Б. Беккер,9 В. Н. Даниленко,9 А. Е. ЩекотихинаЬ@2

Институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе, 119021 Москва, Российская Федерация ьРоссийский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, 125047 Москва, Российская Федерация Институт нефтехимического синтеза им. А.В.Топчиева РАН, 119991 Москва, Российская Федерация &Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины ФМБА России, 119435 Москва, Российская Федерация

6Научно-исследовательский институт гриппа Министерства здравоохранения Российской Федерации, 197376 Санкт-Петербург, Российская Федерация

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, 119991 Москва, Российская Федерация

8Институт общей генетики Российской академии наук им. Н.И. Вавилова, 119333 Москва, Российская Федерация @1Е-таИ: omelchuk.93@mail.ru @2Е-таИ: shchekotikhin@mail.ru

В статье описан синтез производного олигомицина А (1) - 2,3,16,17,18,19-гексагидроолигомицина А (3), а также его физико-химические, спектральные и биологические свойства. Гидрирование на Pd/C олигомицина А (1) в мягких условиях приводит к продукту восстановления трех двойных С=С связей. Структура пергидроолигомицина (3) доказана методами ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения. Исследованы противогрибковые, антиактиномикозные и антипролиферативные свойства нового антибиотика 3. Выявлена селективная активность пергидроолигомицина (3) в отношении ряда штаммов грибов рода Candida, тогда как активность для других тест-культур была в 3-20 раз ниже активности исходного олигомицина А. Методами компьютерного моделирования проведено сравнительное исследование комплексообразования при взаимодействии антибиотиков с мишенью - F0-субъединицей АТФ-синтазы, результаты которого согласуются с результатами биологического скрининга.

Ключевые слова: Гексагидроолигомицин А, олигомицин А, полусинтетический антибиотик, макролидный антибиотик, противогрибковая активность, антиактиномикозная активность, антипролиферативная активность, ингибитор АТФ-синтазы.

Synthesis and Biological Activity of 2,3,16,17,18,19-Hexahydrooligomycin A

Olga A. Omelchuk,a'b@1 Nikita M. Belov,a Vladimir B. Tsvetkov,cde Natalia E. Grammatikova,af Lyudmila N. Lysenkova,a Alexander M. Korolev,a Olga B. Bekker,g Valery N. Danilenko,g and Andrey E. Shchekotikhinab@2

Gause Institute of New Antibiotics, 119021 Moscow, Russian Federation

bD. I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, 125047 Moscow, Russian Federation

cTopchiev Institute of Petrochemical Synthesis, Russian Academy of Sciences, 119991 Moscow, Russian Federation

dInstitute for Physical-Chemical Medicine, 119435 Moscow, Russian Federation

eResearch Institute of Influenza, 197376 St.-Petersburg, Russian Federation

fI.M. Sechenov First Moscow State Medical University, 119991 Moscow, Russian Federation

gN.I. Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences, 119333 Moscow, Russian Federation ®lCorresponding author E-mail: omelchuk.93@mail.ru @2Corresponding author E-mail: shchekotikhin@mail.ru

Oligomycin A (I) belongs to the class of highly substituted macrolide antibiotics produced by actinomycetes Strepto-myces.[1] Oligomycin A (I) has antifungal and cytotoxic activities but Gram-negative and Gram-positive bacteria are resistant to I except actinobacteriaP]At micromolar concentrations I inhibitedFgF1-ATPase by binding with subunit Fg and blocking OSCP (oligomycin sensitivity conferring protein).131 Previously a series of modifications at the side chain and chemical transformation of the lactone moiety of I have been developed.14'81 However, all derivatives mod-ificated at the lactone moiety were less potent than I.[7,81Recently a new derivative, 2,3-dihydrooligomycin A (2), has been obtained by a microbiological method. This compound showed a higher activity against Saccharomyces cerevi-siae than I.[9] We investigated chemical reduction of double C-C bonds of I. Hydrogenation of I on Pd/BaSO 4 gives an unseparatable mixture ofproducts. Using Pd/C in the reduction of I in methanol led to 2,3,16,17,18,19-hexahydrooli-gomycin A (3) in a good yield. The structure of 3 was confirmed by NMR-spectroscopy and high resolution mass spectrometry. Investigations of antifungal and anti-yeast properties were evaluated against Candida spp. (clinical isolates and reference strains) and filamentous fungi. Hexahydrooligomycin (3) showed a high selective activity against C. parapsilosis, C. utilis, C. tropicalis, and C. krusei and was inefficient against micromycetes. Notably, the C. krusei strain is resistant to fluconazole. The actinomyces S. fradiae ATCC-19069 exceptionally sensitive to I (MIC 0.5 nmol/ ml) was resistant to 3. Hexahydrooligomycin 3 was also less toxic than I against human K562 leukemia and HCT116 colon carcinoma cell lines. Thus, reduction of three double C=C bonds increases selectivity to Candida spp. with simultaneous decrease ofpotency against other test-cultures. A computer assisted simulation of interaction of I and 3 with the intracellular target (F-subunit of the ATP-synthase) was performed using Molsoft ICM-Pro 3.8. The results of docking studies were in a good agreement with bioscreening data. Further development of methods of modification of I is needed for detailed understanding of SAR and drug optimization.

