Характеристика В2-лимфоцитов у пациентов с серонегативным ревматоидным артритом суставной формы Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

© СИЗЯКИНА Л.П., ХАРИТОНОВА М.В., 2018 УДК: 616.132.2-089.86]-078.3

Сизякина Л.П., Харитонова М.В.

ХАРАКТЕРИСТИКА В2-ЛИМФОЦИТОВ У ПАЦИЕНТОВ С СЕРОНЕГАТИВНЫМ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ СУСТАВНОЙ ФОРМЫ

ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 344022, г Ростов-на-Дону, Россия

Представлены результаты анализа соотношения минорных субпопуляций В-лимфоцитов при серонегативном варианте течения суставной формы ревматоидного артрита. Обнаружено увеличение относительного и абсолютного числа субпопуляции В1-лимфоцитов с фенотипом CD19+CD5+. При анализе В2-клеток с иммунофенотипом CD19+CD5" показано увеличение степени экспрессии маркёров ранней активации, ко-стимулирующей молекулы CD86+, готовности к апоптозу и количество апоптирующих клеток.

Ключевые слова: серонегативный ревматоидный артрит; В1; В2-лимфоциты; минорные субпопуляции

В-клеток; ко-стимулирующие молекулы; маркеры ранней активации; аннексин. Для цитирования: Сизякина Л.П., Харитонова М.В. Характеристика В2-лимфоцитов у пациентов с серонегативным ревматоидным артритом суставной формы. Иммунология. 2018; 39(2-3): 134-136. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-2-3-134-136

SiziakinaL.P., KharitonovaM.V.

CHARACTERISTICS OF B-2 LYMPHOCYTES IN PATIENTS WITH SERONEGATIVE RHEUMATOID ARTHRITIS ARTICULAR FORM

Federal State budget institution of higher education "Rostov State Medical University" of the Russian Federation Ministry of Health, 344022, Rostov-on-Don, Russia;

The results of the analysis of the ratio of minor subpopulations of В lymphocytes in seronegative variant of course of the articular form of rheumatoid arthritis. Detected an increase in relative and absolute numbers of subpopulations of В - 1 lymphocytes with the pheno-type CD19+CD5+. In the analysis of В-2 cells with immunophenotype CD19+CD5 - shows the increase in the degree of expression of markers of early activation co-stimulatory molecules CD86+, the readiness to apoptosis and the number аpoptygma cells

Keywords: seronegative rheumatoid arthritis; B-1; В-2 lymphocytes; a minor subpopulation of В-cells; co-stimulatory molecules; the markers of early activation; annexin.

For citation: Siziakina L.P., Kharitonova M.V. Characteristics of B-2 lymphocytes in patients with seronegative rheumatoid arthritis articular form. Immunologiya. 2018; 39(2-3): 134-136. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-2-3-134-136

For correspondence: Kharitonova Maria Vladimirovna, head of the immunological laboratory of the Rostsmu clinic, post-graduate student of the Department of clinical immunology and Allergology of the Faculty of advanced training and professional training of specialists of the Rostov state medical University, E-mail: mari.kharitonova.80@mail.ru.

conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Acknowledgments. The study had no sponsorship.

Received 01.12.17 Accepted 16.04.18

введение

В настоящее время одной из актуальных проблем медицины является рост числа заболеваний, в возникновении и прогрессировании, которых дисфункция иммунной системы играет основную патогенетическую роль.

В процессе любого аутоиммунного ответа формируются аутоантитела в небольшом количестве, их физиологическая роль заключается в регуляции иммунного ответа, они способствуют пролиферации и дифференцировке иммуноком-петентных клеток, формированию предшественников антител к антигенам, своевременному удалению патологических продуктов, супрессии аутоиммунного ответа. В результате нарушения динамического равновесия в сторону преобладания аутоиммунного компонента в процессе формирования

Для корреспонденции: Харитонова Мария Владимировна, -зав. иммунологической лабораторией клиники РостГМУ, аспирант кафедры клинической иммунологии и аллергологии ФПК и ППС РостГМУ, электронный адрес E-mail: mari.kharitonova.80@ mail.ru.

