Научная статья на тему 'Культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, пуповины и плаценты отличаются по уровню экспрессии генов цитокинов, поддерживающих гемопоэз'

Культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, пуповины и плаценты отличаются по уровню экспрессии генов цитокинов, поддерживающих гемопоэз Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

CC BY
552
151
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ / ПУПОВИНА / ПЛАЦЕНТА / КОСТНЫЙ МОЗГ / ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ / MULTIPOTENT MESENCHYMAL STROMAL CELLS / BONE MARROW / UMBILICAL CORD / CHORION VILLI / GENE EXPRESSION

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Костюнина В.С., Петёвка Н.В., Потапнёв М.П.

Для оценки потенциала мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) пуповины и плаценты поддерживать кроветворение in vitro анализировали уровень экспрессии генов, вовлеченных в гемопоэз, в сравнении с ММСК костного мозга. ММСК пуповины и плаценты получали методом высева из эксплантов в присутствии сыворотки крови человека группы АВ, характеризовали по экспрессии поверхностных маркеров методом проточной иммуноцитометрии. Уровень экспрессии генов opn, scf, cxcl12, il-3, il-6, il-8, il-11, g-csf, gm-csf, epo, nes оценивали методом количественной ПЦР в реальном времени. Присутствие 5% АВ сыворотки крови человека ускоряло пролиферацию ММСК пуповины, но не плаценты. Не выявлено статистически значимых различий по распределению CD31, CD33, CD34, CD45, CD90, СD105, CD117, HLA-ABC, HLA-DR на поверхности культивированных ММСК. В ММСК пуповины значительно выше уровень экспрессии генов g-csf и il-11, а в ММСК плаценты гена nes, по сравнению с ММСК костного мозга. Уровень экспрессии гена cxcl12 в 6 раз выше в ММСК костного мозга, чем в ММСК пуповины Выявлено превышение уровня экспрессии генов opn и scf в ММСК плаценты по сравнению с ММСК пуповины Экспрессия генов il-6 и epo в культурах ММСК не различалась. Методом иммуноферментного анализа подтверждено 10-кратное превышение содержания интерлейкина-8 в кондиционированной среде ММСК пуповины по сравнению с ММСК костного мозга По уровню экспрессии генов, поддерживающих гемопоэз, ММСК плаценты имели больше отличий от ММСК пуповины, чем от ММСК костного мозга Результаты исследования могут быть использованы при экспансии и дифференцировке гемопоэтических стволовых клеток in vitro в присутствии ММСК

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Костюнина В.С., Петёвка Н.В., Потапнёв М.П.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Different expression of hematopoietic-supporting genes in cord, placental and bone marrow mesenchymal stromal cells

Human multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC) from bone marrow (BM), umbilical cord (UC) and chorion villi (CV) were isolated and cultured in xeno-free media supplemented with AB human serum There were no differences in expression of CD31, CD33, CD34, CD45, CD90, СD105, CD117, HLA-ABC, HLA-DR between BM, UC and CV MMSC Human AB serum (5%) accelerated proliferation of UC MMSC in vitro. Expression of genes opn, scf, cxcl12, il-3, il-6, il-8, il-11, g-csf, gm-csf, epo, and nes was studied in Real-Time PCR. Up-regulation the expression gene nes in CV MMSC and genes g-csf and il-11 (but 6-fold down-regulation of cxcl12) in UC MMSC, was revealed when compared to BM MMSC (p<0. 03). Expression of il-6 and epo genes in MMCS did not differ. Trend to 10-fold increased expression of gene il-8 as well as cytokine content in UC MMSC vs BM MMCS was demonstrated CV MMSC revealed more differences from the UC MMSC than from the BM MMSC in expression of hematopoietic-supporting genes (opn, scf, il-11, p<0.03). Various abilities of mesenchymal cells from human BM, UC and placenta to express hematopoietic-supporting genes had to be taken into account in application of MMCS for generation of hematopoietic stem cells in vitro

Текст научной работы на тему «Культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, пуповины и плаценты отличаются по уровню экспрессии генов цитокинов, поддерживающих гемопоэз»

культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, пуповины и плаценты отличаются по уровню экспрессии генов цитокинов, поддерживающих

гемопоэз

В.С. Костюнина 1, Н.В. Петёвка 1, М.П. Потапнёв 2

1 Республиканский научно-практический центр трансфузиологии и медицинских биотехнологий, Минск, Беларусь

2 Белорусский государственный медицинский университет, Минск, Беларусь

Different expression of hematopoietic-supporting genes in cord, placental and bone marrow mesenchymal stromal cells

