CC BY
224
Характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, полученных из плаценты человека
В. Шаблий 12, М. Кучма 12, В. Кирик 3, Г. Онищенко 224, П. Арешков 1, Н. Скрипник 4, Л. Лукаш 1, Г. Лобынцева 2
1 Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, Украина
2 Институт клеточной терапии, Киев, Украина
3 Институт генетической и регенеративной медицины НАМН, Киев, Украина
4 Институт биологии Киевского национального университета им. Т. Шевченко, Киев, Украина
Characteristics of placental multipotent mesenchymal stromal stem cells
V. Shablii12, M. Kuchma 12, V. Kyryk 3, G. Onishchenko24, P. Areshkov1, N. Skrypnyk 4, L. Lukash 1, G. Lobyntseva 2 11nstitute of Molecular Biology and Genetics of NAS of Ukraine, Kiev, Ukraine
2 Institute of Cell Therapy, Kiev, Ukraine
3 State Institute of Genetic and Regenerative Medicine of NAMS of Ukraine, Kiev, Ukraine
4 Institute of Biology of the T. Shevchenko National University of Kiev, Kiev, Ukraine
Популяция мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК], полученная из плаценты человека, характеризуется иммунофенотипом CD90+/CD73+/ CD105+/HLA-AB0ow/CD34-/CD45-/CD133-/CD14- и присутствием клеток, продуцирующих цитокератин 7. Показано достоверное уменьшение количества клеток, экспрессиру-ющих цитокератин-7, в течение трех пассажей в культуре. Установлен уровень химеризма клеток матери в культурах клеток плаценты. Выявлена экспрессия генов транскрипционных факторов, характерных для эмбриональных и сердечных стволовых клеток, ОСТ-4 и N^2-5, и впервые описана экспрессия генов spp1, со12а1 и рраг-у2 в культуре клеток плацентарных ММСК, способных к дифференциров-ке в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлениях. Обоснована необходимость индивидуального подбора генов-маркеров дифференцировки для ММСК разного происхождения, в зависимости от исходного уровня их экспрессии.
Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, плацента человека, цитокератин-7, дифференцировка.
In this paper we have shown the presence of population of cytokeratyn-7-producing cells in culture of multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC) from placenta with immunophenotype CD90+/CD73+/CD105+/HLA-ABClow/CD34/ CD45-/CD133-/CD14-. It was shown by immunocytochemistry of placental MMCS a significant decrease of the population of cytokeratyn-7 positive cells during three passages in vitro. A chimerism of mother cells in cell culture of placental MMSC was established. PCR analysis has detected expression of transcription factors genes which are typical for embryonic and heart stem cells OCT-4 and NKX2-5, and at first the expression of genes sppl, col2a1 and ppar-y2 in cell cultures of placental MMSC with adipogenic, osteogenic and chondrogenic potential in vitro was described. Also we showed the necessity of individual selection of marker genes for differentiation of MMCS from various sources, depending on their initial level of expression.
Key words: multipotent mesenchymal stromal cells, human placenta, cytokeratin-7, differentiation.
Плацента млекопитающих является не только органом, выполняющим метаболическую, иммунную и гормональную функции для обеспечения развития плода. В последние годы установлено, что из тканей плацентарного хориона и амниона можно получить мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) и мультипотентные клетки цитотрофобласта, которые характеризуются высоким уровнем экспрессии маркеров эмбриональных стволовых клеток (Oct-3/4, Nanog, SSEA-4 и щелочной фосфатазы) [1, 2]. Однако их моле-кулярно-биологические свойства еще не достаточно описаны, несмотря на очевидную актуальность данного научного направления и быстрые темпы его развития.
Целью данного исследования было охарактеризовать экспрессию некоторых генов у плацентарных ММСК на разных пассажах in vitro.