Keywords: Hexahydrooligomycin A, oligomycin A, semisynthetic antibiotics, macrolide antibiotics, antifungal activity, antiactinomycotic activity, antiproliferative activity, ATP synthase inhibitor.

Введение

Макролидный антибиотик олигомицин А (1) (Рисунок 1), продуцируемый актиномицетами рода Streptomyces,[1 проявляет противогрибковое и цитоток-сическое действие, однако высокая антибактериальная активность выражена только в отношении стрептоми-цетов.[2]

В субмикромолярных концентрациях олигомицин А (1) ингибирует F^-АТФ-синтазу, нарушая процесс окислительного фосфорилирования и энергетический обмен в клетках про- и эукариот. Связываясь с F0 субъединицей АТФазы, олигомицин А (1) блокирует работу OSCP (the oligomycin sensitivity conferring protein), что нарушает синтез АТФ. [3]

Ранее нами был разработан ряд эффективных методов химической трансформации олигомицина А (1) как по боковой цепи (положение 33), так и по макро-лактонному кольцу.[4-8] Установлено, что изменение структуры макролактона значительно снижает активность антибиотика.[7,8] Однако недавние исследования биологических свойств 2,3-дигидроолигомицина А (2) (Рисунок 1), полученного микробиологическим путем, показали, что восстановление двойной 2С-3С связи приводит к повышению активности в отношении дрожжей S. cerevisiae.[9] Нами впервые исследованы возможности химического восстановления антибиотика 1 по кратным связям углерод-углерод.

В работе получен и охарактеризован ранее не описанный 2,3,16,17,18,19-гексагидроолигомицин А (3).

снз 1 R-R:CH=CH; 2 R-R:CH2-CH2.

Рисунок 1. Структуры олигомицина А (1) и 2,3-дигидроолигомицина (2).

Скрининг биологических свойств нового антибиотика 3 выявил его избирательную активность против ряда штаммов дрожжевых грибов Candida spp.

Эксперимент

Химическая часть

Олигомицин А (чистота 95 %), продуцируемый штаммом Streptomyces avermitilis NIC B62, получен в автономном некоммерческом исследовательском центре БИОАН (Москва,

Российская Федерация). Катализатор и растворители производства Sigma-Aldrich.

Для аналитической ТСХ использовались алюминиевые пластинки с закрепленным слоем силикагеля F254 толщиной 0.2 мм (Мегск); для колоночной хроматографии использовался силикагель 60 (Мегск). Соединения обнаруживали в УФ-свете (254 нм), проявляли реактивом, содержащим 4.5 % (об.) анисового альдегида, 3.0 % (об.) концентрированной серной кислоты, 1.5 % (об.) ледяной уксусной кислоты в EtOH.

Аналитическую ВЭЖХ выполняли с использованием хроматографа Shimadzu LC-20 AD (Shimadzu Corporation) на колонке Kromasil-100-C18 размером (4x250 мм, 5 мкм) (Knauer, Германия). Объем петли инжектора 20 мкл. Детектирование осуществляли при длине волны 210 нм. Элюирование проводили в течение 40 мин системой MeCN-H20: 10 мин -градиентный режим (содержание MeCN 80 — 95 %), 30 мин -изократический режим (содержание MeCN - 95 %), скорость потока - 1 мл/мин.

Спектры ЯМР (Рисунки Д1-Д9, см. Дополнительные материалы) регистрировались на спектрометре «Avance III» фирмы «Bruker» с резонансной частотой на ядрах Щ и 13C 600 и 150 MHz, соответственно. В качестве растворителя использовали дейтерированный метанол фирмы «Merck». Химические сдвиги ядер измеряли при 25 °С, используя в качестве внутреннего стандарта сигнал остаточного метанола (3.31 м.д. для 1H и 49.2 м.д. для 13С).

Масс-спектры высокого разрешения ESI (Рисунки Д10-Д13) регистрировали на приборе «micrOTOF-Q II» («Bruker Daltonics GmbH», Германия). Растворы образцов (0.1 мг/мл в смеси CHCl3 и EtOH) прямо вводили в ECI- источник с помощью шприцевого насоса со скоростью потока 3 мкл/мин и анализировали положительно и отрицательно заряженные ионы при следующих условиях детектирования: напряжение на капилляре 4 кВ, давление азота в небулайзере 0.4 Бар (5.8 psi), скорость потока осушающего газа 4.0 л/мин и температура источника 180 °C. Для измерений использовали растворители с содержанием более 98 %, предназначенные для LC-MS. Фрагментацию пергидроолигомицина (3) проводили методом тандемной масс-спектрометрии в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) при энергии соударений исходной молекулы с молекулами азота 20-90 эВ в ячейке с диссоциацией, индуцируемой соударением (CID).

ИК-спектр (Рисунок Д14) регистрировали с использованием ИК-Фурье спектрометра Nicolet-iS10 (детектор DTGS, светоделитель KBr) с приставкой Smart Performer, оснащенной ZnSe кристаллом (Nicolet, Madison, WI, USA). Измерение проводили при разрешении 4 см-1; зона спектра 4000-650 см-1. Спектр обрабатывали с использованием программы 0MNIC-7.0. УФ-спектр (Рисунок Д15) регистрировали на спектрометре Hitachi-U2000. Оптическое вращение измеряли на поляриметре AA55 Polarimeter, Optical Activity Ltd (Великобритания).