V.S. Kostjunina 1, N.V. Petyovka 1, M.P. Potapnev2

1 Republic Research & Production Center for Transfusiology and Medical Biotechnologies, Minsk, Belarus

2 Belarusian State Medical University, Minsk, Belarus

Для оценки потенциала мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) пуповины и плаценты поддерживать кроветворение in vitro анализировали уровень экспрессии генов, вовлеченных в гемопоэз, в сравнении с ММСК костного мозга ММСК пуповины и плаценты получали методом высева из эксплантов в присутствии сыворотки крови человека группы АВ, характеризовали по экспрессии поверхностных маркеров методом проточной иммуноцитометрии . Уровень экспрессии генов opn, scf, cxcl12, il-3, il-6, il-8, il-11, g-csf, gm-csf, epo, nes оценивали методом количественной ПЦР в реальном времени. Присутствие 5% АВ сыворотки крови человека ускоряло пролиферацию ММСК пуповины, но не плаценты . Не выявлено статистически значимых различий по распределению CD31, CD33, CD34, CD45, CD90, CD105, CD117, HLA-ABC, HLA-DR на поверхности культивированных ММСК . В ММСК пуповины значительно выше уровень экспрессии генов g-csf и il-11, а в ММСК плаценты — гена nes, по сравнению с ММСК костного мозга . Уровень экспрессии гена cxcl12 в 6 раз выше в ММСК костного мозга, чем в ММСК пуповины Выявлено превышение уровня экспрессии генов opn и scf в ММСК плаценты по сравнению с ММСК пуповины Экспрессия генов il-6 и epo в культурах ММСК не различалась . Методом иммуноферментного анализа подтверждено 10-кратное превышение содержания интерлейкина-8 в кондиционированной среде ММСК пуповины по сравнению с ММСК костного мозга . По уровню экспрессии генов, поддерживающих гемопоэз, ММСК плаценты имели больше отличий от ММСК пуповины, чем от ММСК костного мозга Результаты исследования могут быть использованы при экспансии и дифференцировке гемопоэтических стволовых клеток in vitro в присутствии ММСК

Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, пуповина, плацента, костный мозг, экспрессия генов цитокинов

Human multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC) from bone marrow (BM), umbilical cord (UC) and chorion villi (CV) were isolated and cultured in xeno-free media supplemented with AB human serum . There were no differences in expression of CD31, CD33, CD34, CD45, CD90, CD105, CD117, HLA-ABC, HLA-DR between BM, UC and CV MMSC . Human AB serum (5%) accelerated proliferation of UC MMSC in vitro. Expression of genes opn, scf, cxcl12, il-3, il-6, il-8, il-11, g-csf, gm-csf, epo, and nes was studied in Real-Time PCR . Up-regulation the expression gene nes in CV MMSC and genes g-csf and il-11 (but 6-fold down-regulation of cxcl12) in UC MMSC, was revealed when compared to BM MMSC (p<0 . 03). Expression of il-6 and epo genes in MMCS did not differ . Trend to 10-fold increased expression of gene il-8 as well as cytokine content in UC MMSC vs BM MMCS was demonstrated

CV MMSC revealed more differences from the UC MMSC than from the BM MMSC in expression of hematopoietic-supporting genes (opn, scf, il-11, p<0.03). Various abilities of mesenchymal cells from human BM, UC and placenta to express hematopoietic-supporting genes had to be taken into account in application of MMCS for generation of hematopoietic stem cells in vitro

Keywords: multipotent mesenchymal stromal cells, bone marrow, umbilical cord, chorion villi, gene expression .

Введение

Костномозговую нишу кроветворения образуют многие типы клеток: преостеобласты, макрофаги, периваскулярные и эндотелиальные клетки, а секре-тируемые ими цитокины регулируют процессы самообновления и линейно-специфическую дифферен-цировку гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) [1, 2]. Экспрессия факторов, поддерживающих ГСК, клетками стромы активно изучается [2]. Полученные данные используются для разработки технологий экспансии и направленной дифференцировки ГСК ex vivo.

Для пролиферации и дифференцировки ГСК in vitro необходимо присутствие различных комбина-

e-mail: npet@blood . by

ций цитокинов, большинство из которых секретиру-ются стромальными клетками костномозговой ниши [3, 4]: фактора стволовых клеток (SCF), тромбопо-этина (ТРО), лиганда Fms-подобной тирозинкиназы 3 интерлейкина-3 (^-3), интерлейкина-6

(^-6), интерлейкина-11 (^-11), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), грануло-цитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), макрофагального колониестимулирующего фактора (М-CSF), эритропоэтина (Еро) и др . [5]. Нестин-экспрессирующие мультипотент-ные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга (ММСК КМ) тесно ассоциированы с ГСК [1]. Совместная культура ММСК КМ и гСК позволяет

имитировать in vitro нишу костного мозга и способствует более эффективной экспансии кроветворных клеток в сравнении с суспензионными культурами [6-9]. Межклеточные контакты ГСК с ММСК КМ важны для самообновления и поддержания ГСК в G0 фазе клеточного цикла [10].

ММСК пуповинно-плацентарного происхождения имеют преимущества для использования в клеточных технологиях по сравнению с ММСК КМ, что обусловлено их высоким пролиферативным потенциалом, безопасностью получения и меньшей вероятностью контаминации приобретёнными вирусными инфекциями ММСК пуповинно-плацентарного происхождения также способны поддерживать ГСК in vitro, однако число сравнительных исследований невелико и данные противоречивы [11-14]. В некоторых работах отмечен более низкий потенциал ММСК пуповины в поддержании долговременно репопули-рующих кроветворных клеток in vitro в сравнении с ММСК КМ [12, 13], в другом исследовании подобных различий не выявлено [14]. Экспансия CD34+ кроветворных клеток in vitro более эффективно поддерживается ММСК КМ по сравнению с ММСК Вартонова студня пуповины или ММСК хориона плаценты [11]. Наблюдаемый эффект может быть связан с продукцией стромальными клетками ключевых факторов, регулирующих пролиферацию и дифференцировку ГСК . Выявление основных различий в уровне продукции факторов, участвующих в межклеточной адгезии (Opn), оказывающих влияние на самообновление (SCF), хоуминг (CXCL12) и дифференцировку (IL-3, IL-6, IL-8, IL-11, G-CSF, GM-CSF, Epo) может способствовать оптимизации технологий экспансии и направленной дифференцировки ГСК in vitro в условиях моделирования костномозговой ниши

Профиль экспрессии генов цитокинов и адгезионных молекул, значимых для поддержания и диф-ференцировки ГСК, в культурах ММСК изучен не полностью Сравнение экспрессии генов на уровне мРНК (il-8) и белка (m-csf, vegf, lif, il-6, il-8, il-11) выявило различия между культурами ММСК пуповины и КМ [14-17]. Вместе с тем, при анализе уровней экспрессии генов g-csf, gm-csf и cxcl12 в ММСК КМ разными авторами получены противоречивые результаты [14, 15, 17-19]. Профиль экспрессии гемопоэз-стимулирующих цитокинов культурами ММСК плаценты изучен не достаточно

