CC BY
144
УДК 616-006:577.24
CHARACTERIZATION OF APOPTOSIS DETECTION METHODS AND THEIR USE IN EXPERIMENTAL AND CLINICAL ONCOLOGY
A.A. Sokolovskaya1, T.N. Zabotina1, A.A. Moskovtsev', MI. Lykashina1,
R.l. Zhdanov-, D. Yu. Blokhin1 'N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS :V.N.Orekhovich Institute of Biomedical chemistry RAMS
ABSTRACT
The most popular and widespread methods for apoptosis detection are described, and the possibility of their application in experimental and clinic oncology are demonstrated.
Key words: apoptosis. annexin V. TUNEL. Jurkat. lvmphoproliferative diseases
ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ РЕГИСТРАЦИИ АПОПТОЗА И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ ОНКОЛОГИИ
А.А. Соколовская1, Т.Н. Заботина1, А.А. Московцев', М.И. Лукашипа',
Р. И. ЖдановД.Ю. Блохин' 1ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина PAMII
-НИИ биомедицинской химии РАМН
РЕЗЮМЕ
В работе представлена характеристика наиболее популярных и широко используемых методов регистрации апоптоза, показана возможность их применения в экспериментальной и клинической онкологии.
Ключевые слова: апоптоз. Аннексии V. TUN EL. Jurkat. лимфопролиферативные заболевания
Введение
Существенный прогресс в изучении феномена апоптоза связан с возможностью его идентификации различными морфологическими, морфометрическими, иитометрическнми и биохимическими методами. Эффективность каждого из перечисленных подходов, основанных па различных принципах выявления апоп-тотических клеток, зависит от особенностей объектов исследования и поставленной цели. В зависимости от материала исследований (суспензия клеток, монослой-ная культура или гистологические срезы) можно выбирать оптимальную методику для выявления апопто-тических клеток.
Наиболее доступный и простой способ выявления апоптотических клеток и изучения их морфологических признаков—световая микроскопия. Морфологические признаки апоптоза хорошо известны: сморщивание клетки (блеббинг. зеозис). конденсация цитоплазмы и ядерного материала (карнопикноз). фрагментация ядра (кариорексис), образование компактных апоп-тотических телец. Оппсанпые морфологические призна-
ки апоптоза легко выявляются с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Некоторые из них можно обнаружить световой микроскопией после окраски по Романовскому-Г имзе, толуидиновым синим, или с помощью флюоресцентной микроскопии после окраски акридиновым оранжевым. По существу морфологические изменения возникают на поздних стадиях апоптоза и не исчерпываются фрагментацией ДНК и расщеплением хромапша на фрагменты. В то же время сходные с апоптозом морфологические изменения могут наблюдаться при механическом повреждении клеток [1].
Достаточно простым и распространенным методом регистрации апоптоза является цитофлуоримет-рический анализ окрашенных пропндий йодидом (РІ) клеточных ядер. Фенантридиновый флуорофор Р1 стехиометрически связывается с ДНК. ннтеркали-руя в двуспиральную молекулу с максимальной плотностью одна молекула красителя на 6 пар оснований ДНК. Квантовый выход флюоресценции нн-теркалировавшего в ДНК РІ на 2 порядка превышает таковой для свободной молекулы. Метод ос-
нован на феномене экстракции низкомолекулярных фрагментов ДНК из клеток в процессе их фиксирования спиртами в присутствии неионных детергентов. в результате чего фиксированные «остатки» апоптозных клеток содержат меньшее количество ДНК (гиподиплоидные клетки), чем «остатки» ин-тактиых клеток, соответственно связывают меньше PI и флюоресцируют с меньшей интенсивностью, что регистрируется на гистограмме флюоресценции левее области диплоидных клеток.