Синтез 2,3,16,17,18,19-гексагидроолигомицина (3). К раствору 60.0 мг (0.075 ммоль) олигомицина А (1) в 4.0 мл метанола добавляют 48.0 мг (0.0225 ммоль) 5% Pd/C и гидрируют при избыточном давлении водорода (0.4 атм) при комнатной температуре 1 ч. Реакционную смесь фильтруют, промывают катализатор метанолом и концентрируют в вакууме. Остаток очищают колоночной хроматографией (гексан:ацетон 10:3 — 10:4, хлороформ:метанол 10:0.2 — 10:0.3). Выход 42.0 мг (69 %). Аморфный порошок белого цвета. Т. пл. 83 °С. Найдено: m/z ESI 797.5593 (100 %) [M+H]+. C45H80O11. Вычислено 796.5701. ИК (пленка) vmax см-1: 3416 с, 2971 ср, 2928 ср, 2857 ср, 1731 сл, 1698 с, 1458 ("71382 ср, 1340 сл, 1264 сл, 1222 сл, 1191 сл, 1169 сл, 1135 сл, 1089 ср, 1048 ср, 982 с, 882 ср, 844 сл, 802 сл. УФ (метанол) Xmax (lge) нм: 207(3.7), 268 (2.8). ЯМР, HRMS, ИК и УФ спектры пергидроолигомицина 3 приведены на Рисунках Д1-Д15 (дополнительные материалы). [a]20D (c 0.1, метанол) -80°. ВЭЖХ: R=23.2, чистота 95.2 %.

Биологическая часть

Методика определения антифунгальной активности

Оценку активности исследуемых образцов проводили в соответствии со стандартом1101 и рекомендациями.111121 Для определения значения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) использовали микрометод серийных разведений в среде RPMI 1640 (с глутамином, производства ПанЭко) с добавлением глюкозы в готовую среду до концентрации 0.2%.

Анализ осуществляли в отношении контрольных штаммов дрожжевых культур C. albicans АТСС 24433, C. parapsilosis ATCC 22019, клинических изолятов Candida spp. и филаментозных грибов A. niger 137a, дерматофитов M. canis B-200, T. rubrum 2002.

Для получения основных растворов изучаемых образцов 1 и 3 с концентрацией 10 000 мкг/мл навески растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО). Для получения рабочих растворов с концентрацией 64 мкг/мл основные растворы в количестве 0.064 мл переносили в 9.93 мл питательного бульона RPMI 1640 с глюкозой 0.2 %, конечная концентрация ДМСО не превышала 0.3 %.

Тест-микроорганизмы сохраняли в условиях низкой температуры (-75 °С) в триптиказо-соевом бульоне с добавлением 10-15 % глицерина.

Для получения посевного материала, штаммы выращивали на агаризованной среде Сабуро (ГРМ 2 ВФС 423068-98, Биохолд, Россия) при 35 °С Candida spp. в течение 48 ч, филаментозные грибы около 2 недель.

Посевную суспензию Candida spp. приготавливали в среде RPMI c 0.2 % глюкозой по стандарту мутности 0.5 McFarland (~5 106 КОЕ/мл для дрожжевых культур), оценивали денситометрически (Densimat, Biomerieux), разводили 1:1000 до ~5103 КОЕ/мл в среде RPMI c 0.2 % глюкозой. Для каждого тест-штамма филаментозных грибов инокулят получали растиранием части колонии в физиологическом растворе в пробирке со стеклянными бусами. Сбор конидий и спор производили пипеткой через марлевый фильтр. Подсчет конидий и спор осуществляли с использованием камеры Горяева. Каждый инокулят доводили до рабочего титра в среде RPMI. В результате получали суспензию, содержащую 1.5-3.2-104 КОЕ/мл. Для контроля титра жизнеспособных колониеобразующих единиц (КОЕ), 10 мкл инокулята переносили на агаризованную питательную среду Сабуро.

В работе использовали 96 луночные планшеты для иммунологических исследований (Медполимер, С-Петербург). В лунки планшета вносили 100 мкл суспензии дрожжевых культур в питательной среде и образцы в диапазоне концентраций 32-0.25 мкг/мл. Каждый образец анализировали в трех повторениях.

Для соблюдения точности процедуры определения значений минимальной ингибирующей концентрации (МИК) в качестве внутреннего стандарта использовали флуконазол (Синерджин Эктив Инградиентс (Пи) ЛТД), диапазон активности которого в отношении эталонного штамма Candida parapsilosis ATCC 22019 составляет 1-4 мкг/мл.[10] Для контроля роста все тест-культуры засевали в питательную среду без образцов.

Оценку чувствительности проводили визуально, после инкубации при 35 °С в течение 24 и 48 ч для Candida spp. и 48-96 ч для A. niger, M. canis B, T. rubrum, сравнивая с плотностью роста в контроле без препарата. За МИК принимали наименьшую концентрацию образца, при которой видимый рост подавлен не менее чем на 80 % в сравнении с контролем роста.

Методика определения антибактериальной активности

Анализ осуществляли в отношении актинобактерии S. fradiae ATCC-19069. Чашки с агаризованной (2 % агара) средой

МГ,[13] содержащие различные концентрации олигомицина А (l) или его производного З, засевали споровой суспензией 105 КОЕ, смешанной с полужидким агаром (0.8 %) МГ, содержащим те же концентрации веществ. После застывания верхнего слоя чашки выдерживали 3 суток в термостате при 28 °С. Фиксировали результат. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) (нмоль/мл) была определена как концентрация вещества, при которой на чашках отсутствует газонный рост.