Цель работы - сравнительный анализ уровней экспрессии генов il-3, il-6, il-8, il-11, g-csf, gm-csf, epo, cxcl12, scf, opn, nes культурами ММСК КМ, плаценты и пуповины

Материал и методы

Получение АВ(Ш) сыворотки крови человека

Опытно-промышленную партию сыворотки крови человека группы АВ (IV) (АВ-сыворотку) получали из крови здоровых доноров ГУ «РНПЦ трансфузио-логии и медицинских биотехнологий» (Минск) после подписания ими добровольного информированного согласия . Для отделения сыворотки кровь после свертывания при 37°С центрифугировали (1500 g 20 мин . ) . Отобранную сыворотку переносили в стерильные пробирки, примесь форменных элементов крови удаляли центрифугированием в указанном выше режиме . Полученную от 6-8 доноров АВ-сыворотку объе-

диняли, стерилизовали фильтрацией через фильтры с размером пор 0,22 мкм, инактивировали при 56°С в течение 30 мин . , хранили при -80°С .

Выделение и культивирование ММСК

костного мозга, плаценты и пуповины

Культуры ММСК костного мозга (n = 4) получали и культивировали, как описано в работе S . Kosmacheva с соавт . (2011) [20], с заменой фетальной телячьей сыворотки (ФТС) на АВ-сыворотку .

ММСК пуповины и плаценты получали методом высева из эксплантов . Забор образцов пуповины (n = 7) и плаценты (n = 8) производили после нормальных физиологических родов (38—40 нед . геста-ции) после получения информированного согласия рожениц в родильном отделении ГУ «РНПЦ «Мать и дитя», г . Минск . Ворсины хориона плаценты измельчали в стерильных условиях до фрагментов размером 2—3 мм и промывали раствором Хэнкса (HyClone, США) . Культивировали экспланты в полной питательной среде а-МЕМ (Gibco, США) с 10% АВ-сыворотки и антибиотиками (100 U/мл пенициллина, Киевмед-препарат, Украина; 100 мкг/мл стрептомицина, Ки-евмедпрепарат, Украина; 100 U/мл амфотерицина В, Синтез, Россия) в атмосфере 5% СО2 . Смену питательной среды в первичной культуре производили каждые 7 сут . Выросшие in vitro плотные клеточные колонии трипсинизировали по стандартной методике [20], пересевали из расчета 1—3х103 кл/см2 и культивировали в питательной среде с 5% АВ сыворотки Аналогичным образом получали культуру ММСК из Вартонова студня пуповины

Оценка пролиферации ММСК in vitro

Клетки каждого пассажа, снятые с поверхности культуральных флаконов (Sarstedt, Германия) после обработки раствором 0,1% раствором трипсина-ЭД-ТА (Sigma, США), подсчитывали под микроскопом в камере Горяева . Время удвоения ММСК определяли по формуле:

t * log 102

/од1 0 a'

где t — время культивирования, a — исходное количество клеток, b — конечное количество клеток .

Иммунофенотипический анализ ММСК

Иммунофенотипический анализ клеток морфологически однородной культуры ММСК проводили после 2 пассажа на проточном цитометре FACScan (Becton Dickinson, США), используя программу СELLQuest Software . Панель моноклональных антител включала антитела к CD31, CD33, CD34, CD45, CD90, СD105, CD117, HLA-ABC, HLA-DR, коньюги-рованные с флюоресцеинизотиоцианатом (FITC), фикоэритрином (PE) либо фикоэритрин-цианином-5 (Pc-5) (Beckman coulter, США) В каждом образце анализировали не менее 10000 клеток .

ПЦР в реальном времени

РНК выделяли из образцов ММСК тризольным методом (Ambion, США) согласно инструкции производителя . Комплементарную ДНК (кДНК) получали методом обратной транскрипции из образцов

тотальной РНК. Состав реакционной смеси: 4 мкг РНК, 5мкМ праймера Oligo(dT18) (Fermentas, США), 0,2 мМ дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (дНТФ, Синтол, Россия), IU/мкп ингибитора РНКаз Ribolock (Fermentas, США), IOU/мкп обратной транскрипта-зы RevertAid Premium и 5Х буфер (Fermentas, США). Амплификация кДНК осуществлялась в течение 40 мин . при 55°С . Обратную транскриптазу инакти-вировали нагреванием при 85°С в течение 10 мин .

Полученную кДНК амплифицировали на приборе Mastercycler Ep Gradient S realplex 4 (Eppendorf, Германия), используя 1 мкл кДНК и 0,2 мМ дезокси-

рибонуклеотидтрифосфатов, 0,25 мкМ обратного и прямого праймеров (Праймтех, Беларусь), 0,5Х Zubr Green-1 (Праймтех, Беларусь), 0,02 U/мкл Tornado S ДНК-полимеразы и 2Х буфер (Праймтех, Беларусь). Условия реакции: предварительная инкубация при 95°С в течение 10 мин для активации ДНК-полимеразы, затем амплификация — 50 циклов: денатурация при 99°С в течение 1 с; отжиг — 60°С, 15 с; элонгация -72°С, 30 с .

Экспрессию генов g-csf, gm-csf, il-3, il-6, il-8, il-11, nes, opn, scf, cxcl12, epo оценивали с использованием праймеров, представленных в табл 1

Таблица 1. Последовательности использованных праймеров

Наименование гена Обозначение Последовательность праймеров Размер продуктов, п.н.