нормального иммунного ответа возникают аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит, рассеянный склероз, псориаз, системная красная волчанка и т. д. [1, 2].

Ревматоидный артрит (РА) - системное аутоиммунное заболевание, характеризующееся хроническим воспалением синовиальной оболочки суставов и прогрессирующей деструкцией костной и хрящевой ткани [3]. Несмотря на значительное количество исследований, посвящённых роли имму-нокомпетентных клеток в патогенезе ревматоидного артрита (РА), далеко не все аспекты окончательно расшифрованы. В настоящее время изучается роль В-лимфоцитов и их субпопуляций (В1, В2, наивных и клеток памяти) в аутоиммунном воспалении при ревматических заболеваниях (РЗ) [4, 5].

В настоящее время выделяют 4 вида субпопуляции В-лимфоцитов. Данные клетки отличаются друг от друга не только экспрессией мембранных антигенов, локализацией, но и функциональными свойствами.

Так, В1-лимфоциты имеют иммуннофенотип CD19+CD5+, являются самовозобновляющимися, долгоживущими клетками и вызывают значительный интерес за счёт, того, что их ассоциируют с продукцией аутоантител и, как следствие, с

ORIGINAL ARTICLE

аутоиммунными заболеваниями. Отмечено увеличение данных клеток у пациентов с РА, системной красной волчанкой и при синдроме Шегрена. Однако результаты изучения субпопуляции В-лимфоцитов с фенотипом CD19+CD5+ в имму-нопатогенезе аутоиммунных ревматических заболеваниях немногочисленны и противоречивы [5,8].

Основное количество В-клеток в периферической крови представлено В-2-лимфоцитами с фенотипом CD19+CD5-. Данные клетки при ревматоидном артрите презентируют антигены Т-лимфоцитам, влияют на их активацию, индуцируют дифференцировку фолликулярных дендритных клеток, эктопический лимфонеогенез, а также участвуют в синтезе провоспалительных цитокинов и аутоантител [3,4, 6].

Поликлональная активация В-лимфоцитов при РА сопровождается нарушением соотношения в периферической крови наивных и В-клеток памяти в сторону увеличения последних, что отражает потерю периферической толерантности, дефект негативной селекции, усиление активации и дифференциров-ки наивных В-клеток, а также отсутствие чувствительности к иммуносупрессивным препаратам [3, 7, 8].

Цель работы - изучение функциональных характеристик субпопуляции В-лимфоцитов с фенотипами CD3-CD19+CD5+CD45+, CD3-CD19+CD5-CD45+ при серонегатив-ном ревматоидном артрите, суставной формы.

Материал и методы

Работу проводили на базе НУПК «Клиническая иммунология» ФГБОУ ВО Ростовского государственного медицинского университета. Обследованы 23 пациента с серо-негативным вариантом суставной формы, средний возраст 58±3 года, 2—3-й степени активности. В качестве группы сравнения обследованы 10 практически здоровых доноров в возрасте 40-50 лет.

Иммунофенотип В-клеток и их субпопуляции были охарактеризованы на основании экспрессии на мембране следующих антигенов:

CD19+CD5+CD45+ (В1-лимфоциты), CD19+CD5-CD45+ (зрелые В-2), CD19+CD45RA+CD27-CD45+ (наивные В-2), CD19+CD45RA-CD27+ CD45+ (В2-клетки памяти), CD19+CD23+CD45, CD19+CD25+CD45+ (маркёры ранней активации), CD19+CD40+CD45+, CD19+CD86+CD45+ (ко-стимулирующие молекулы), CD19+An+CD45, CD19+CD95+CD45+ (готовность В-лимфоцитов к апоптозу), а также CD3+CD4+CD40L+ CD45+(лиганд для взаимодействия Т-лимфоцитов с В-клетками), в реакции непрямой иммунофлюорес-ценции с учётом результатов на проточном лазерном цитофлуориметре марки «FC 500», производитель Вескстап Coulter (США), с использованием соответствующих однопараметрических моноклональных антител производства Beckman Coulter (США). Количественное определение иммуноглобулинов классов A, M, G в сыворотке крови проводили методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини, с использованием коммерческих наборов производства ФГУП «НПО «Микроген»» Минздрава России. Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) исследовали методом селективной преципитации в полиэтилен-гликоле 6000 (ПЭГ).

Математическую обработку полученных данных выполняли с применением программы Statistica for Windows 7.0. Достоверность различий в группах оценивали с помощью непараметрических критериев Манна-Уитни и Вилкоксона, достоверными считали результаты при р< 0,05.

результаты

Анализируя параметры гуморального звена иммунной системы у исследуемых с серонегативным

вариантом суставной формы РА по сравнению с группой контроля, установили статистически достоверное повышение относительного количества В1-лимфоцитов с фенотипом CD19+CD5"CD45+ по сравнению с контролем (1,33±0,54 и 0,12±0,03 % соответственно). При этом было отмечено увеличение количества зрелых В2-лимфоцитов как по относительным (11,23±1,16 и 8,0±0,45 %), так и абсолютным (0,24±0,02-109/л и 0,08±0,01-109/л) параметрам содержания их в крови. Анализ соотношения наивных и клеток памяти В2-лимфоцитов выявил увеличение количества наивных CD19+CD45RA+CD27-CD45+-лимфоцитов, тогда как клетки памяти CD19+CD45RA-CD27+CD45+ не отличались от референтных значений. Данная связь иллюстрирует индекс соотношения наивных В2-лимфоцитов к В2-клеткам памяти (табл. 1).

Оценивая функциональную активность В2-клеток, установлено усиление экспрессии маркеров ранней CD19+CD23+CD45, CD19+CD25+CD45 активации (см. табл. 1).

Для В2-звена иммунной системы при серонегативном варианте течения суставной формы РА выявлено статистически достоверное повышение экспрессии рецептора готовности к апоптозу CD19+CD95+CD45+, что коррелирует с количеством апоптотирующих В-лимфоцитов в реакции с аннексином -V (см. табл. 1).

Среди ряда сигнальных молекул, принимающих участие в реализации иммунных реакций, следует отметить рецептор CD40 (В-лимфоциты) - лиганд CD40L (активированные Т-хелперы) и CD86 (активированные В-лимфоциты). Данные ко-стимулирующие молекулы облегчают распознавание антигена и его презентацию В-лимфоцитами хелперным Т-клеткам. Данное взаимодействие приводит к пролифе-

Таблица 1

Мембранные маркеры в2-лимфоцитов при серонегативном варианте суставной формы ревматоидногоартрита

Больные РА, су- Контрольная

Фенотип В-2лимфоцитов ставная форма, группа

серонегативный вариант

Маркёры степени зрелости В2-клеток

Наивные клетки

CD19+CD45RA+CD27-CD45+ % 8,60±1,10* 5,65±0,46

CD19+CD45RA+CD27-CD45+ 109/л 0,18±0,02 0,06±0,01

Зрелые В-клетки

CD3-CD19+CD45+,% 11,23±1,16* 8,0 ±0,45

CD3-CD19+CD45+ 109/л 0,24±0,02* 0,08±0,01

Клетки памяти

CD19+CD45RA-CD27+CD45+ % 2,63±1,4 2,4±1,8

CD19+CD45RA-CD27+CD45+ 109/л 0,06±0,03 0,022 ±0,01

Индекс соотношения наивных В2-клеток 3,0±0,36* 2,36±0,20

к В2-лимфоцитам памяти, у. е.