Методика определения антипролиферативной активности

Цитотоксичность определяли в МТТ-тесте в отношении клеток хронической миелоидной лейкемии человека К-562 и аденокарциномы кишечника HCT-116. Готовился 10 мМ раствор тестируемых соединений l и З в ДМСО, затем осуществлялась серия разведений водой непосредственно перед экспериментом. Клетки (5103 в 190 мл культуральной жидкости) сеяли в 96-луночный планшет (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) и добавляли 0.1 % ДМСО (контрольная лунка) или растворы тестируемых соединений с возрастающей концентрацией, затем культивировали 72 ч. Для каждой концентрации эксперименты были выполнены в трех повторностях. По окончании воздействия соединений в каждую лунку добавляли 50 мкг бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия и дополнительно инкубировали планшет 2 ч. Формазан растворяли в ДМСО, и измеряли поглощение при 540 нм. Цитотоксичность при каждой концентрации тестируемых соединений определялась как процентное отношение величины поглощения в лунке с тестируемым соединением к величине поглощения в контрольной лунке (100 %). Величина полуингибирующей концентрации (IC50) была определена как концентрация соединения, при которой конверсия МТТ ингибируется на 50 %.

Молекулярный докинг

Координаты для 3D моделей мишени были взяты из PDB: 4f4s. 3D-модели лигандов и мишени были построены с использованием Molsoft ICM-Pro версии 3.8-3.[14] При построении 3D модели мишени были проведены следующие процедуры: добавлены атомы водорода и отсутствующие тяжелые атомы в боковых группах аминокислот, назначены типы атомов и заряды из силового поля ECEPP/3[15] для мишени и из силового поля MMFF (Merck Molecular Force Field)[16] для лигандов, была произведена оценка заряженных состояний всех His, Asp, Glu, Arg, Lys и Cys, входящих в состав мишени, с учетом рН 7.0, трансформация декартовых координат во внутренние и ММ оптимизация с помощью метода сопряженных градиентов для устранения возможно имеющегося сильного Ван-дер-Ваальсового отталкивания атомов. Для определения наиболее вероятного сайта связывания на поверхностях мишеней и оценки энергии связывания использовали процедуру докинга с применением вышеуказанной программы. Процедура докинга была осуществлена в два этапа. Вначале был реализован докинг с «жёсткой» мишенью, в течение которого при поиске возможных положений лиганда учитывалась только конформационная, позиционная и вращательная подвижность лиганда, а геометрия мишени оставалась неизменной. Затем геометрия комплексов, полученных на первом этапе, была оптимизирована с применением BPMC процедуры. На этом этапе оптимизации подвергались как конформации лиганда, так и конформации боковых групп аминокислот, расположенных в области с радиусом 4 Â. Описание BPMC процедуры и оценки энергии связывания описано ранее.[17] Финальный конформационный стэк, полученный на второй стадии, был отсортирован по значению оценки энергии связывания. Свободная энергия комплексообразования рассчитывалась как сумма энергии комплексообразования в вакууме и разница

между энергией сольватации комплекса и суммой энергией сольватации несвязанных мишени и лиганда АВоЫу, по формуле:

AGbind AGeq AGVdW AGhbond AU

TAS + AG

Энергия комплексообразования в вакууме оценивалась как сумма изменения электростатической AGeq и Ван-дер-Ваальсовой AGvdW составляющих, энергии формирования водородных связей AGhw, энергии напряжений связей, валентных и двугранных углов AU, изменения энтропии за счёт потери конформационной подвижности как мишени, так и лиганда TAS. Энергия сольватации оценивалась по методу Вессона-Айзенберга.[18]

Обсуждение результатов

Олигомицин А (1) содержит в своей структуре диеновую систему (16-19 положения) и а^-ненасыщенную связь лактона (2,3 положения), способных к восстановлению. Микробиологический способ, предложенный корейскими исследователями,191 позволяет селективно восстановить акриловую 2С-3С связь, не затрагивая сопряженную систему в положениях 16-19. Нами исследованы возможности каталитических методов восстановления олигомицина А. Подобрать условия для избирательного восстановления одной или двух С=С связей олигомицина А (1) нам не удалось. Гидрирование антибиотика 1 на катализаторе Роземунда (Pd/BaSO4, 5 %) как в протонных растворителях (метанол, этанол), так и в неполярных (толуол, циклогексан) дает смесь продуктов. Выделение и очистка индивидуальных соединений из полученной смеси затруднены их близкой хроматографической подвижностью. В условиях катализа на Pd/C (5 %) гидрирование протекает более активно, но неселективно и затрагивает как сопряженные связи в 16-19 положениях, так и а^-ненасыщенную связь лактона в положениях 2, 3. Так, гидрирование в мягких условиях олигомицина А (1) на Pd/C в метаноле дает 2,3,16,17,18,19-гексагидро-олигомицин (3) с хорошим выходом (Схема 1). Следует отметить, что при контроле протекания реакции методом тонкослойной хроматографии (элюент гексан:ацетон 1.7:1) при неполной конверсии олигомицина А (1) пробы реакционной смеси содержали только исходное соединение 1 (Rf=0.43) и продукт реакции 3 (Rf=0.48), а образование промежуточных продуктов гидрирования практически не наблюдалось.