Материал и методы
Получение плацентарных ММСК
Плаценту получали в условиях родильного зала или операционной после физиологических родов или операции кесарева сечения на сроке беременности 39—41 нед. у пациенток в возрасте 23—36 лет на основании предварительного информированного согласия. Ткань плаценты промывали в растворе Хэнкса с добавлением 50 ед/мл амфотерицина, 100 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, после чего измельчали на фрагменты не больше 3 мм. Клетки выделяли методом ферментации в течение 10— 30 мин в растворе 0,1% коллагеназы I (Serva, Германия) и 0,6 ед/мл диспазы (Gibco, Германия) при температуре 37°С.
Для снижения активности ферментов к выделенным клеткам добавляли фетальную бычью сыворотку
e-mail: v_shabliy@ukr.net
(ФБС, Sigma, США) до 10%-ной конечной концентрации. Полученную суспензию фильтровали через фильтр с диаметром пор 70 мкм (Becton Dickinson, США), и отмывали путем центрифугирования при 300 g в течение 10 мин. Осадок клеток суспендировали в растворе Хэнкса и высевали в питательную среду ДМЕМ (Sigma, США), содержащую 15% ФБС (Gibco, Германия), 2 мМ глютамина, 5 мМ HEPES (Biomedicals, США), 100ед/мл пенициллина,50 мкг/мл стрептомицина. Культивирование проводили в культу-ральных флаконах для адгезивных клеток из расчета 300—400 тыс. клеток на 1 см2 при 37°С в атмосфере 5% СО2 с заменой среды 2 раза в нед. Пересев осуществляли при достижении культурой 80—90% конфлюэнтности монослоя в соотношении 1:3. Для пересева культуру выдерживали в течение 3—5 мин с 0,05% раствором трипсина-ЭДТА (Biochrom, Германия) до полного открепления клеток.
Проточная цитофлюориметрия
Иммунофенотипирование клеток осуществляли методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител, конъюгированных с флуорохромами (Becton Dickinson, США), в рабочей концентрации 0,5 мкг на 106 клеток: anti-CD34 APC, anti-CD90 FITC, anti-CD45 APC-Cy7, anti-CD105 PerCP-Cy 5.5, anti-CD73 PE, anti-CD14 Pacific Blue, anti-CD133 PE. Для детекции HLA-ABC использовали первичные мышиные моноклональные антитела (изотип IgG2b) к HLA-ABC человека (Millipore, США) в разведении 1:50 и вторичные крысиные монокло-нальные антитела к мышиным иммуноглобулинам IgG2a+b, коньюгированным с PerCP (Becton Dickinson, США) в объеме 20 мкл на 106 клеток.
Измерения проводили на лазерном проточном цитофлуориметре-сортере BD FACSAria (Becton Dickinson, США) с помощью программного обеспечения BD FACS Diva 6.1, анализируя одновременно 2 параметра светорассеяния и 6 параметров флуоресценции. Для настройки компенсации перекрытия спектров эмиссии флуорохромов при многопараметрическом анализе использовали контрольные образцы клеток без внесения антител (unstained control), образцы с каждым из антител отдельно (single stained control) и образцы с комбинацией нескольких антител без одного (fluorescence minus one control).
Направленная дифференцировка ММСК
in vitro
Для определения способности дифференцироваться в остеогенном направлении культуру клеток на третьем пассаже инкубировали в среде DMEM с 10-7М дексаметазона, 10 мМ p-глицерофосфата и 0,1 мМ аскорбат-2-фосфата в течение 21 сут. Минерализованный матрикс проявляли окрашиванием 1% раствором ализаринового красного (Alizarine Red S).
Для адипогенной дифференцировки клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 10% ФБС, 1 мкМ дексаметазона, 0,5 мМ изобутил-ме-тилксантина (Sigma, США), 0,1 мМ индометацина (Sigma, США) и 10 нг/мл инсулина в течение 21 сут. Жировые включения проявляли окраской масляным красным (Sigma, США).
Хондрогенную дифференцировку индуцировали в среде DMEM с 6,25 мкг/мл инсулин-трансфер-рин-селенита, 0,1 мкМ дексаметазона, 0,1 мМ аскорбат-2-фосфата и 10 нг/мл TGF-pg в течение 21 сут. Детерминацию дифференцировки проводили при формировании клетками локального скопления в капле питательной среды объемом 5мкл с концентрацией 1,6х107кп/мл. Для подтверждения хондро-генной дифференцировки проводили количественную оценку экспрессии мРНК коллагена 2-го типа с помощью ПЦР в реальном времени. Контролем служили клетки, которые культивировались в течение тех же сроков в питательной среде без индуцирующих факторов.
