CC BY
20
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
предполагать Т-независимый характер активации регРФ-продуцирующих лимфоцитов Fc-фрагментами IgG.
Работа поддержана грантом РФФИ 16-34-60164 мол_а_дк.
ЭФФЕКТЫ ДЕКСАМЕТАЗОНА НА АКТИВАЦИЮ И РЕПЛИКАТИВНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ CD4+Т-КЛЕТОК ПАМЯТИ ПРИ РЕВМАТОИДНОМ АРТРИТЕ В СИСТЕМЕ IN VITRO
Тодосенко Н.М., Юрова К.А., Хазиахматова О.Г., Малинина И.П., Литвинова Л.С.
Балтийский федеральный университет им. И. Канта, Калининград, Россия
Введение. Ревматоидный артрит (РА) — аутоиммунное заболевание (АИЗ), патогенез которого опосредован аутореактивными синовиально-подобными CD4+CD45RO+Т-клетками (VanderBorght A. et al., 2001; Spreafico et al., 2016). До настоящего времени патогенетической терапии РА не разработано; основным методом лечения РА является противовоспалительная терапия синтетическими глюкокортикоидами (ГК), использование которых сопровождается развитием побочных эффектов, в т.ч. со стороны иммунной системы.
Цель. Оценка влияния дексаметазона (Dex) на функциональную активность CD4+CD45RO+Т-клеток больных РА в условиях in vitro.
Материалы и методы. Материалом исследования служили мононуклеарные лейкоциты (МНК), выделенные из венозной гепаринизированной крови, полученной от 20 условно здоровых доноров (10 женщин и 10 мужчин, средний возраст 35,3±8,9 лет) и 50 больных РА (38 женщин и 12 мужчин, средний возраст 36,4±7,2 лет). МНК получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-урографин (1,077 г/см3) (Pharmacia, Швеция). Выделенные методом сепарации (MiltenyiBiotec, Germany) CD3+CD4+CD45RO+CD14CD19- лимфоциты (далее, CD4+CD45RO+ клетки) (1,0 х 106 кл/мл) инкубировали в бессывороточной среде Искова без/в присутствии Т-клеточного активатора (T-Cell Activation/ ExpansionKithuman, Ac/Exp) (MiltenyiBiotec, Germany) и разных концентраций Dex (Orion Pharma, Россия) при 37 °С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2 в течение 48 ч. Варианты культивирования: 1) интактная проба (без добавления Ac/Exp и синтетических ГК); 2) проба с добавлением Ac/Exp; 3) пробы с добавлением Ac/Exp и разных концентраций Dex (2; 8; 16; 32; 64 мг). Оценку числа клеток, несущих поверхностные маркеры (CD28, CD25, CD71) проводили методом проточной цитофлюориметрии с помощью моноклональных антител, меченных флуоресцентными метками: ViaBlue, FITC, PE, PECy7 и PerCy5 (eBioscience, США) на приборе «MACSQuantAnalyzer» (MiltenyiBiotec, Германия). Исследование уровня экспрессии гена hTERT проводили методом ПЦР. Последовательности олигонуклеотидных праймеров и протоколы амплификации описаны ранее (Шуплецова В.В., 2015). Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью программы IBM SPSS Statistics 20.
Результаты. В интактных культурах лимфоцитов здоровых доноров число клеток, несущих поверхностные молекулы CD28, CD25 и CD71 достоверно превышало аналогичные показатели в интактных культурах больных РА. Действие Ac/Exp на исследуемые CD4+CD45RO+ культуры сопровождалось увеличением числа CD4+Т-клеток, экс-
прессирующих молекулы CD28, CD25, CD71 (по сравнению с интакгаыми пробами), при этом уровень транскрипции мРНК гена hTERT в Т-клетках, косвенно характеризующий репликативный потенциал, оказался сниженным как в культурах здоровых доноров, так и у больных РА. Со-четанное действие Ac/Exp и Dex на исследуемую культуру лимфоцитов здоровых доноров приводило к дозозависимо-му снижению числа лимфоцитов, экспрессирующих маркеры активации CD25 (г2 = 0,675, p < 0,001) и пролиферации CD71 (г2 = 0, 621, p < 0,001); экспрессия корецептора CD28 и транскрипция мРНК гена hTERT снижались только при действии высоких концентраций ГК (p < 0,05).
Действие комбинации Ac/Exp + Dex на Т-клетки больных РА сопровождалось дозозависимым уменьшением числа CD4+CD28+Т-клеток (г2 = 0,700, p < 0,001) и уровня транскрипции мРНК гена hTERT (г2 = 0,894, p < 0,05); снижение содержания CD4+CD25+/CD71+T-клеток имело равномерный супрессивный характер и не зависело от действующей концентрации Dex.