Строение пергидроолигомицина (3) доказано данными 'H и 13C спектров ядерного магнитного резонанса, методами масс-спектрометрии высокого разрешения (HRMS ESI).

Масс-спектр высокого разрешения содержал пик, соответствующий молекулярному иону лактона 3 -797.5593 [M+H]+. Структура 2,3,16,17,18,19-гексаги-дроолигомицина А (3) подтверждена тандемной масс-спектрометрией (MC / MC, CID) при низкой энергии ква-друполя (20-90 эВ). При энергии соударений 20-35 эВ в масс-спектрах 3 преобладал ион m/z 451, образующийся при раскрытии лактона и ретроальдольного расщепления по положению 13. Дальнейшая фрагментация приводит к элиминированию молекулы воды в положении 33. Так, в спектрах наблюдался преимущественно ион m/z 433, а также ион m/z 391, соответствующий второй половине

39 37

H3C НзС, .OH CH3 CH3 CH3

HoC

H2 Pd/C MeOH * 6.0 psi, rt

39 37

H3C НзС, .OH CH3 CH3 CH3

H,C

3 (69 %)

Схема 1. Синтез 2,3,16,17,18,19-гексагидроолигомицина А (3).

молекулы. Возможные структуры фрагментации иона 3 (m/z 797.6) изображены на Схеме 2. Следует отметить, что гидрирование кратных связей повышает лабильность цикла в условиях тандемной масс-спектрометрии. Так, заметная фрагментация макроцикла пергидропро-изводного 3 наблюдается при энергии соударений 20 эВ, в то время как деструкция аналогов, содержащих присущие олигомицину три двойные связи, происходит лишь при энергии соударений 70 эВ.[6]

Для пергидроолигомицина (3) зарегистрированы спектры ЯМР 'H и 13C, а также корреляционные спектры ЯМР 1H-1H COSY, 1H-1H ROESY, 1H-13C HSQC, 1H-13C HMBC. Спектр ЯМР 13С соединения 3 содержит 45 сигналов, из которых 11 соответствуют CH3-группам,

13 - СН2-группам, 16 - CH-группам (на основании анализа спектра 1H-13C HSQC), 2 - группам С=0, 1 - группе O-C=O, 1 - группе O-C-O, 1 - группе C-O (на основании анализа спектра 1Н-13С HSQC, 1Н-13С HMBC). В спектре ЯМР 13С пергидроолигомицина А (3) отсутствуют сигналы олефиновых ядер 1H и 13С, что подтверждает восстановление всех связей С=С исходного олигомицина А (1). Отнесение химических сдвигов на основании анализа спектров 1H-1H COSY, 1H-1H ROESY, 1H-13C HSQC, 1H-13C HMBC, приведены в Таблице 1.

Для нового производного олигомицина 3 проведено исследование противогрибковых, антиактиномикозных и антипролиферативных свойств в сравнении с исходным

m/z 432.3603

Схема 2. Фрагментация соединения 3 методом тандемной масс-спектрометрии при энергии соударении 20-35 эВ. Макрогетероциклы /Macroheterocycles 2016 9(4) 453-461

Таблица 1. Спектры Щ и 13C ЯМР пергидроолигомицина А (3) и олигомицина А (1).

Олигомицин А (1) Пергидроолигомицин (3)

низ. Тип dc, PPm SH, ppm, мульт. (J в Hz) Тип S^ PPm SH, ppm, мульт. (J в Hz)

1 O=CO 165.0 — O=CO 175.1 -

2 3 CH CH 122.6 148.3 5.80, дд (15.6, 0.7) 6.62, дд (15.6, 10.1) CH2 CH2 33.1 30.1 2.46, ддд (15.7, 6.6, 0.8); 2.37, ддд (15.7, 6.6, 0.8) 1.78, м; 1.49, м

4 CH 40.1 2.36, ткв (10.0, 6.6) CH 36.5 1.53, м

5 CH 72.9 3.75, дд (10.1, 1.3) CH 75.9 3.65, ткв (6.3, 4.7)

6 CH 46.4 2.70, дкв (1.3, 7.4) CH 48.3 3.02, дкв (6.9, 6.7)

7 C=O 220.2 - C=O 218.4 -

8 CH 41.9 3.59, дкв (8.6, 6.9) CH 49.9 2.71, дкв (4.0, 7.1)

9 CH 72.6 3.94, дд (8.6, 3.1) CH 72.9 4.16, дд (7.4, 4.0)

10 CH 45.6 2.74, дкв (3.0, 7.1) CH 44.1 3.51, дкв (7.1, 6.9)

11 C=O 219.9 - C=O 221.5 -

12 C-O 82.9 - C-O 84.5 -

13 CH 72.2 3.89,д(1.9) CH 75.8 3.90, д (2.0)

14 CH 33.4 1.88, м CH 34.8 1.77, м

15 CH2 38.3 2.17, бд; 1.98 дт CH2 28.9 1.43, м; 1.23, м

16 17 18 CH CH CH 129.3 132.3 130.2 5.42, ддд (14«д5дд4Л) (14.7, 10.4, 1.4) 5.90, дд (14.9, 10.5) C C C 2 2 2 27.0 27.1 27.6 1.43, м; 1.30, м 1.43, м; 1.30, м 1.43, м; 1.30, м