Во время апоптоза под действием эндонуклеаз происходят многочисленные разрывы нитей ДНК и образуется множество ее свободных 3 - и 5'- концов. С использованием фермента терминальной дсзоксииукле-отидил-трансферазы (TdT) к каждому свободному 3'-коццу можно ковалентно присоединить дезокснуридии-трифосфат (dUTP). меченный флюоресцентным красителем F1TC. Таким образом, количество присоединившейся метки будет пропорционально количеству свободных 3 -концов, те. количеству внутрннитевых разрывов ДНК. Описанный метод (TUNEL — TdT-mediated dUTP nick end labeling) может применяться для количественного анализа клеточных суспензий методом проточной цитофлуориметрни [2]. Этот же метод хорошо адаптирован для выявления апоптотпчес-ких клеток в гистологических препаратах [3:4]. Высокая чувствительность метода позволяет регистрировать начальные стадии апоптоза. когда в клетках еще слабо выражены его морфологические проявления [5]. В то же время некоторые исследователи считают, что этот метод не всегда позволяет обнаружить единичные разрывы ДНК. характерные для ранних этапов апоптоза, а только финальную межнуклеосомную фрагментацию ДНК. типичную для поздней стадии апоптоза [6] Другие полагают, что основной недостаток метода связан с артефактпым выявлением TUNEL-позитивных некротических клеток [7].
Уникальным событием в апоптотических клетках являются биохимические изменения в фосфолигшдном бислое плазматической мембраны клетки. В нормальных клетках фосфолипиды асимметрично распределены между наружной и внутренней поверхностями плазматической мембраны. Фосфатпдилхолнн н сфин-гомиелии расположены па внешней поверхности липидного бислоя, а фосфатндилсернн (PS) — на внутренней. Установлено, что перемещение PS (экстер-нализация. флнппинг) на внешнюю сторону плазматической мембраны происходит па ранних стадиях апоптоза [8: 9; 10]. Такое перемещение можно выявить с помощью антикоагулянтного белка Анпекси-па V. который высоко специфично связывается с отрицательным зарядом PS с высокой степенью сродства. Показано, что специфическое связывание Аннексина V с клеточной мембраной может происходить до фрагментации ДНК [11]. Как утверждают другие авторы, связывание Аннексина V не всегда предшествует фрагментации ДНК [12]. Таким образом, эк-стернализация PS и фрагментация ДНК - не взаимо-связаш!ые процессы. Конъюгат Аннексина V с F1TC или фикоэритрином (РЕ) успешно используется для выявления апоптотических клеток с помощью флюоресцентной микроскопии и проточной цитофлуори-
метрин [9: 13]. Так как при некротическом механизме клеточной гибели вследствие перфорации мембраны возможно проникновение Аннексина V внутрь клетки и связывание его с PS внутреннего липидного слоя, предложено использовать сочетание Аннексина V с витальными красителями, такими, как PI или 7-Amino-actinomycin-D (7-AAD). Апоптотические клетки начинают взаимодействовать с Аннексином V после того, как произошла конденсация хроматина, но до утраты плазматической и ядерной мембранами способности ограничивать проникновение Р1. В результате живые клетки не окрашиваются ни Аннексином V. ни PI. Апоптотические клетки с неповрежденной мембраной окрашиваются только Аннексином V. а поздние апоптотические и/или некротические клетки — Аннексином и V. и PI. Таким образом, прижизненное окрашивание апоптотических клеток Аннексином V в комбинации с PI позволяет одновременно определить интактные клетки (отрицательные и по Аннексину. и по PI); клетки, находящиеся в апоптозе (положительные по Аннексниу V, но отрицательные по PI); и клетки, находящиеся в позднем апоптозе или некрозе (положительные и по Аннексину, и по PI). К ограничениям метода выявления апоптотических клеток с помощью Аннексина V следует отнести невозможность использовать образцы фиксированных клеток или гистологические препараты.
В последние годы особый интерес представляє! выявление и идентификация апоптотических клетої^ до и на фоне применения лекарственной терапии \ пациентов с опкогематологическими заболеваниями. Наиболее доступным методом in vivo считакл определение апоптотических клеток по их морфологическим критериям. Морфологические изменение можно обнаружить в клетках, полученных из крові или тканей больного. Однако основные проблемь выявления апоптотических клеток in vivo обуслов лены главным образом их быстрым разрушением t фагоцитозом [14]. В связи с этим возникла необходимость применения быстрых количественных ме тодов оценки апоптотических клеток, циркулирую ших в периферической крови и костном мозге. Ме тод проточной цитофлуориметрни позволяет быст ро и количественно регистрировать клетки с гипо диплоидным содержанием ДНК, характерным длі апоптотических клеток после их окраски РІ. Этс метод хорошо адаптирован для исследования спон тайного и индуцированного апоптоза клеток крові или костного мозга больных различными онкогема тологическими заболеваниями [15].