Заключение. Таким образом, влияние Dex (в системе in vitro) на процессы активации и пролиферации TCR-стимулированных CD4+CD45RO+Т-клеток, полученных у здоровых доноров и больных РА, ассоциированные с экспрессией молекул — CD25, CD28 и CD71, имеет однонаправленный характер, но разную степень выраженности. Выявленное нами уменьшение числа CD4+CD45RO+Т-клеток, несущих мембранные молекулы коактивации (CD25 и CD28) и пролиферации (CD71) с одновременным подавлением экспрессии гена hTERT в CD45RO+Т-лимфоцитах свидетельствует об угнетении репликативного потенциала этих клеток и их терминальной дифференцировке и созревании в эффекторные лимфоциты под действием синтетических ГК.
Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности («дорожной карты») и субсидии «Организация проведения научных исследований 20.4986.2017/ВУ» Балтийского федерального университета им. Иммануила Канта.
ВЗАИМОСВЯЗЬ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ И КЛИНИЧЕСКИХ СИМПТОМОВ ОСТЕОАРТРИТА В СОЧЕТАНИИ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ
Трифонова Е.П., Сазонова О.В., Зонова Е.В.
ФГБОУВО «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, Новосибирск, Россия
Введение. Воспалительные процессы, происходящие при остеоартрите (ОА), связаны с изменениями профиля цитокинов в сыворотке крови, которые могут быть ассоциированы с параметрами тяжести течения данного заболевания. Известно, что сахарный диабет 2 типа (СД2) может способствовать поддержанию хронического воспаления и приводить к ускоренной прогрессии коморбидной патологии, в том числе ОА в сочетании с СД2.
Цель и задачи. Изучение уровня провоспалительных цитокинов и маркеров деградации внутриклеточного матрикса (ВКМ) хрящевой ткани в сыворотке крови, с последующей оценкой взаимосвязи с клиническими особенностями у пациентов с ОА коленных суставов в сочетании с СД2.
Материалы и методы. В исследовании приняло участие 98 человек с ОА коленных суставов, удовлетворяющим кри-
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Аутоиммунные заболевания Autoimmune diseases
териям ACR (2000). У пятидесяти двух пациентов был верифицирован диагноз СД2, который был установлен за год и более до развития клинико-рентгенологических проявлений ОА. Группу пациентов с ОА и СД2 (n = 52) составили 10 мужчин и 42 женщины, средний возраст которых был 64±0,9 лет, длительность заболевания — 10,5±1,1 лет (ОА) и 5±0,5 лет (СД2). В группе сравнения обследованы больные с ОА без СД2 (n = 46) сопоставимые с основной группой по полу (7 мужчин и 39 женщин), возрасту (средний возраст 61±1,1) и длительности ОА (6,7±0,6 лет). Проведено определение уровня IL-6, IL-18, адипонектина, Acol2Ab, AGC в сыворотке крови с использованием ИФА. Функциональный статус и влияние ОА на уровень боли, общее состояние здоровья оценивались по шкалам KOOS,WOMAC Knee, VAS. Проведен анализ уровня депрессивных расстройств по индексу PHQ-9 и параметров качества жизни (КЖ) по шкале SF-36.
Результаты. При сравнении групп пациентов выявлены достоверные различия содержания в сыворотке крови IL-6 - р = 0,0006, IL-18 - p = 0,0012, Acol2Ab - p = 0,004, AGC — p = 0,005. В группе больных ОА и СД2 показана достоверная корреляционная взаимосвязь между сывороточным уровнем IL-6 и значениями болевого синдрома (VAS г = 0,3, p = 0,002), функционального статуса (KOOS ADL г = -0,2, p = 0,004; SF-PF г = -0,3, p = 0,01), параметрами КЖ (SF-VT г = -0,3, p = 0,01; SF-SF г = -0,2, p = 0,04), также между такими показателями как Acol2Ab и общим самочувствием по VAS (г = 0,5, p = 0,003). Среди пациентов с ОА, без СД2 найдены статистически значимые взаимосвязи между уровнем Acol2Ab в сыворотке крови и значениями болевого синдрома (SF-BP г = 0,5, p = 0,002) функционального статуса (WOMAC total г = -0,3, p = 0,004; KOOS sports г = 0,4, p = 0,002; SF-PH г = 0,5, p = 0,004) и параметрами качества жизни (SF-RP г = 0,4, p = 0,003). По другим изучаемым показателям в данных выборках статистически значимых взаимосвязей найдено не было.
Заключение. У больных ОА с СД2 и без выявлены достоверные различия уровня провосполительных цитокинов и маркеров деградации ВКМ хрящевой ткани ( IL-6, IL-18, Acol2Ab, AGC ) в сыворотке крови. Тяжесть коморбидной патологии проявляется в выраженных функциональных нарушениях, ускоренной прогрессии, ухудшении КЖ, наличии деструктивных форм ОА, что подтердждается высоким уровнем данных иммунологических показателей.