Глицероальдегид 3-фосфат gapdh_F CGCTCTCTGCTCCTCCTGTT 81

дегидрогеназа gapdh_R CCATGGTGTCTGAGCGATGT

Гранулоцитарный g-csf_F TAAAGACAGGGAAGAGCAGAAC 81

колониестимулирующий фактор g-csf_R CTACAGGCAGGAGAATGAAACT

Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор gm-csf_F CTCAGAAATGTTTGACCTCCAG 221

gm-csf_R TGACAAGCAGAAAGTCCTTCAG

Эритропоэтин epo_F GAGAATATCACGACGGGCTG 70

epo_R CTTTGGTGTCTGGGACAGTG

Интерлейкин-3 il-3_F GGGAAGACCAAGACATTCTGAT 97

il-3_R ATTGCTGATGCGTTCTGTAAAC

Интерлейкин-6 il-6_F GGCACTGGCAGAAAACAACC 85

il-6_R GCAAGTCTCCTCATTGAATCC

Интерлейкин-8 il-8_F GAATGGGTTTGCTAGAATGTGATA 129

il-8_R CAGACTAGGGTTGCCAGATTTAAC

Интерлейкин-11 il-11_F GCGGACAGGGAAGGGTTAAAG 92

il-11_R AGGCGGCAAACACAGTTCAT

Нестин nes_F CACCTCAAGATGTCCCTCAG 176

nes_R AGCAAAGATCCAAGACGCC

Остеопонтин opn_F CTGATTCTGGAAGTTCTGAGGAA 125

opn_R CTTACTTGGAAGGGTCTGTG

Фактор стволовых клеток scf_F GTGATTGTGTGGTTTCTTCAACA 119

scf_R ACTGCTACTGCTGTCATTCC

Фактор стромальных клеток cxcl12_F CAAGTAAGCACAACAGCCAA

cxcl12_R TGCCCTTTCATCTCTCACAA 81

Уровень экспрессии генов в ММСК был определен относительно референс-гена gapdh по методу 2-ACt [21].

Иммуноферментный анализ (ИФА) на наличие IL-8 в кондиционированной среде ММСК 2 или 3 пассажей проводили с помощью тест-системы (Вектор-Бест, Россия) в соответствии с инструкцией производителя Анализировали по три образца для каждой ткани

Статистический анализ

Все эксперименты проводили на образцах ММСК, полученных от разных доноров, анализ динамики роста культур клеток и ПЦР в реальном времени - в трех повторах для каждого образца . Данные анализировали с помощью пакета программного обеспечения Graphpad Prism 5 . Достоверность различий оценивали по U-критерию Манна - Уитни в связи с отсутствием нормального распределения полученных количественных данных и считали значимыми при р<0,05 . Взаимозависимость сопряженных показателей определяли с использованием коэффициента корреляции Спирмена

Результаты

Традиционно, при культивировании ММСК человека in vitro источником факторов роста является ксеногенная ФТС . Для терапевтического использования ММСК по современным требованиям необходимо исключить применение сывороток ксеногенно-го происхождения [22]. В связи с этим, в первую

очередь была проведена оценка эффективности получения и культивирования ММСК в присутствии АВ-сыворотки . Выявлено, что 85% образцов плаценты (n = 7) и пуповины (n = 6) генерировали колонии ММСК, и 100% образцов - в случае выделения ММСК из КМ (n = 4) При культивировании эксплан-тов ворсинок хориона и Вартонова студня в присутствии 10% АВ сыворотки колонии ММСК пуповины в первичной культуре появлялись на 8-9 сут культивирования, ММСК плаценты - на 15 сут Колонии ММСК КМ образовывались в среднем на 6 сут Из фрагментов ткани пуповины или плаценты общим объемом до 0,01 см3 при культивировании в течение трех недель в среднем получали 2,5х106 ММСК независимо от источника выделения . Из 1 мл костного мозга в среднем получали 0,5х106 ММСК первого пассажа спустя 1,5-2 нед . культивирования .

Следует отметить, что культуры ММСК плаценты чаще, чем ММСК пуповины подвергались инфицированию . В 2 случаях из 7 на 20-23-й день культивирования обнаруживали грибковую контаминацию

Одной из характерных особенностей ММСК пу-повинно-плацентарного происхождения, описываемой в литературе, является высокий пролиферативный потенциал этих клеток in vitro [23] . В проведенных экспериментах в присутствии 5% AB сыворотки при пересеве каждые 4 сут . в концентрации 3х103 кл/см2 количество ММСК пуповины увеличивалось, в среднем, в 16 раз за один пассаж, ММСК плаценты -в 5 раз . Подобные различия по скорости пролиферации между ММСК пуповины и плаценты не наблюдались при использовании 10% ФТС (рис . 1, 2) .

Рис. 1. ММСК пуповины (А, Б) и плаценты (В, Г) третьего пассажа на 5 день культивирования в среде а-МЕМ с 5% АB сыворотки крови человека (А, В) или 10% ФТС (Б, Г). Фазово-контрастная микроскопия

Рис. 2.

Динамика роста ММСК пуповины и плаценты 3 пассажа в питательной среде с добавлением 5% АВ сыворотки крови человека или 10% ФТС

В присутствии АВ сыворотки к 4—5 сут . после пересева количество ММСК пуповины увеличивалось в 4 раза (р = 0,002) по сравнению с культивированием в среде с ФТС (рис . 2) . Скорость пролиферации ММСК плаценты не изменялась при замене ФТС на АВ-сыворотку (р = 0,57) (рис . 2).

Следует отметить, что по мере культивирования ММСК пуповины, от пассажа к пассажу время удвоения плавно возрастало с 26±6 ч . на первом пассаже до 34±7 ч . на десятом, однако оставалось почти в два раза меньше, чем среднее время удвоения ММСК КМ в тех же условиях В культуре ММСК плаценты на первом пассаже время удвоения клеток составляло 30±4 ч . , а к 10 пассажу увеличивалось до 58±6 ч.