19 CH 137.7 5.21, дд (14.8, 9.6) CH2 29.2 1.43, м; 1.30, м

20 CH 45.9 1.85, м CH 40.0 1.32, м

21 CH2 31.4 1.52, м; 1.35, м CH2 36.2 1.44, м; 1.23, м

22 CH2 30.9 1.59, ддд CH2 30.5 1.43, м; 1.23, м

23 24 CH CH 68.9 35.7 3.78, ддд (9.8, 2.7, 2.4) 2.11, ддкв (5.0, 2.2, 6.9) CH CH 70.6 36.7 3.85, ддд (5.9, 0.9, 2.0) 2.11, ддкв (2.0, 0.9, 7.2)

25 CH 76.1 4.91, дд (11.4, 5.0) CH 77.7 4.99, дкв (11.8, 4.5)

26 CH 37.6 1.78, дкв (11.4, 6.6) CH 39.3 1.78, м

27 OCO 99.1 - OCO 100.6 -

28 CH2 25.9 1.90, м; 1.23, м CH2 27.5 1.93, м; 1.23,м

29 CH2 26.4 2.07, м; 1.38, м CH2 27.8 2.16, м; 1.41, м

30 CH 30.4 1.54, м CH 31.8 1.56, м

31 CH 67.1 3.96, дт (10.3, 2.5) CH 68.8 4.03, дт (10.1, 2.8)

32 CH2 42.4 1.55, м; 1.25 м CH2 43.7 1.54, м; 1.31, м

33 CH 64.6 4.00, ддкв (9.2, 3.1, 6.2) CH 65.4 3.93, ддкв(9.3, 3.7, 6.2)

34 CH3 24.6 1.21, д (6.2) CH3 25.1 1.19, д (6.2)

35 CH3 17.8 1.16, д (6.6) CH3 13.3 0.94, д (6.6)

36 CH3 8.2 1.05, д (7.3) CH3 11.0 1.13, д (6.9)

37 CH3 14.0 1.09, д (6.9) CH3 14.2 1.14, д (7.1)

38 CH3 9.2 1.01, д (7.0) CH3 14.4 1.14,д(6.9)

39 CH3 20.9 1.11, с CH3 22.4 1.21, с

40 CH3 14.4 0.98, д (6.6) CH3 14.8 0.97, д (6.9)

41 CH2 28.4 1.35, м; 1.25, м CH2 32.6 1.29, м

42 CH3 12.0 0.80, т (7.4) CH3 12.3 0.89, т (7.1)

43 CH3 6.0 0.82,д(6.9) CH3 6.4 0.91, д (7.2)

44 CH3 11.7 0.95, д (6.6) CH3 11.9 0.93,д(6.9)

45 CH3 11.1 0.88,д(6.9) CH3 12.1 0.94, д (6.9)

O. A. Omelchuk, A. E. Shchekotikhin, et al. Таблица 2. Активность олигомицина А (1) и пергидроолигомицина (3) в отношении Candida spp. и филаментозных грибов.

МИК, мкг/мл

Производное C.albicans ATCC 24433 C. parapsilosis ATCC 22019 A. niger 137a M. canis B 200 T. rubrum 2002

Пергидроолигомицин (3) 16 1 32 >32 >32

Олигомицин А (1) 2-4 1-2 0.5 2-4 2-4

Флуконазол 4 4 32 >32 >32

Таблица 3. Активность олигомицина А (1) и пергидроолигомицина (3) в отношении клинических изолятов Candida spp.

МИК, мкг/мл

Производное C. utilis 84 C. tropicalis 3019 C. krusei 432M C. glabrata 61L C. albicans 604M (R) C. albicans 80 (R)

Пергидроолигомицин (3) 1-2 2 4-8 >32 >32 >32

Олигомицин А (1) 1 1 2 >32 32 16-32

Флуконазол 2 2 >32 32 >32 >32

олигомицином 1. Антифунгальная активность изучена в отношении контрольных штаммов дрожжевых культур Candida albicans АТСС 24433, C. parapsilosis ATCC 22019, филаментозных грибов Aspergillus niger 137a, дер-матофитов Microsporum canis B-200, Trichophyton rubrum 2002 (Таблица 2) и клинических изолятов Candida spp. (Таблица 3). При выборе штаммов учитывали чувствительность Candida spp. к противогрибковым препаратам. Так, C. krusei обладает природной устойчивостью к флу-коназолу, применяемого для системного и местного лечения грибковых инфекций. Большинство клинических изолятов C. albicans чувствительны к флуконазолу, C. tropicalis занимает промежуточное положение, а 15 % изолятов C. glabrata устойчивы к флуконазолу.

Результаты исследования противогрибкового спектра выявили полную потерю активности пергидрооли-гомицина 3 в отношении A. niger и других микромице-тов, в то время как активность в отношении штаммов Candida spp. сохраняется (Таблицы 2, 3). Стоит отметить, что олигомицины 1 и 3 проявили активность в отношении резистентного штамма C. krusei (Таблица 3). Устойчивые к действию флуконазола клинические изо-ляты C. glabrata и C. albicans обладают перекрестной резистентностью как к исходному олигомицину А (1), так и к его производному 3 (Таблица 3).

