CC BY
4
Э. Э. САРКИСЯНЦ, Г. В. МАРГУЛИС, 1990 УДК 616-056.3-07:616.153.96-074:543.426
Э. Э. Саркисянц, Г. В. Маргулис
ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ В РЕАКЦИИ ПЛАЗМЫ КРОВИ С АЛЛЕРГЕНАМИ
I ММИ им. И. М. Сеченова
Собственная (спонтанная) хемилюминесценция (ХЛ) плазмы крови животных и человека, регистрируемая в атмосфере кислорода воздуха, отражает интенсивность свободноради-кальных процессов окисления в плазме крови и оказывается закономерно связанной с функциональным состоянием организма [1].
Биологически активные вещества, вводимые in vivo при моделировании патологических состояний в эксперименте на животных, а также с лечебной или диагностической целью в организм человека, вызывают изменения свойственного норме уровня собственной ХЛ плазмы крови. Синфазность этих изменений с развитием патологического состояния в эксперименте на животных, нормализация уровня собственной ХЛ плазмы крови в процессе медикаментозного или физиотерапевтического воздействия доказывают безусловную диагностическую роль интенсивности процессов свободнорадикального' окисления при развитии патологического состояния и его лечении, а также свидетельствуют о возможной неспецифической патогенетической значимости процессов свободнорадикального окисления в системе плазмы крови.
Из данных клинических наблюдений известно, что ряд биологически активных веществ оказывает аллергическое действие, при этом отмечается наличие ХЛ иммунокомпетент-ных клеток — макрофагов—при их активации [3, 4]. Это послужило основанием для изучения кинетических закономерностей ХЛ при взаимодействии плазмы крови с некоторыми аллергенами.
Целью настоящей работы была разработка методики прогнозирования аллергической реакции in vitro путем регистрации интенсивности собственной ХЛ.
Из числа аллергенов были использованы 12 М водный раствор формальдегида (формалин), терпентинное масло (скипидар очищенный), состоящее из а-пинена (70—90 %) и р-пи-нена (30—10%); 0,2 М водные растворы сульфата стрептомицина и сульфата дигидрострептомицина. Растворы готовили ex tempore на дистиллированной воде. Сыворотку и плазму крови человека получали центрифугированием цельной (при
Образец,
Пирексодая
кювета
Светонепроницаемый кожух
Выдвигающийся
затвор N.
ü
Термоста т
Морозильная камера
Пересчетный. приЬор
ПСТ-1ОО
Усилитель широкопо-лосныйУШ-2
Фотоумножитель ФЭУ-86
Выпрямитель стабилизирую ш, и й
ВС-22
Рис. 1. Блок-схема установки для хемилюминесцентного ана
лиза.
отсутствии следов гемолиза) венозной крови. Последнюю предварительно обрабатывали 0,1 М водным раствором цитрата натрия в объемном соотношении 10:1.
ХЛ регистрировали на установке, собранной из стандартных блоков (рис. 1). Детектором излучения служил мало-шумящий фотоумножитель ФЭУ-86, чувствительный в области 300—800 нм. Установка работала в режиме счета квантов; в каждом опыте ее чувствительность выверяли по свечению стандартного источника ЖС-19. Фотоумножитель охлаждали до —10°С. Исследуемые образцы помещали в термостати-руемую при 37 °С кювету из оптического стекла, которую наполняли 3 мл раствора исследуемого аллергена, и затем в условиях светоизоляции добавляли 0,5 мл плазмы. Счет импульсов проводили каждые 10 с. Фон установки составлял 15±2 имп/с. Величины интенсивности ХЛ исследованных образцов представлены как превышение над фоном. Эффективность счета квантов ХЛ с учетом геометрии установки и чувствительности фотокатода ФЭУ аналогична рассчитанной ранее [2] и составляет 0,5 %.