Маркёры ранней активации В2-клеток

CD19+CD23+CD45+ % 2,23±0,46* 0,91 ±0,14

CD19+CD23+CD45+, 109/л 0,05±0,002* 0,03±0,002

CD19+CD25+CD45+ % 0,58±0,15* 0,05 ±0,01

CD19+CD25+CD45+, 109/л 0,01±0,001* 0,002±0,0002

Маркёры апоптоза В2-клеток

CD19+CD95+CD45+ % 1,04±0,37* 0,33 ±0,03

CD19+CD95+CD45+, 109/л 0,03±0,01* 0,001±0,0001

CD19+An+CD45+ % 1,55±0,24* 0,50 ±0,03

CD19+An+CD45+, 109/л 0,04±0,01* 0,02±0,003

Примечание. * Отмечены статистически достоверные различия с контрольной группой при р<0,05.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Таблица 2

Маркёры взаимодействия В и Т-клеток при серонегативном варианте суставной формы ревматоидного артрита

Показатель Больные РА, суставная форма, серонегатив-ный вариант Контрольная группа

Экспрессия ко-стимуляторных молекул на В2-лимфоцитах CD19+CD40+CD45+, % 8,14±0,96 7,02 ±0,42

CD19+CD40+CD45+, 109/л 0,12±0,001 0,08±0,01

CD19+CD86+CD45+, % 1,07±0,24* 0,13 ±0,01

CD19+CD86+CD45+, 109/л 0,016±0,001* 0,002±0,001

Экспрессия лиганда на Т-хелперах CD3+CD4+CD45+, % 43,5 ±1,47 42,05±0,35

CD3+CD4+CD45+, 109/л 0,65±0,02 0,42 ±0,02

CD4+CD40L+CD45+, % 0,63±0,12* 0,29 ±0,05

CD4+CD40L+CD45+, 109/л 0,009±0,001* 0,003 ±0,002

Примечание. * Отмечены статистически достоверные различия с контрольной группой при р<0,05.

Таблица 3

Показатели сывороточных иммуноглобулинов при серонега-тивном варианте суставной формы ревматоидного артрита

Показатель Больные РА, суставная форма, серо-позитивный вариант Контрольная группа

IgA г/л 2,17±0,13* 1,13±0,01

IgM г/л 1,38±0,09* 1,07±0,02

IgG г/л 10,40±0,41 10,35±0,26

ЦИК у. е. 103,0±11,88* 65,15±1,83

Примечание. * Отмечены статистически достоверные различия с контрольной группой при р<0,05.

рации и выживанию аутореактивных СВ4+-лимфоцитов, усилению синтеза провоспалительных цитокинов, активации В-лимфоцитов, их пролиферации, дифференцировки в клетки памяти или плазматические клетки, продуцирующие антигенспецифические иммуноглобулины различных изоти-пов [3].

Экспрессия молекулы CD40 на В-клетках при серонегативном РА не отличалась от донорских показателей. Выявлено увеличение экспрессии ко-стимулирующей CD86-молекулы на лимфоцитах с фенотипом CD19+CD3-CD5-CD45+ и усилением экспрессии лиганда CD40L на Т-хелперах, при этом относительное количество CD3+CD4+CD45+-клеток не отличалось от контрольной группы (43,5±1,47 и 42,05±0,35 % соответственно) (табл. 2).

На наличие высокой степени активности гуморального звена иммунной системы указывает также и значительное статистически достоверное повышение содержания сывороточных иммуноглобулинов классов IgA, IgM и ЦИК. При этом содержание IgG практически не меняется по сравнению с показателями контрольной группы, что указывает на существенное нарушение процессов межклеточной кооперации (табл. 3).