Антиактиномикозная активность 2,3,16,17,18,19-гексагидроолигомицина (3) была изучена на актинобак-терии Streptomyces fradiae ATCC-19069 (штамм, сверхчувствительный к олигомицину А и его производным и являющийся патогеном, вызывающим актиномикозы) на разработанной ранее тест-системе.[13] Полученные результаты свидетельствуют о том, что гидрирование кратных связей олигомицина приводит к потере антиак-тиномикозной активности (Таблица 4).

Таблица 4. Активность олигомицина А (1) и пергидроолигомицина (3) в отношении S. fradiae ATCC-19609.

Производное MIC, нмоль/мл

Пергидроолигомицин (3) >10

Олигомицин А (1) 0.5

Антипролиферативная активность олигомици-нов 1 и 3 была изучена на клетках хронической миело-идной лейкемии человека К-562 и на клетках аденокар-циномы кишечника HCT-116. Сравнение ингибирую-щих концентраций (IC50) олигомицина А (1) и его анало -га (3) показывает, что восстановление двойных связей приводит к снижению цитотоксичности в несколько раз (Таблица 5).

Таблица 5. Цитотоксичность олигомицина А (1) и пергидроолигомицина (3) в отношении линии клеток К-562 и HCT-116.

Производное

IC50, мкМ

K-562

HCT-116

Пергидроолигомицин (3) 1.7±0.2 3.3±0.2

Олигомицин А (1) 0.20±0.03 0.9±0.1

Обобщая результаты тестирования биологических свойств, можно сделать вывод, что гидрирование двойных связей макролактонового цикла олигомицина А вызывает снижение активности, как в отношении ак-тинобактерий, так и клеток грибов и млекопитающих. Низкая активность производного 3 может быть связана с потерей конформационной жёсткости и изменением оптимальной для взаимодействия с мишенью (F0F1-АТФ-синтазой) геометрии макроцикла, вызванными разрушением диеновой системы исходного антибиотика 1. Поэтому мы провели сравнительное исследование взаимодействия олигомицина 1 и его производного 3 методом молекулярного моделирования, с использованием программы ICM-Pro 3.8.

Докирование проводилось на поверхности F0 субъединицы АТФ-синтазы в области связывания олигоми-цина А с использованием кристаллической структуры с разрешением 1.5 Â, взятой из PDB (4f4s). Сравнение геометрии расположения лучшей по энергии связывания конформации олигомицина А (1), полученной в результате докинга с кристаллографическими данными (PDB: 4f4s[19]), показывает почти полное совпадение структуры комплексов (Рисунок Д16, см. Дополнительные матери-

алы). Эти результаты указывают на то, что используемая программа и параметры, выбранные для процедуры до-кинга, хорошо подходят для моделирования связывания олигомицина А с исследуемой мишенью, а значит пригодны для прогнозирования взаимодействия его производных.

Сравнительный анализ геометрии расположения, (Рисунки 2А,В и Д.17), а также данные об энергии связывания (AGb.nd) олигомицина А (1) и 2,3,16,17,18,19-гексаги-дроолигомицина А (3) и на поверхности F0-субъединицы АТФ-синтазы (Таблица 6), полученные в результате до-кинга, показывают, что основной вклад в энергию связывания обоих лигандов вносит гидрофобная составляющая. Кулоновский вклад для обоих антибиотиков перекрывается энергией сольватации, однако стоит отметить, что гидрирование макроцикла олигомицина А приводит к увеличению значения кулоновского вклада в энергию связывания.

Количество аминокислот, расположенных на расстоянии 3 А от лиганда (Рисунки 2С^) для олигомици-на 1 почти в два раза выше, чем для прегидропроизвод-ного 3. Область, в которой происходит взаимодействие антибиотиков с мишенью, состоит преимущественно из остатков гидрофобных аминокислот (Рисунок 2), поэто-

му Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия при комплексоо-бразовании олигомицина А (1) с F0-субъединицей АТФ-синтазы существенно выше, чем в случае связывания с мишенью его производного 3. Гидрирование двойных связей олигомицина А (1) приводит к значительному увеличению конформационной ёмкости производного 3. Поскольку при связывании обоих антибиотиков с F0-субъединицей АТФ-синтазы происходит соприкосновение большей части их структуры с поверхностью мишени, комплексообразование ведёт к уменьшению энтропии за счёт потери конформационной подвижности в силу возникающего ограничения вращения вокруг двугранных углов, образованных атомами, входящих в контакт с мишенью. Как следствие, потеря энтропии в случае связывания производного 3 с мишенью значительно превосходит снижение энтропии в случае связывания исходного олигомицина А (1), что подтверждается значениями изменения энтропии (Таблица 6).

Таким образом, результаты моделирования взаимодействия с внутриклеточной мишенью, свидетельствующие о существенном снижении энергии связывания пер-гидроолигомицина 3 (по сравнению с олигомицином 1), согласуются со снижением активности производного 3 в отношении большинства тест-культур.

Рисунок 2. Структура комплексов олигомицина 1 (А, С), пергидроолигомицина 3 (В, D) и F0-субъединицы АТФ-синтазы (PDB:

полученных в результате докинга с помощью ГСМ-Рго. А, В: Локализация лучших по энергии связывания конформаций антибиотиков 1 и 3 на поверхности мишени. Рендеринг моделей: атомы углерода лигандов окрашены жёлтым цветом, атомы кислорода - красным; на поверхности АТФ-синтазы гидрофобные области окрашены в зелёный цвет, доноры водородных связей - в голубой, а акцепторы - в красный цвет; водородные связи лигандов с мишенью выделены пунктирной чёрной линией.