Материалы и методы
Объекты и методы исследования
В работе использована линия клеток Jurkat (Т-лим фобластная линия человека). Клетки культивировалі в среде RРМI-1640. содержащей 10% телячьей эмбри опальной сыворотки и антибиотики. 10 мМ HEPES pH 7,3, при 37°С в атмосфере 5"/» СО,. Клетки поддер живали в логарифмической фазе роста постоянны\ пассированием культуры через каждые 2-3 дня.
В зависимости от методов регистрации апоптоз; клетки инкубировали в плоскодонных 96- или 24-лу
ночных планшетах (Falcon 3072. Becton Dickinson) в присутствии различных концентраций исследуемых препаратов в течение различных интервалов времени, при 37°С и 5%-ным содержании СО,. Контролем служили интактные клетки, которые инкубировали в тех же условиях, по в отсутствии препаратов. В работе использованы: доксорубинин (Институт по изысканию новых антибиотиков РАМН. Москва), этопозид (лекарственная форма фирмы NIPPON KAYAKU СО, Япония, торговая марка «Lastet»), цисплатии и циклоплатам (лаборатория разработки лекарственных форм. НИИ ЭДиТО, ГУ РОНЦ). Все препараты растворяли в среде RPMI-1640 ex tempore.
Для определения спонтаппого апоптоза и апоптоза, измеряемого до или в процессе проведения курса химиотерапии. использовали образцы крови или костного мозга. а также парафинированные блоки трепанбиоптатов костного мозга больных онкогематологическими заболеваниями, находившихся на стационарном лечении в ГУ РОНЦ РАМН. МОНИКИ и в ГНЦ РАМН.
Срезы толипшой 4 мкм изготовляли на санном микротоме (Reichert. Австрия), наносили на стекла, обработанные «Histogrip» («Zymed», San Francisco) и просушивали при температуре 37°С в течение двух суток.
Определение апоптотических клеток по окрашиванию ДНК пропидий йодидом ( PI)
Апоптотические клетки определяли по методу Nicoletti Г[16]. Клетки в количестве 2,5 х 105 промывали в PBS. ресуспендировали в охлажденном 70 %-ном этаноле и хранили при 4"С. Перед реакцией окрашивания клетки осаждали центрифугированием (7 мин. 500 об/мин). Осевшие клетки осторожно ресус-пендировали в 1 мл гипотонического раствора, содержащего 5 мкг/мл PI, 0.1% натрия цитрат: 0,1%Тритон Х-100 и инкубировали в темноте в течение 15 мин при 4 С. Суспензию клеток, окрашенных PI, без дальнейшего отмывания анализировали методом проточной цитофлуорнметрии.
Выявление апоптотических клеток методом TUNEL
Апоптоз методом TUNEL определяли с использованием коммерческого набора (In Situ Cell Death Detection Kit. Fluorescein, Boerhringer-Mannheim. Германия) по описанной в руководстве методике для анализа методом проточной цитофлуориметрии.
После инкубации с противоопухолевыми препаратами клетки 2 раза отмывали в PBS/1%BSA и доводили до концентрации 1-2 млн в мл. Клеточную суспензию переносили в V-образную 96-^уночную плашку и фиксировали в 4 %-ном растворе формальдегида 30 мни при комнатной температуре. Затем клетки отмывали и ресуспендировали в 100 мкл пермеабнлизи-рующего раствора (0.1 % Triton Х-100 в 0.1 % цитрата натрия) 2 мин при 4ÖC.
Метили клетки с использованием TUNEL-реакци-онной смеси, содержащей терминальную дезоксинук-леотид- трансферазу (TdT). нуклеотидный субстрат (dUTP). меченный флюоресцентным красителем ( FITC), в реакционном буфере. Дважды отмытые клетки ресуспендировали в реакционной смеси TUNEL и инкубировали в течение 60 мин при 37“С во влажной
атмосфере. Дтя анализа методом проточной цитофлу-орометрии отмытые клетки ресуспендировали в 250-500 мкл в PBS. Негативный контроль использовался в каждом эксперименте. Для этого клетки ресуспендировали в реакционной смеси без TdT.