Интенсивность собственной ХЛ формалина в атмосфере кислорода воздуха стационарна и для образцов объемом 3 мл при 37 °С составляет 10±3 имп/с.
Добавление 0,5 мл плазмы крови приводило к увеличению интенсивности ХЛ в среднем до 400±50 имп/с, которая затем экспоненциально снижалась, возвращаясь к исходным значениям интенсивности собственной ХЛ формалина в течение 100—150 с (рис. 2, а). Константа скорости к уменьшения интенсивности в этой реакции, описываемая уравнением 1= 1ое—к1 и рассчитанная ко времени 30 с от момента добавления плазмы крови в формалин, колебалась в пределах 0,09
0,42 с-1 для образцов плазмы крови, взятых у различных людей. Контрольные повторные добавления плазмы крови одного и того же человека давали одинаковые значения константы скорости. Существенные различия константы к свидетельствуют о возможности дифференцировать величину сенсибилизирующего эффекта на данный аллерген у разных индивидуумов.
Собственная ХЛ 3 мл терпентинного масла на воздухе стационара и при температуре 37 °С превышала фон на 50± ±10 имп/с. Последовательные добавления плазмы крови равными объемами по 0,5 мл вызывали повышение интенсивности ХЛ терпентинного масла с последующим ее ростом (рис. 2, б). Увеличение интенсивности ХЛ подчинялось линейному закону и продолжалось все время регистрации свечения, составлявшее не менее 150 с. Активация свечения терпентинного масла, рассчитанная через 80 с после добавления плазмы крови, колебалась для образцов плазмы крови, взятых у разных людей, в пределах 90—140 имп/с на каждую пробу.
Собственная ХЛ образцов объемом 3 мл 0,2 М водных растворов солей стрептомицина различна и превышала фон для сульфата дигидрострептомицина на 20±5 имп/с, для сульфата стрептомицина на 2004:30 имп/с.
Последовательное добавление плазмы крови равными объемами по 0,5 мл приводило к повышению интенсивности ХЛ сульфата дигидрострептомицина в среднем на 5 имп/с при каждом добавлении, сульфата стрептомицина в среднем на 25—30 имп/с при каждом добавлении.
Ни у сульфата стрептомицина, ни у сульфата дигидрострептомицина не выявлено закономерной динамики интенсивности ХЛ при добавлении плазмы крови, как это наблюдалось, в частности, для терпентинного масла.
Все три исследованных аллергена: водный раствор формальдегида, терпентинное масло, водный раствор солей стрептомицина обнаруживают собственную ХЛ в атмосфере кисло-
400
200
Фон
а
200
/00
1
Фон
О
50
/00
/50
200
О
t
/
5
50
/00
150
200
Рис. 2. Кинетика хемилюми-несценции формалина (а) и терпентинного масла (б) до (/) и после (2) добавления
плазмы крови.
По оси абсцисс — время (в с); по оси ординат — интенсивность хеми-люмннесценции (в имп/с).
рода воздуха. ХЛ в видимой области спектра свидетельствует о свободнорадикальных процессах окисления в присутствии кислорода, свойственных исследованным аллергенам.
Взаимодействие аллергенов с плазмой крови приводит к увеличению интенсивности ХЛ, т. е. к усилению свободно-радикальных процессов, что может рассматриваться как один из аспектов их повреждающего действия. Кинетика ХЛ свидетельствует о разных механизмах взаимодействия исследованных аллергенов с плазмой крови. Формалин, обладая собственным свечением, индуцирует ХЛ .плазмы крови с характерным резким усилением свечения и последующим экспоненциальным спадом, вызывая денатурирующий эффект. Скипидар и стрептомицин в отличие от формалина выступают активаторами свечения плазмы крови, которое медленно увеличивается, при этом необратимый денатурирующий эффект на плазму крови не наблюдается.