ИММУНОФЕНОТИП В-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ СЕРОНЕГАТИВНОМ ВАРИАНТЕ ТЕЧЕНИЯ ВИСЦЕРАЛЬНОЙ ФОРМЫ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА
Харитонова М.В., Сизякина Л.П.
ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет», Ростов-на-Дону, Россия
Ревматоидный артрит (РА) — аутоиммунное системное заболевание, проявляющееся различными формами и вариантами течения заболевания (Насонов Е.Л., 2012). РА с системными появлениями — это высокоактивная, генерализованная форма болезни с клиническими проявлениями, такими как нейропатия, перикардит, плеврит, васкулит, поражение глаз (Насонов Е.Л., 2013). Несмотря на значительный прогресс в понимании иммунопатогене-за РА с внесуставными проявлениями и участия в нем множества клеток иммунной системы, остается в настоящее время дискуссионным вопрос об участии В-лимфоцитов с разными иммунофенотипами и процессов костимуля-торного взаимодействия Т и В-лимфоцитов в патогенезе данного заболевания. В связи с этим целью работы являет-
ся изучение иммунофенотипа В-клеток и процессов межклеточной кооперации при системных проявлениях РА.
Материалы и методы. Обследовано 10 пациентов с серонегативным вариантом висцеральной формы РА, в стадии обострения, 2-3 степень активности. Контрольную группу составили 10 практически здоровых доноров в возрасте 30-40 лет.
Иммунофенотип В-лимфоцитов изучали по экспрессии следующих мембранных антигенов на данных клетках: CD19+CD45RA+CD27-CD45+, CD19+CD45RA-CD27+CD45+, CD19+CD23+CD45, CD19+CD25+CD45+, CD19+HLA DR+CD45+, CD19+CD40+CD45, CD19+CD95+CD45+, в реакции непрямой иммунофлюорес-ценции, с учетом результатов на проточном лазерном ци-тофлуориметре. Уровень сывороточных иммуноглобулинов классов А,М^ оценивали в реакции радиальной иммуно-дифффузии в геле по Манчини. Содержание циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) методом селективной преципитации в полиэтиленгликоле 6000 (ПЭГ). Для математической обработки полученных данных использовали программу Statistica 7.0. Достоверность различий в группах оценивали с помощью непараметрических критериев Ман-на—Уитни и Вилкоксона. Достоверными считались результаты при р < 0,05.
Анализ относительного количества зрелых В-клеток, у пациентов с внесуставными проявлениями РА, по сравнению с группой контроля выявил статистически достоверное их увеличение CD19+CD3-CD45+ (11,1±1,0 и 8,0±0,45% соответственно), однако при этом отмечается увеличение наивных В-лимфоцитов CD19+CD45RA+CD27-CD45+ (8,18±0,68 и 5,6±0,46%), тогда как В-клетки памяти CD19+CD45RA-CD27+ CD45+ не отличались от референтных значений. Отмечено увеличение экспрессии молекулы НЬА DR (9,78±0,38 и 7,39±0,41%) на мембране CD19+CD3-CD45+ клеток.
Анализ показателей межклеточной кооперации выявил, что у пациентов с внесуставными появлениями РА было выявлено статистически значимое увеличение экспрессии костимулирующей молекулы CD19+CD40+CD45+ (9,59±0,65 и 7,02±0,42%) на В-лимфоцитах и CD40L лиганда на Т- хелперах CD3+CD4+CD45+ (0,66±0,15 % и 0,29±0,05%). При изучении функциональной активности В-клеток выявлено усиление экспрессии маркеров ранней активации CD19+CD23+CD45 (2,72±0,18 и 0,91±0,14%), CD19+CD25+CD45+ (0,31±0,01 и 0,05±0,01%), тогда как процессы элиминации активированных клеток характеризовались увеличением экспрессии рецептора CD19+CD95+CD45+ готовности к апоптозу (0,66±0,12 и 0,33 ±0,03% соответственно).
В гуморальном звене иммунной системы наблюдается статистически достоверное повышение содержания сывороточных иммуноглобулинов классов трех классов IgА (1,99±0,1 и 1,13±0,01 г/л), ^ (1,5 ±0,07 и 1,07±0,02 г/л), IgG (11,29±0,24 и 10,35±0,26 соответственно), что свидетельствует об интенсификации синтеза иммуноглобулинов.
Таким образом, у пациентов с висцеральным вариантом течения серонегативного РА выявлено увеличение наивных В-клеток и клеток с иммунофенотипом зрелых В-лимфоцитов, усилением экспрессии на них маркеров ранней активации и готовности к апоптозу. Анализ интенсивности процессов межклеточной кооперации выявил повышение экспрессии костимулирующей молекулы CD40L на Т-хелперах и CD40 на В- клетках, что обеспечивает усиление передачи сигнала через образовавшийся комплекс, что обуславливает более агрессивный характер течения серонегативного РА с системными проявлениями.