Выявление апоптотических клеток методом двойного прижизненного окрашивания с использованием Аннексина V-F1TC в комбинации с PI
После инкубации с препаратами клетки дважды отмывали в холодном PBS и ресуспендировали в «связывающем» буфере (140 гаМ NaCl, 2,5 тМ СаС1,; 10 шМ HEPES/NaOH) в концентрации 1 х 10‘ клеток в мл. Аликвоты, содержащие 1 х 10* клеток в 100 мкл клеточной суспензии переносили в 5-мл пробирку и окрашивали 10 мкл пропидий йодидом (5 мкг/мл) и 5 мкл 100 мкг/0.5мл) Аннексина V. меченного FITC. Клетки смешивали на вортексе и инкубировали 15 мин при комнатной температуре в темноте. Для анализа методом проточной цитофлуориметрии к клеткам добавляли 400 мкл «связывающего» буфера.
Дтя анализа апоптотических клеток методом флюоресцентной микроскопии к суспензии окрашенных клеток в количестве 30 мкл добавляли 50 %-ный глицерин, переносили на предметное стекло и накрывали покровным стеклом. Окрашенные Аннексином V-FITC и PI клетки оценивали по следующим критериям: ннтакт-ные (живые) клетки не связывают ни Аннексии V-F1TC, ни PI; ранние апоптотические клетки связывают Аннексии V-FITC. имеют зеленую флюоресцентно по периферии; поздние апоптотические и/или некротические клетки — клетки, позитивно окрашенные двумя красителями: интенсивная зеленая флюоресценция по периферии и интенсивная красная флюоресценция ядер или их фрагментов.
Клеточные препараты оценивали с помощью флюоресцентного микроскопа («Axioscope 20». Carl Zeiss lena, Германия) при оптическом увеличении х 800. с использованием системы пропускающих и запирающих светофильтров для FITC/TRITC. Захват видеоизображения осуществляли с использованием цифровой камеры 3-CCD (SONY М. Япония). Обработку и анализ изображений проводили с помощью программного обеспечения KS-100 Adobe Photoshop.
Выявление апоптотических меток на гистологических срезах методом TUNEL Иммунофлюоресцентное окрашивание
Посте стандартной процедуры депарафинизации срезы инкубировали с протеиназой К (20мкг/мл в ЮтМ Tris/HCl pH 7.4— 7,8) во влажной камере в течение 30 мин при температуре 37°С. Далее срезы 2 — 3 раза в течение 15 мин отмывали в PBS (pH 1,2-1 А), наносили реакционную смесь TUNEL по 50 мкл и инкубировали во влажной камере 60 мин при температуре 37°С в темноте. Негативным контролем служили срезы, обработанные реакционной смесыо нуклеотидов без терминальной трансферазы. Образцы отмывали в PBS в течение 15 мин и докрашивали Hoechst 33342 в PBS (из расчета 2 мкг на срез) и инкубировали в течение 2 мин при комнатной температуре. Снова отмывали и покрывали нефлюоресиируюшей средой (50".>-ный
глицерин в PBS). Препараты оценивали на флюоресцентном микроскопе («Opton». Германия) при оптическом увеличении 400. Для образцов, окрашенных FITC. использовали голубой фильтр (длина волны возбуждения 450-500 пш. длина волны эмиссии 515-565 пт). Образцы, окрашенные Hoechst 33342. просматривали под УФ-фильтром (длина волны возбуждения 365 пт. эмиссия 480).