Фенотип ММСК пуповины и плаценты, культивированных в присутствии АВ-сыворотки, не имел статистически значимых отличий от фенотипа ММСК костного мозга (табл. 2) .

В ММСК плаценты и пуповины в основном присутствовали клетки с минимальным количеством гемопоэтических поверхностных маркеров (С033,

С034, С045, Сй117), в то время как 97-99% клеток популяции были положительны по маркерам С090 и С0105 . Маркер эндотелиальных клеток С031 не выявлялся в исследованных образцах ММСК (табл . 2), что согласуется с литературными данными [14, 24]. ММСК КМ, плаценты и пуповины несли антигены главного комплекса гисто-совместимости первого класса Ь^А-АВС . Антигены HLA-DR отсутствовали на поверхности ММСК пуповины и плаценты, на ММСК КМ этот антиген был представлен незначительно

Для изучения потенциала культур ММСК различного происхождения поддерживать гемопоэз была проанализирована экспрессия ряда генов, вовлеченных в регуляцию кроветворения Как видно из табл . 3, уровень экспрессии Н-6 был самым высоким, однако, аналогично еро, не имел статистически значимых отличий в ММСК из всех трёх источников . мРНК гена Н-3 выявлена не была (данные не представлены) . Для других генов были обнаружены значительные различия уровней экспрессии в ММСК из трёх источников (табл . 3) .

Таблица 2. Иммунофенотип ММСК костного мозга, пуповины и плаценты 2-4 пассажей

Поверхностный кластер дифференцировки Содержание клеток, несущих кластер дифференцировки, %

ММСК КМ П = 3 ММСК пуповины П = 4 ММСК плаценты п = 3

CD31 0,2±0,2 0,2±0,2 0,12±0,02

CD33 2±3 3 ± 6 0,38±0,01

CD34 0,2±0,2 0,3±0,5 0,2±0,1

CD45 0,5±0,3 0,4±0,2 0,3±0,3

CD90 98±2 99,7±0,1 98±2

CD105 96±4 99,3±0,8 99,88±0,05

CD117 1,1±0,6 1±2 0,7±0,6

HLA-ABC 99,2±0,7 99,85±0,06 99,8±0,1

HLA-DR 4±5 0,06±0,06 0,17±0,05

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Таблица 3. Экспрессия генов в ММСК костного мозга, пуповины и плаценты, М±а

Ген Кодируемый белок Уровень экспрессии генов относительно гена gapdh х10-5

ММСК КМ, n = 4 ММСК плаценты, n = 4 ММСК пуповины, n = 4

g-csf Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) 1,4±1,4 70±110 3400±4900*

gm-csf Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) 3,3±3,0 26±17 20±25

epo Эритропоэтин 0,6±0,5 1,2±0,5 0,8±0,5

il-6 Интерлейкин-6(^-6) 5600±3300 5700±4800 5200±4600

il-8 Интерлейкин-8(^-8) 60±80 180±280 500±350

il-11 Интерлейкин-11 (^-11) 0,03±0,02 0,05±0,04+ 0,6±0,5*

nes Нестин 17±13 940±650* 38±30

opn Остеопонтин 140±210 370±260+ 15±7

scf Фактор стволовых клеток (SCF) 170±170 130±20+ 50±30

cxcl12 Фактор стромальных клеток-1 (CXCL12) 3200±1700 1900±2000 540±200*

* — различия при сравнении с ММСК КМ статистически значимы (р<0,03); + — различия при сравнении с ММСК пуповины статистически значимы (р<0,03) .

Статистически значимые различия по уровню продукции мРНК в ММСК разного происхождения были обнаружены для генов g-csf, il-11, nes, opn, scf, cxcl12. Уровень экспрессии гена g-csf в ММСК пуповины был выше на три порядка, чем в ММСК КМ . Из табл . 3 видно, что уровень экспрессии гена il-11 в ММСК пуповины также был выше, чем в ММСК КМ и плаценты, а уровень cxcl12 — ниже, чем в ММСК костного мозга ММСК плаценты также характеризовались более высоким уровнем экспрессии генов opn и scf в сравнении с ММСК пуповины и гена nes в сравнении с ММСК КМ . Также обнаружено значительное повышение уровня экспрессии гена il-8 в ММСК пуповины и плаценты, которое в наших экспериментах не было статистически значимым Для подтверждения различий нами был проведен иммуноферментный анализ секретируемого IL-8 . В двухдневной кондиционированной среде культур ММСК КМ (n = 3), плаценты (n = 3) и пуповины (n = 3) содержание IL-8 составило 0,28±0,05 нг/мл, 1±0,6 нг/мл и 2,24±0,24 нг/мл соответственно, что коррелировало с экспрессией гена на уровне мРНК (г = 0,7; p = 0,04).