Выделение РНК и проведение ПЦР
Выделение РНК проводили с использованием Триреагента (Sigma, США). Полученную тотальную РНК обрабатывали ДНКазой и использовали для постановки синтеза кДНК по методике производителя (Fermentas, Германия). Для определения экспрессии генов использовали специальные праймеры (табл.).
Специфичность праймеров и размеры ампликона оценивали с помощью программ Primer-3 с использованием базы данных NCBI. Размер ампликона для гена ppar-y2- 257 н, sppl - 331 н, col2a1 - 441 н, oct-4 - 1633 н, nkx2-5 - 236 н, actb - 234 н.
Праймеры, использованные для определения экспрессии генов методом ПЦР
№ п/п Наименования гена Последовательность праймера
Forward Reverse
1 ppar-y2 5TGTCAGTACTGTCGGTTTC3' 5AATGGTGATTTGTCTGTTG3'
2 sppl 5'CTAGGCATCACCTGTGCCATACC3' 5'CAGTGACCAGTTCATCAGATTCATC3'
3 col2a1 5 'AGTGGAGACTACTGGATTGA3' 5'AGTGTACGTGAACCTGCTAT3'
4 oct-4 5 'AAGCGATCAAGCAGCGACTAT3' 5'GGAAAGGGACCGAGGAGTACA3'
5 nkx2-5 5'CAAGGACCCTAGAGCCGAAAAG3' 5'CCTGCGTGGACGTGAGTTTC3'
6 actb 5'GGACTTCGAGCAAGAGATGG3' 5'AGCACTGTGTTGGCGTACAG3'
Примечание: рраг-у2 — ген кодирующий рецептор, активирующий пролиферацию пероксисом-у2; spp1 — ген остеопонти-на; со12а1 — ген коллагена II типа; пкх2-5 — ген транскрипционного фактора 1МКХ2-5; асЬЬ — ген р-актина.
Цитогенетический анализ
Осадок клеток добавляли в заранее подогретый цитрат натрия с колхицином. Инкубировали при 37°С мин, после чего центрифугировали с
трехкратной сменой метанол-уксусного фиксатора. После фиксации осадок капали на обезжиренные охлажденные стекла, выдерживали при 37°С минимум 48 ч и дифференциально окрашивали красителем Гимза с трипсином. Анализ метафазных пластинок проводили с использованием масляной иммерсии при увеличении хЮВД с использованием программы для кариотипирования Ikaros. Записывали результат согласно Международной системе классификации хромосом человека.
FISH анализ
Для проведения FISH анализа использовали крио-консервированные ММСК, полученные из плаценты новорожденных мужского пола, на третьем пассаже в количестве 2ВД тыс. клеток. Приготовление препаратов для гибридизации проводили по стандартной методике. Для гибридизации использовали зонды CEPX SpectrumGreen probe и CEPY SpectrumOrange probe (Abbot Molecular, США). Ядра окрашивали с использованием DAPI (Abbot Molecular, США). Микрохимеризм материнских клеток определяли как процент ядер с сигналами двух Х хромосом, для анализа подсчитывали 5ВД ядер. Визуализацию проводили на флуоресцентном инвертированном микроскопе Olympus IX71.
Иммуноцитохимическое иследование
Для проведения иммуноцитохимического анализа клетки высевали в 4-луночные планшеты с площадью лунки 1,9 см2 (Nunclon™ Surface, США), фиксировали и пермеабилизировали смесью метанол-ацетон в соотношении 1:1. Эндогенную перок-сидазную активность ингибировали □,3% раствором Н2О2 в течение 5 мин. Неспецифическое связывание блокировали в течение 3^ мин. при комнатной температуре с помощью □,1 М фосфатного буфера, содержащего □,5% сывороточного альбумина быков. Для детекции маркерных белков использовали мышиные моноклональные антитела к цитокератину-7 (Dako, Дания), виментину (Dako, Дания) и поликло-нальные кроличьи антитела к щелочной фосфатазе (Abcam, USA). Визуализацию иммунных комплексов проводили с использованием Mouse/Rabbit PolyVue HPR/DAB Detection System (DBS, США).