Обсуждение

Анализ В-лимфоцитов периферической крови у больных с серонегативным РА выявил изменения В-звена иммунной системы. При этом отмечено увеличение общего количества В-клеток и изменение соотношения их субпопуляционого со-

става. Наблюдается нарастание популяции В-1 и B-2 клеток. Получая активационные сигналы через ко-стимуляторные молекулы, наивные клетки превращаются в плазматические клетки с последующим синтезом иммуноглобулинов различных изотипов. Данный факт в работе иллюстрируется увеличением содержания сывороточных иммуноглобулинов классов IgA, IgM, усилением экспрессии сигнальных молекул CD86 на активированных В2-лимфоцитах и CD40L на Т-хелперах. Активированные В2-клетки, которые не получили сигнал через CD40 погибают в процессе апоптоза. У пациентов с серонегативным РА отмечается отсутствие изменений в экспрессии CD40 на В-клетках и усиление экспрессии маркёров готовности к апоптозу и увеличение количества апоптирующих клеток.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Андреева И.И., Сизякина Л.П., Гончарова З.А. Инверсия гомео-статических свойств иммунной системы при рассеянном склерозе. Медицинский вестник Юга России. 2016; 2: 23-7.

2. Андреева И.И., Хасанов УВ., Сизякина Л.П. Клеточно-опосредованные реакции врожденного иммунного ответа при аутоиммунной патологии. Цитокины и воспаление. 2010; 9(4): 66-7.

3. Насонов Е.Л., ред. Анти-В-клеточная терапия в ревматологии: фокус на ритуксимаб. М.: ИМА-ПРЕСС; 2012.

4. Зурочка А.В., Хайдуков С.В. Проточная цитометрия в медицине и биологии. Екатеринбург: РИО УрО РАН; 2013.

5. Dorner T., Jacobi A.M., Lipsky P.E. B cells in autoimmunity. Arthr. Res. Ther. 2009; 11: 247.

6. Чепель Э., Хейни М. Основы клинической иммунологии. 5-е изд. М.: ГЭОТАР-медиа; 2008.

7. Сизякина Л.П., Калашникова Т. А. Критерии прогноза эффективности терапии инфликсимабом пациентов с серопозитивным вариантом суставной формы ревматоидного артрита. Иммунология, аллергология, инфектология. 2011; 2: 20-5.

8. Сидорова Е.А. Королевство В-лимфоцитов. Медицинская иммунология. 2004; 3-5 (6); 176-85.

REFERENCES

1. Andreeva I.I., Sizyakina L.P., Goncharova Z.A. inversion of the homeostatic properties of the immune system in multiple sclerosis. Meditsinskiy vestnik Yuga Rossii. 2016; 2: 23-7. (in Russian)

2. Andreeva I.I., Khasanov U.V., Sizyakina L.P. the Cell-mediated reaction of the innate immune response in autoimmune pathology. Tsi-tokiny i vospalenie. 2010; 9(4): 66-7.

3. Nasonov E.L., Ed. The anti-b-cell therapy in rheumatology: focus on rituximab. [Anti-V-kletochnaya terapiya v revmatologii: fokus na rituksimab]. Moscow: IMA-PRESS, 2012; 344.

4. Zurotchka A.V., Khaydukov S.V. Flow cytometry in medicine and biology. [Protochnaya tsitometriya v meditsine i biologii]. Ekaterinburg: RIO UB RAS; 2013.

5. Dorner T., Jacobi A.M., Lipsky P.E. B cells in autoimmunity. Arthr. Res. Ther. 2009; 11: 247.

6. Csepel D., Haney M. Essentials of clinical immunology. [Osnovy klinicheskoy immunologii]. 5-e Izd. Moscow: GEOTAR-media; 2008.

7. Siziakina L.P., Kalashnikova T.A. Criteria for prediction of the effectiveness of infliximab therapy in patients with seropositive variant of the articular form of rheumatoid arthritis. Immunologiya, aller-gologiya, infectologiya. 2011; 2: 20-5.

8. Sidorova E.A. Kingdom b-lymphocytes. Meditsinskaya immunologiya. 2004; 3-5 (6): 176-85.

Поступила 01.12.17 Принята в печать 16.02.18