Обсуждение

Известно, что ММСК КМ могут быть использованы как для экспансии ex vivo кроветворных клеток, так и для ускорения приживления ГСК после их совместной трансплантации с ММСК [25]. Ткани пуповины и плаценты являются перспективным альтернативным источником ММСК КМ, однако, для клинического применения возникает необходимость исключения ксеногенной сыворотки крови при наращивании клеточной биомассы В некоторых исследованиях не было обнаружено достоверных различий по росту биомассы ММСК пуповины в случае применения

5% АВ-сыворотки по сравнению с 10% ФТС [26]. В то же время показано, что при использовании 10% АВ-сыворотки, ММСК пуповины проходили достоверно большее количество популяционных удвоений [27]. В наших экспериментах использование 5% АВ-сыворотки было достаточным для обеспечения трофических потребностей культур клеток плаценты, в то время как для ММСК пуповины наблюдали статистически значимое увеличение скорости прироста клеточной биомассы, что указывает на присутствие в ней медиатора(-ов), избирательно ускоряющего пролиферацию ММСК из Вартонова студня

Исходя из перспектив использования ММСК пуповинно-плацентарного происхождения вместо ММСК КМ, представляет интерес сравнительный анализ уровней экспрессии данными клетками генов, вовлеченных в регуляцию гемопоэза . Количественный ПЦР анализ выявил статистически значимые различия между ММСК КМ и плаценты только по уровню мРНК гена нестина . Повышенный уровень экспрессии гена nes в ММСК плаценты может быть обусловлен локализацией клеток в области капиллярных сосудов и кроветворной функцией плаценты в ходе эмбриогенеза [28]. Считается, что Nes+ ММСК КМ составляют группу периваскулярных клеток, тесно связанных с ранними гемопоэтическими клетками и регулирующими процессы их хоуминга и мобилизации путем секреции хемокина СХ^12 (SDF1). В костном мозге в Nes+ клетках экспрессия схс112 в 50 раз выше, чем в CD45- Nes~ клетках [29]. Однако выявленное нами более чем 50-кратное превышение уровня экспрессии гена nes ММСК плаценты в сравнении с ММСК КМ (табл . 3) не коррелировало с уровнем экспрессии ими гена схс112 (г = 0,2-0,4, р>0,05). Более того, при одинаковом уровне экспрессии гена nes в культурах ММСК КМ и пуповины, обнаружены статистически значимые

различия по экспрессии гена cxcl12 (табл . 3). Аналогичные различия на уровне секретируемого белка CXCL12 были выявлены ранее для ММСК пуповины и КМ, культивируемых в присутствии ФТС [15]. При этом наибольший уровень экспрессии CXCL12 культурами ММСК КМ, по-видимому, отражает их функциональную роль как микроокружения, удерживающего ГСК в покоящемся состоянии [30, 31].

Различия, наблюдаемые по уровням экспрессии исследованных генов между ММСК КМ и пуповины, были более существенными . Обращает на себя внимание необычайно высокий уровень экспрессии мРНК гена g-csf в ММСК пуповины . Аналогичные различия на уровне белка G-CSF в кондиционированной среде ММСК КМ и пуповины были выявлены в работе R . Friedman с соавт . (2007) [15]. В том же исследовании в колониеобразующем тесте в присутствии ММСК пуповины клетки пуповинной крови образовывали достоверно большее количество колоний гранулоцитарно-макрофагального ряда в сравнении с контролем . Обнаруженное значительное повышение экспрессии одного из важнейших стимуляторов пролиферации и дифференцировки ГСК стромальными клетками пуповины может быть обусловлено функциями цитокина, не связанными с гемопоэзом . Известно, что колониестимулирую-щие факторы индуцируют пролиферацию эндотели-альных клеток и их миграцию в место повреждения

[32]. Рецептор G-CSF и его лиганд обнаружены на плацентарных мембранах и трофобластных клетках

[33], а также в других негемопоэтических тканях плода [34]. То же относится и к экспрессии рецептора GM-CSF [35]. Некоторое увеличение уровня мРНК gm-csf в клетках пуповинно-плацентарного комплекса было выявлено нами, хотя оно не было статистически значимым

IL-6 является одним из наиболее часто используемых цитокинов для экспансии ГСК в суспензионной культуре in vitro . Показано, что он способен синергично действовать с SCF и Flt3L, стимулируя пролиферацию ГСК и приживление культивированных кроветворных клеток после трансплантации мышам линии NOD/SCID [36]. Уровень мРНК il-6 был самым высоким среди проанализированных генов и не имел статистически значимых различий в культурах ММСК как пуповинно-плацентарного, так и костномозгового происхождения . По данным ИФА секреция белка IL-6 ММСК пуповины превышала соответствующий уровень белка в супернатанте ММСК КМ не более чем в два раза [15].

IL-11 активизирует адгезию ГСК к фибронектину [37] и участвует в регуляции созревания мегакарио-цитов [38]. У человека IL-11 и его рецептор экспрес-сируются на высоком уровне в ворсинках хориона на ранних стадиях беременности [39]. Уровень экспрессии гена il-11, хотя и не был столь высоким как у генов g-csf и il-6, но был на порядок выше в ММСК пуповины, чем в ММСК КМ и в ММСК плаценты Различия были статистически значимы, однако их функциональная роль пока не ясна

Выявленные нами многократные различия по уровню экспрессии гена il-8 были подтверждены в ИФА . Концентрация провоспалительного хемокина IL-8 в кондиционированной среде ММСК пуповины в наших экспериментах составляла 2,24±0,24 нг/мл, и была на порядок выше, чем в питательной среде ММСК КМ . По литературным данным за сутки ММСК пуповины могут секретировать еще большие количества IL-8 — 10,7±5,4 нг/мл [15]. Высокий уровень IL-8 ингибирует колониеобразование кроветворных клеток . Добавление в среду рекомби-нантного IL-8 в концентрации 25 нг/мл ингибирует колониеобразование всех ростков кроветворения не менее чем на 30% [40], по другим данным на 60—70% при концентрации этого хемокина 10 нг/мл [41], тогда как добавление IL-8 в количестве <10 нг/мл не оказывало подобного действия .