Статистическая
обработка данных
Уровень экспрессии поверхностных маркеров измеряли в процентах. Статистическую обработку проводили с использованием U-критерия Манна — Уитни.
Результаты и обсуждение
При культивировании клеток плаценты на 8—12 сут. появлялись клоны эпителиальных клеток. Кроме того, было отмечено присутствие большого количества небольших клеток с множеством отростков, экспрессирующих щелочную фосфатазу (рис. 1А). При дальнейшем культивировании образовывались клоны фибробластоподобных клеток, некоторые из которых характеризовались слабоположительной реакцией на щелочную фосфатазу (рис. 1Б).
^ -
F
* f
- \ ' i
« |Д J * ■ -
Л -1
■ф. '
« • i <. V '
Рис. 1. Культура клеток плаценты. Экспрессия щелочной фосфатазы (стрелками обозначены «позитивные» клетки): А - 8 сут. культивирования; Б - 16 сут. культивирования. Ув.: х100
Стромальные клетки плаценты на третьем пассаже in vitro продуцировали виментин. При инкубировании в течение трех пассажей содержание цитокератин-7+-клеток достоверно уменьшалось и составило 37,6% (26,6—49,4%) на 1 и 13,44% (2,5-31,1%) на 3 пассаже (n = 6, p<0,05) (рис. 2).
Методом РТ-ПЦР анализа в культуре плацентарных ММСК в течение трех пассажей была выявлена экспрессия таких генов, как sppl, ppar-y2, col2a1, nkx2-5 и oct-4 (рис. 3).
Присутствие в популяции клеток, продуцирующих виментин и цитокератин-7, вместе с экспрессией sppl и ppar-y2 может свидетельствовать о наличии клеток трофобласта в культуре ММСК плаценты. Также известно, что ММСК, полученные из яичника, экспрессируют цитокератин-7, и при культивировании в среде для эпителиальных клеток наблюдается увеличение его экспрессии, а при культивировании в среде для мезенхимальных - уменьшение, что, возможно, указывает на способность этих клеток к мезенхимально-эпителиальной трансформации [3]. Учитывая сказанное выше, можно предположить возможность мезенхимальной трансформации клеток трофобласта с образованием клонов фибро-бластоподобных клеток в культуре клеток плаценты человека.
А Б Л ' * * ' ' г. V В * ^ А Ч Г" * —' Ч * ч
■г V. < к V
' — .— Цг*т \
гг. ► * • 4 1
Рис. 2. Культура стромальных клеток плаценты: А - интактная культура [контроль]; Б - экспрессия цитокератина-7; В - экспрессия виментина. Ув.: х100
Рис. 3. Результаты ПЦР анализа кДНК ММСК плаценты 13 пассаж] с праймерами к spp1, рраг-у2, со12а1, пкх2-5, осЬ-4, асЬЬ
Цитофлуориметрический анализ стромаль-ных клеток выявил высокий уровень экспрессии поверхностных маркеров СР105, Сй73, Сй90, низкий — ^А-АВС и отсутствие гемопоэтических маркеров Сй34, СР133, Сй45, Сй14, что подтверждает данные, приведенные в литературе [4, 5]. Популяция клеток с фенотипом Сй90+/Сй73+/Сй105+/Сй34У Сй45- на 3 пассаже составила 94,7% (85,5-100%) (рис. 4).