С, D: Аминокислотные остатки F0-субъединицы АТФ-синтазы, расположенные на расстоянии 3 А от лучших по энергии связывания конформаций соединений 1 и 3. Рендеринг моделей лигандов и аминокислот: атомы углерода окрашены в жёлтый цвет (у лигандов) и тёмно-серый (у мишени), атомы кислорода - в красный, атомы азота - в синий.

Таблица 6. Значения энергии связывания (AGbjnd, ккал/моль) с АТФ-синтазой и вкладов, её формирующих, для лучших по энергии связывания конформаций олигомицина А (1) и 2,3,16,17,18,19-гексагидроолигомицина А (3), полученных в результате докинга с помощью ICM-Pro (Рисунок 2).

Соединение AG,. , AG AG , AG„„ AG„ J -TAS AU

bind eq solv VdW hbond

1 -22.1 -1.5 1.9 -33.8 0 10.5 0.8

3 -5.6 -5.6 6.7 -20.4 -1.26 13.4 1.4

Заключение

Изучено каталитическое восстановление олигомицина А (1) и получено новое производное - пергидроолигомицин 3. Восстановление двойных С-С связей приводит к существенному изменению спектра биологического действия олигомицина. В целом, для пергидроолигомицина 3 наблюдается значительное снижение (по сравнению с исходным антибиотиком 1) антиактиномикозной и противогрибковой активности, а также цитотоксичности для клеток млекопитающих. Однако для нового производного 3 характерна специфическая активность в отношении некоторых штаммов дрожжевых грибов рода Candida, которая в отдельных случаях превосходит препарат сравнения флуконазол. Несмотря на то, что антифунгальная активность пер-гидроолигомицина 3 несколько снижена в отношении Candida spp. по сравнению с исходным антибиотиком 1, проведенная модификация макроцикла повышает избирательность действия на Candida spp. при одновременном снижении высокой цитотоксичности, характерной для олигомицина А.

Снижение активности пергидроолигомицина 3 в отношении большинства тест-культур хорошо коррелирует с результатами компьютерного моделирования взаимодействия антибиотиков с мишенью - F0-субъединицей АТФ-синтазы. Сохранение активности пергидропроизводного 3 в отношении Candida spp., по-видимому, объясняется различием в структуре F0-субъединицы или наличием дополнительных мишеней в клетках дрожжей этого рода.

Существенное изменение спектра биологических свойств пергидропроизводного 3 свидетельствует о перспективности дальнейшего поиска селективных методов восстановления олигомицина А (1) для модулирования биологической активности производных и исследования связи структура-активность в ряду оли-гомицинов.

Благодарность. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (соглашение № 15-15-00141).

Список литературы References

1. Smith R.M., Peterson W.H., McCoy E. Antibiot. Chemother. 1954, 4, 962-970.

2. Bibikova M.V., Grammatikova N.E., Kabanov A.E. et al. Antibiotiki Khimioterapiya 2003, 48, 33-39 (in Russ.).

3. Jonckeere A.L., Speitink J.A.M., Rodenburg R.J.T. J. Inherit. Metab. Dis. 2012, 35, 211-225.

4. Lysenkova L.N., Turchin K.F., Korolev A.M. et al. Bioorg. Med. Chem. 2013, 21, 2918-2924.

5. Lysenkova L.N., Godovikov I.A., Korolev A.M. et al. Macroheterocycles 2015, 8, 424-428.

6. Lysenkova L.N., Saveljev O.Y., Korolev A.M. Macroheterocycles 2016, 9, 307-313.

7. Lysenkova L.N., Turchin K.F., Danilenko V.N. et al. J. Antibiot. 2010, 63, 17-22.

8. Lysenkova L.N., Turchin K.F., Korolev A.M. et al. J. Antibiot. 2012, 65, 223-225.

9. Park J.W., Park S.R., Han A.R. et al. J. Antibiot. 2011, 64, 155-157.

10. State Standard of Russian Federation (GOST ISO 16256-2015). Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems. Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against yeast fungi involved in infectious diseases.

11. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2008. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts; approved standard, 3rd ed., M27-A3.

12. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2008. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi; approved standard, 2rd ed., M38-A2.

13. Alekseeva M.G., Elizarov S.M., Bekker O.B. et al. Biochemistry (Moscow) Suppl. A Membr. Cell. Biol. 2009, 3-16.

14. Abagyan R., Totrov M., Kuznetsov D. J. Comput. Chem. 1994, 15(5), 488-506.

15. Arnautova Y.A., Jagielska A., Scheraga H.A. J. Phys. Chem. B 2006, 110, 5025-5044.

16. Halgren T.A. J. Comput. Chem. 1996, 490-519.

17. Totrov M., Abagyan R. Protein-Ligand Docking as an Energy Optimization Problem. In: Drug-Receptor Thermodynamics: Introduction and Applications (Raffa R.B., Ed.), John Wiley & Sons, Ltd., 2001. p. 603-624.

18. Wesson L., Eisenberg D. Protein Sci. 1992, 1, 227-235.

19. Symersky J., Osowski D., Walters D.E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109, 13961-13965.

Received 30.09.2016 Accepted 21.11.2016