Остеопонтин, участвующий в клеточной адгезии, передаче сигналов, минерализации костных тканей, хемотаксиса макрофагов и дендритных клеток, играет важную роль в регуляции поведения иммунных клеток и продукции цитокинов в плаценте [42]. Уровень экспрессии мРНК остео-понтина в ММСК плаценты, более чем на порядок превышал уровень соответствующей экспрессии в ММСК пуповины

Уровень экспрессии гена scf, продукт которого участвует в регуляции пролиферации, миграции и дифференцировки ГСК [43] и используется в подавляющем большинстве методов экспансии ГСК ex vivo, в среднем был в три раза выше в ММСК КМ, чем в ММСК пуповины, однако ни на уровне мРНК (табл. 3), ни на уровне белка [44] статистически значимые различия не выявлены

Таким образом, при сходстве распределения основных поверхностных кластеров дифференциров-ки, ММСК КМ, пуповины и плаценты различались по уровню экспрессии ими генов некоторых цитоки-нов и хемокинов, ассоциированных с гемопоэзом . При этом ММСК плаценты имели больше отличий от ММСК пуповины, чем от ММСК КМ . Обнаруженные количественные различия содержания мРНК проанализированных генов в ММСК КМ и пуповины хорошо коррелировали с полученными нами и другими исследователями данными по экспрессии соответствующих генов на уровне белка Наши дополнительные исследования выявили способность ММСК пуповинно-плацентарного комплекса оказывать влияние на дифференцировку ГСК пуповинной крови in vitro при сокультивировании [44].

Результаты исследования могут быть использованы при определении функциональной роли ММСК пуповинно-плацентарного комплекса in vivo и применении ММСК в регенеративной медицине При моделировании in vitro стромального микроокружения для экспансии и дифференцировки ГСК следует учитывать экспрессию культурами ММСК генов важнейших цитокинов и хемокинов, влияющих на самообновление и созревание кроветворных клеток.

ЛИТЕРАТУРА

1. Méndez-Ferrer S ., Michurina T . V ., Ferraro F . et al . Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche . Nature 2010; 466(7308): 829-34 .

2 . Ding L ., Saunders T. L ., Enikolopov G . et al . Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells . Nature 2012; 481(7382): 457-62 .

3 . Guerriero A ., Worford L ., Holland H . K . et al . Thrombopoietin is synthesized by bone marrow stromal cells . Blood 1997; 90(9): 3444-55 .

4 . Yasumizu R . , Toki J ., Asou H . et al . Production of hematopoietic stem cell-chemotactic factor by bone marrow stromal cells Blood 1994; 83(4): 964-71.

5 . Шаманская Т . В ., Осипова Е . Ю ., Румянцев С .А . Ex vivo экспансия гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови [обзор литературы) . Онкогематология 2012; 1: 35-45 .

6 . McNiece I ., Harrington J ., Turney J . et al . Ex vivo expansion of cord blood mononuclear cells on mesenchymal stem cells . Cytotherapy 2004; 6(4): 311-7 .

7 . Walenda T ., Bork S ., Horn P . et al . Co-culture with mesenchymal stromal cells increases proliferation and maintenance of haematopoietic progenitor cells . J . Cell . Mol . Med . 2010; 14(1-2): 337-50 .

8 . Петёвка Н . В ., Гончарова Н . В ., Северин И . Н . и др . Пролиферация и дифференцировка предшественников миелоидного ростка кроветворения пуповинной крови человека при экспансии in vitro КТТИ 2012; 7(1): 40-8 .

9 . Rodríguez-Pardo V. M ., Vernot J . P . Mesenchymal stem cells promote a primitive phenotype CD34+ c-kit+ in human cord blood-derived hematopoietic stem cells during ex vivo expansion Cell Mol Biol . Lett . 2013; 18(1): 11-33 .

10 . Jing D . , Fonseca A.V ., Alakel N . et al . Hematopoietic stem cells in co-culture with mesenchymal stromal cells-modeling the niche compartments in vitro . Haematologica 2010; 95(4): 542-50 .

11. Klein C ., Strobel J ., Zingsem J . et al . Ex vivo expansion of hematopoietic stem-and progenitor cells from cord blood in coculture with mesenchymal stroma cells from amnion, chorion, Wharton's jelly, amniotic fluid, cord blood, and bone marrow . Tissue Eng . Part A 2013; 19(23-24): 2577-85 .

12 . Liu M ., Yang S . G ., Liu P .X . et al . Comparative study of in vitro hematopoietic supportive capability of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and umbilical cord . Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi . 2009; 17(5): 1294-1300 .

13 Bakhshi T , Zabriskie R C , Bodie S et al Mesenchymal stem cells from the Wharton's jelly of umbilical cord segments provide stromal support for the maintenance of cord blood hematopoietic stem cells during long-term ex vivo culture . Transfusion 2008; 48(12): 2638-44

14 Lu L L , Liu Y , Yang S G et al Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials . Haematologica 2006; 91(8): 1017-26 .

15 . Friedman R ., Betancur M ., Boissel L . et al . Umbilical cord mesenchymal stem cells: adjuvants for human cell transplantation Biol . Blood Marrow Transplant . 2007; 13(12): 1477-86 .

16 Park C W , Kim K S , Bae S et al Cytokine secretion profiling of human mesenchymal stem cells by antibody array Int J Stem Cells 2009; 2(1): 59

17 . Wegmeyer H ., Bröske A. M ., Leddin M . et al . Mesenchymal stromal cell characteristics vary depending on their origin Stem Cells Dev. 2013; 22(19): 2606-18 .

18 Potian J A , Aviv H , Ponzio N M et al Veto-like activity of mesenchymal stem cells: functional discrimination between cellular responses to alloantigens and recall antigens J Immunol 2003; 171(7): 3426-34 .

19 . Haynesworth S . E ., Baber M .A., Caplan A. I . Cytokine expression by human marrow-derived mesenchymal progenitor cells in vitro: Effects of dexamethasone and IL-1a . J . Cell Physiol . 1996; 166(3): 585-92 .