А
Б
Рис. 4. Гистограммы экспрессии поверхностных маркеров в культуре ММСК плаценты:
А - уровни экспрессии CD90, CD105, CD73, CD14, CD34, CD45, ^А-АВС и CD133; Б - двухмерные гистограммы популяции клеток с фенотипом CD90+/CD73+/CD105+/CD34-/CD45-
Цитогенетический анализ показал, что ММСК, полученные из плаценты новорожденных мужского пола, имели нормальный кариотип (46, XY) с присутствием в среднем 1,2% материнских клеток (46, XX) (рис. 5), что противоречит данным O.V. Semenov с соавт. (2010), постулировавшим, что культуры ММСК плаценты представлены клетками только материнского происхождения [6].
Согласно литературным данным, остеопонтин экспрессируется в клетках цитотрофобласта плаценты человека. Остеопонтин, совместно с карциномо-эмбриональным антигеном (CAM-1), играет важную роль в регулировании инвазивности ворсинок хориона [7]. PPAR-y в гетеродимерном комплексе с ретиноид-Х-рецептором альфа (RXR-a) продуцируется во вневорсинчастном трофобласте и участвует в регуляции его инвазивности. При действии агонистов PPAR-y и RXR-a наблюдается ингибирование инвазии цитотрофобласта in vitro [8].
Полученные нами результаты по экспрессии nkx2-5 и oct-4, характерных для эмбриональных и сердечных стволовых клеток, согласуются с приведенными в литературе данными, где показано, что ММСК плаценты, помимо указанных выше генов, продуцируют также сердечный транскрипционный фактор GATA-4 и белки сократительной системы MLC-2a, cTnT [9].
Установленный нами сравнительно высокий уровень экспрессии гена col2a1 в стромальных клетках плаценты in vitro не описан в литературе, хотя известно, что плацентарные клетки in vivo экспресси-руют мРНК этого гена [10].
На 21-е сут. после начала индукции в остео-генном и адипогенном направлениях, при окраске ализариновым красным и масляным красным культуры плацентарных клеток были обнаружены минерализованный матрикс и жировые включения, подтверждающие дифференцировку клеток в остеогенном и адипогенном направлениях, соответственно (рис. 6).
В присутствии индукторов хондрогенеза наблюдали изменение морфологии стромальных клеток плаценты: приобретение ими формы эпителиальных клеток, формирование агрегатов (рис. 7), двухкратное увеличение уровня экспрессии col2a1 (рис. 8), что может свидетельствовать о хондрогенной диф-ференцировке.
Также при культивировании плацентарных ММСК в средах с индукторами адипогенной дифференци-ровки было отмечено увеличение уровня экспрессии ppar-y2 почти в 100 раз, по сравнению с контролем (рис. 9).
А
Б
В
Рис. 5. Результаты цитогенетического анализа стромальных клеток плаценты человека:
А - кариограмма; Б - клетки плода; В - клетки матери. Идентификация методом FISH: X хромосома - зеленый сигнал, Y хромосома - красный сигнал
Б
Рис. 6.
Культуры стромальных клеток плаценты, 3-й пассаж, 21-е сут. культивирования:
А, В - без идуцирующих дифференцировку факторов (контроль);
Б - в адипогенной среде;
Г - в остеогенной среде.
Окраска: А, Б - Oil Red O; В, Г - Alizarin Red S.
Ув.: x100
0,03
0,0115
0,025
0,02
0,015
контроль
дифференцировка
СOL2A1
Рис. 8. Уровень экспрессии гена со12а1 культурой плацентарных клеток после индукции хондрогенной дифференцировки (по сравнению с контролем).
8 0,011
о
CP с
и
S 0,0105
0,01
0,001
и 0,0005
контроль
дифференцировка
PPARg-2
SPP1
Рис. 9. Уровень экспрессии плацентарными клетками гена рраг—/2 в адипогенной и spp1 - в остеогенной культуральных средах (по сравнению с контролем). (*различия между показателями статистически значимы (р < 0,05))
0
Заметим, что увеличение экспрессии остеопон-тина (SPP1) не наблюдали, возможно, в связи с его высоким исходным уровнем. Учитывая этот факт, можно считать, что остеопонтин не может быть избран в качестве маркера остеогенной дифференцировки для плацентарных ММСК. Полученные результаты наглядно демонстрируют необходимость индивидуального подбора генов-маркеров диффе-ренцировки для ММСК разного происхождения в зависимости от исходного уровня их экспрессии.