Выявленные индивидуальные особенности ответа плазмы крови отдельных людей дают возможность использовать ХЛ
как прогностический тест для оценки возможной реакции данного организма на действующий аллерген в сравнительном аспекте при проведении предварительных и периодических медицинских осмотров работающих и изучении состояния здоровья населения, проживающего в районах, воздушная среда которых загрязняется указанными выше веществами.
Литература
1. Журавлев А. И., Журавлева А. И. Сверхслабое свечение сыворотки крови и его значение в комплексной диагностике.— М., 1975.
2. Маргулис Г. В. // Сверхслабые свечения в биологии. М.,
1972._С. 236_239.
3. Babior В. М. И New Engl. J. Med.— 1978.—Vol. 298.— P. 659—668.
4. Ernst M. // Behring. Inst. Mitt.— 1981.— N 65.— S. 55—61.
Поступила 17.04.89
E. M. СЕВОСТЬЯНОВА, 3. С. СМИРНОВА, 1990
УДК 614.777:678.078.21-074:543.432
Е. М. Севастьянова, 3. С. Смирнова
ЭКСТРАКЦИОННО-ФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАЛЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ПЕРОКСИДА ГЕМ-ДИТРЕТ-БУТИЛПЕРОКСИ-3,3,5-ТРИМЕТИЛЦИКЛОГЕКСАНА В ВОДНЫХ
РАСТВОРАХ
Новокуйбышевский филиал ВНИИ органического синтеза
Широкое использование органических пероксидов в качестве инициаторов при получении полимерных материалов различного назначения обусловливает присутствие пероксидов в объектах окружающей среды.
Целью настоящей работы явилась разработка методики определения пероксида гем-дитрет-бутилперокси-3,3,5-триме-тилциклогексана (пероксид дигидроизофорона) в воде на уровне пдк.
Для определения пероксида дигидроизофорона разработан полярографический метод [2], основанный на разложении (кислотном гидролизе) данного вещества в водном растворе до полярографически активного гидропероксида трет-бути-ла. Однако недостаточно низкий предел обнаружения (6 мг/л) не позволяет использовать этот метод для исследования водных растворов с концентрациями на уровне предельно допустимых. Понижение предела обнаружения путем предварительного концентрирования пероксида экстракцией органическими растворителями в указанной методике не представляется возможным, так как гидролиз пероксида идет количественно только в водной среде.
Известен также фотометрический метод определения пероксидов лауроила и бензоила в среде бензола с использованием метанольного раствора сульфата Ы,Ы-диметил-п-фе-нилендиамина [2]. Нами установлено, что в тех же условиях бензольный раствор пероксида дигидроизофорона дает
окрашенный комплекс с дигидрохлоридом Ы,Ы-диметил-п-фе-нилендиамина с Хтах 520 нм; это явилось основой для разработки методики количественного определения пероксида.
Хорошая растворимость в бензоле и количественное взаимодействие пероксида с амином позволили провести концентрирование его из водных растворов экстракцией бензолом и значительно снизить предел обнаружения. Предварительно с целью исключения токсичного реагента была доказана возможность замены метанольных растворов дигидрохлорида Ы,Ы-диметил-п-фенилендиамина на этанольные.
Установлено, что количественно реакция между перокси-дом дигидроизофорона и амином протекает в бензольно-этанольной среде при температуре 40—60 °С в течение 45 мин. В выбранных условиях соблюдается прямая пропорциональная зависимость оптической плотности от концентрации при содержании пероксида в пробе от 1,3 до 22 мкг. Предел обнаружения пероксида в пробе составляет [1]: абсолютный 1,3 мкг, концентрационный 0,014 мг/л.
При разработке методики определения пероксида дигидроизофорона было проверено влияние таких веществ, как третичный бутиловый спирт, дигидроизофорон, сульфат натрия, щелочь, которые могут присутствовать в объектах окружающей среды одновременно с исследуемым соединением. Как показали полученные результаты, присутствие этих веществ не мешает количественному определению пероксида дигидроизо-