20 Kosmacheva S , Seviaryn I , Goncharova N et al Hepatogenic potential of human bone marrow and umbilical cord blood mesenchymal stem cells . Bull . Exp . Biol . Med . 2011; 151(1): 142-9 .

21 Schmittgen T D , Livak K J Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method . Nat . Protoc . 2008; 3(6): 1101-8 .

22 Martin M J , Muotri A , Gage F Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid Nat Med 2005; 11(2): 228-32 .

23 Fong C Y , Subramanian A , Biswas A et al Derivation efficiency, cell proliferation, freeze—thaw survival, stem-cell properties and differentiation of human Wharton's jelly stem cells . Reprod . Biomed . Online 2010; 21(3): 391-401.

24 . Parolini O ., Alviano F ., Bagnara G . P . et al . Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells . Stem cells 2008; 26(2): 300-11.

25 . Isaikina Y., Minakovskaya N ., Aleinikova O . The influence of autologous marrow mesenchymal stem cell infusion on hematopoiesis reconstitution after hematopoietic stem cells autotransplantation in children with oncological and hematological diseases . Cell . Ther . Transpl . 2008; 1(1): 35-42 .

26 . Venugopal P ., Balasubramanian S ., Majumdar A. S . et al . Isolation, characterization, and gene expression analysis of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells under xeno-free culture conditions . Stem Cells Cloning 2011; 4: 39-50 .

27 . Hatlapatka T ., Moretti P ., Lavrentieva A . et al . Optimization of culture conditions for the expansion of umbilical cord-derived mesenchymal stem or stromal cell-like cells using xeno-free culture conditions . Tissue Eng . Part C Methods 2011; 17(4): 485-93 .

28 . Gekas C ., Dieterlen-Lievre F ., Orkin S . H . et al . The placenta is a niche for hematopoietic stem cells . Dev . Cell 2005; 8(3): 365-75 .

29 . Nie Y ., Han Y . C ., Zou Y . R . CXCR4 is required for the quiescence of primitive hematopoietic cells . J . Exp . Med . 2008; 205(4): 777-83 .

30 . Overstraeten-Schlögel V ., Beguin Y ., Gothot A . Role of stromal-derived factor-1 in the hematopoietic-supporting activity of human mesenchymal stem cells Eur J Haematol 2006; 76(6): 488-93

31. Bussolino F . , Ziche M . , Wang J . M et al . In vitro and in vivo activation of endothelial cells by colony-stimulating factors . J . Clin . Invest . 1991; 87(3): 986 .

32 . Uzumaki H ., Okabe T ., Sasaki N . et al . Identification and characterization of receptors for granulocyte colony-stimulating factor on human placenta and trophoblastic cells . PNAS USA 1989; 86(23): 9323-6

33 . Calhoun D .A ., Donnelly W . H . , Yan Du J . et al . Distribution of granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) and G-CSF-receptor mRNA and protein in the human fetus . Pediatr. Res . 1999; 46(3): 333-8

34 . Robertson S . A . GM-CSF regulation of embryo development and pregnancy . Cytokine Growth Factor Rev . 2007; 18(3-4): 287-98 .

35 . Ueda T., Tsuji K ., Yoshino H . et al . Expansion of human NOD/SCID-repopulating cells by stem cell factor, Flk2/Flt3 ligand, thrombopoietin, IL-6, and soluble IL-6 receptor. J . Clin . Invest . 2000; 105(7): 1013 .

36 . Wang L . S . , Liu H . J ., Broxmeyer H . E . et al . Interleukin-11 enhancement of VLA-5 mediated adhesion of CD34+ cells from cord blood to fibronectin is associated with the PI-3 kinase pathway . In vivo 1999; 14(2): 331-7 .

37 . Teramura M ., Kobayashi S ., Hoshino S . et al . Interleukin-11 enhances human megakaryocytopoiesis in vitro . Blood 1992; 79(2): 327-31

38 . Paiva P ., Salamonsen L . A ., Manuelpillai U . et al . Interleukin-11 promotes migration, but not proliferation, of human trophoblast cells, implying a role in placentation . Endocrinology 2007; 148(11): 5566-72 .

39 . Broxmeyer H . E ., Sherry B ., Cooper S . et al . Comparative analysis of the human macrophage inflammatory protein family of cytokines (chemokines) on proliferation of human myeloid progenitor cells . Interacting effects involving suppression, synergistic suppression, and blocking of suppression . J . Immunol . 1993; 150(8): 3448-58 .

40 . Corre I . , Pineau D ., Hermouet S . Interleukin-8: an autocrine/ paracrine growth factor for human hematopoietic progenitors acting in synergy with colony stimulating factor-1 to promote monocyte-macrophage growth and differentiation . Exp . Hematol . 1999; 27(1): 28-36

41. Johnson G .A ., Burghardt R . C ., Bazer F . W . et al . Osteopontin: roles in implantation and placentation . Biol . Reprod . 2003; 69(5):1458-71.

42 . Ashman L . K . The biology of stem cell factor and its receptor C-kit . Int . J . Biochem . Cell Biol . 1999; 31(10): 1037-51.

43 . Lee H . J ., Jung J ., Cho K . J . et al . Comparison of in vitro hepatogenic differentiation potential between various placenta-derived stem cells and other adult stem cells as an alternative source of functional hepatocytes . Differentiation 2012; 84(3): 223-31.

44 . Костюнина В . С ., Васина Е . В ., Петёвка Н . В . Стимулирование дифференцировки стволовых кроветворных клеток пуповинной крови in vitro мезенхимными стромальными клетками пуповинно-пла-центарного происхождения . Известия Национальной академии наук Беларуси 2015; 1: 55-8 .

Поступила: 24.09.2014

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.