Таким образом, стромальные клетки плаценты при культивировании в присутствии индукторов ади-по-, остео- и хондрогенеза дифференцируются в этих направлениях, однако остеогенный потенциал in vitro относительно низкий, что согласуется с данными G.A. Pilz с соавт. (2011).
Проведенные нами исследования показали, что из плаценты человека можно выделить ММСК, которые способны к адипогенной, остеогенной и хондроген-ной дифференцировке in vitro, имеют поверхностный иммунофенотип CD90+/CD73+/CD105+/HLA-ABClow/ CD34-/CD45-/CD133-/CD14-, экспрессируют виментин
и содержат минорную популяцию цитокератин-7+-клеток.
Выводы
Из плаценты человека получены стромальные клетки, которые на основе их способности к адипогенной, остеогенной и хондрогенной дифференцировке, одновременной экспрессии виментина, Сй90, Сй73, Сй105, HLA-ABC и отсутствия маркеров Сй34, Сй45, СР133, Сй14 отнесены к ММСК.
Показано, что популяция плацентарных ММСК отличается наличием фракции клеток, продуцирующих виментин и цитокератин-7, содержание которых уменьшается по мере культивирования (от 37,6 до 13 % к третьему пассажу в культуре).
Обнаружена экспрессия генов транскрипционных факторов ОСТ-4 и N1^2-5 плацентарными ММСК, характерных для эмбриональных и сердечных стволовых клеток.
Впервые выявлена экспрессия генов spp1, со12а1 и рраг-у2 в культуре плацентарных ММСК.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Parolini O., Alviano F., Bagnara G.P. et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells 2008; 26: 300-11.
2. Spitalieri P., Cortese G., Pietropolli A. et al. Identification of multipotent cytotrophoblast cells from human first trimester chorionic villi. Cloning Stem Cells 2009; 11(4): 535-56.
3. McLean K., Gong Y., Choi Y. et al. Human ovarian carcinoma— associated mesenchymal stem cells regulate cancer stem cells and tumorigenesis via altered BMP production. J. Clin. Invest. 2011; 121(8): 3206—19.
4. Bartosh T.J., Ylostalo J.H., Mohammadipoor A. et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. PNAS USA 2010; 107(31): 13724—9.
5. Maier C.L., Pober J.S. Human placental pericytes poorly stimulate and actively regulate allogeneic CD4 T-cell responses. Arterioscl. Thromb. Vasc. Biol. 2011; 31: 183—9.
6. Semenov O.V., Koestenbauer S., Riegel M. et al. Multipotent mesenchymal stem cells from human placenta: critical parameters for
isolation and maintenance of sternness after isolation. Am. J. Obstet. Gynecol. 2010; 202(193): 1-13.
7. Briese J., Oberndorfer M., Patschenik C. et al. Osteopontin is colocalized with the adhesion molecule CEACAM1 in the extravillous trophoblast of the human placenta and enhances invasion of CEACAM1-expressing placental cells. J. Clin. Endocrin. Metab. 2005; 90(9): 5407-13.
8. Tarrade A., Schoonjans K., Pavan L. et al. PPAR-y/RXR-a heterodimers control human trophoblast invasion. J. Clin. Endocrin. Metab. 2001; 86(10): 5017-24.
9. Okamoto K., Miyoshi S., Toyoda M. et al. «Working» cardiomyocytes exhibiting plateau action potentials from human placenta-derived extraembryonic mesodermal cells. Exp. Cell Res. 2007; 313 (12): 2550-62.
10. Jamieson S.E., Roubaix L., Cortina-Borja M. et al. Genetic and epigenetic factors at COL2A1 and ABCA4 influence clinical outcome in congenital toxoplasmosis. PLoS ONE 2008; 3(6): 1-13.
11. Pilz G.A., Ulrich C., Ruh M. et al. Human term placenta-derived mesenchymal stromal cells are less prone to osteogenic differentiation than bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Stem Cells Dev. 2011; 20 (4): 635-46.
Поступила 10.04.2012