В каждом случае препараты оценивали по 2 показателям. При возбуждающем УФ-свете регистрировали голубую флюоресценцию ДНК-содержаших фрагментов клеточных ядер, окрашенных флуорохромом Hoechst 33342. Зеленая флюоресценция (FITC) тех же фрагментов свидетельствовала о наличии в этих ядрах нитевых разрывов ДНК (окрашивание TUNEL); такие клетки учитывали как апоптотические. При отсутствии зеленой флюоресценции (FITC) клетки оценивали как иптактные. Образцы фотографировали с использованием фотомикрографической камеры MC 63 (Германия) на фотопленку фирмы Kodak. Иммупопсроксидазное окрашивание
Для исключения неспецифического связывания де-парафниированные срезы инкубировали с 3% BSA + 20° нормальной козьей сыворотки при комнатной температуре в течение 30 мил. После этого проводили стандартную процедуру окрашивания реакционной смесью TUNEL и инкубировали во влажной камере 60 мин при температуре 37°С в темноте. Негативным контролем служили срезы, обработанные реакционной смесью нуклеотидов без терминальной трансферазы. Образцы отмывали в PBS. наносили «ан-тпфлюоресцеиновый» пероксидазный конъюгат POD и инкубировали 30 мин при 37°С. Для проявления пе-роксидазной реакции срезы инкубировали с раствором хромогенного субстрата 5.5-диаминобензиднном (DAB. DAKO. Германия), предварительно разведенным в соотношении 1:100, и отмывали в дистиллированной воде. Срезы докрашивали гематоксилином, высушивали и заключали в канадский бальзам. Препараты анализировали па световом микроскопе «Axiolab» (Karl Zeiss lena. Германия). Положительными считали клетки с различной степенью перокси-дазной окраски ядер (бурый цвет). Количество положительных клеток по отношению к общему числу окрашенных гематоксилином оценивали в 5 полях зрения. Образцы фотографировали цифровым фотоаппаратом. с последующим анализом компьютерного изображения в программе «Adobe Photoshop».
Результаты » обсуждение
Метод проточной цитофлуорнметрин позволяет регистрировать клетки с ДНК. окрашенной РГ. Известно, что различные фазы клеточного цикла отличаются по содержанию в клетках ДНК. В GJG-^азе клеточного цикла клетки имеют диплоидное содержание ДНК (2С). в S-фазе содержание ДНК увеличивается от 2С до 4С. и в G./M клетки имеют тстраплондное содержание ДНК (4С). Гистограмма распределения интактных клеток несинхронизированной популяции по содержанию ДНК имеет форму двух обособленных пиков (G/G и G,/M — фазы соответственно), сопряженные переходной зоной (S-фаза). Снижение содер-
жания ДНК ниже диплоидного регистрируется на гистограмме в виде добавочного npe-G, пика (гиподип-лоидные клетки). Доля клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК является количественным критерием интенсивности процесса апоптоза. Главный недостаток метода — невозможность выявлять апоптотические клетки, находящиеся в S- и G,/M. В то же время механически поврежденные клетки могут быть ошибочно оценены как апоптотические.
На модели культивируемых клеток Т-лимфоблас-тной линии Jurkat исследованы особенности индукции апоптоза противоопухолевыми препаратами в зависимости от'дозы и времени инкубации.
Проведенные исследования показали, что все препараты. в зависимости от их концентрации в среде и времени инкубации, индуцировали апоптоз.
На рис.1 представлены гистограммы распределения клеток после инкубации с противоопухолевыми препаратами в течение 24 и 48 ч. По оси X отображена интенсивность флюоресценции, по оси Y - число событий (клеток). В контроле на гистограммах распределения интактных клеток, окрашенных PI. наблюдается типичная для пролиферирующей клеточной популяции картина. Видны два хорошо разрешенных пика, соответствующих диплоидному (Gj-фазы клеточного цикла) и тетраплоидному (GyM-фазы) содержанию ДНК. Между этими пиками гистограммы обнаруживается пул S-фазных клеток (фаза синтеза ДНК), Сниженное (ги-подиплоидное) содержание ДНК регистрируется шггоф-луориметром в виде добавочного пика npe-G. (на гистограммах обозначено маркером М1). В контроле количество клеток в пике М1 соответствует уровню спонтанного апоптоза. После инкубации клеток с противоопухолевыми препаратами доля погибающих клеток в пике М1 увеличивается в зависимости от концентра-шш препарата или времени инкубации.
Идентификация апоптотических клеток чаше всего ограничивается применением описанного метода. В наших исследованиях в дополнение к этому был использован метод TUNEL. Его высокая чувствительность позволяет регистрировать апоптотические клетки с ранней фрагментацией ДНК, когда в клетках еше слабо выражены морфологические проявления апоптоза. Использованные нами в настоящем исследовании препараты индуцировали прогрессивную фрагментацию клеточной ДНК через 24 ч.
На рис.2 даны гистограммы флюоресценции интактных клеток Jurkat после инкубации с препаратами. Накопление клеток с фрагментированной ДНК отражается смещением пика на гистограммах вправо либо появлением дополнительного пика, расположенного правее интактного контроля. При этом площадь пика, выходящая за профиль пика флюоресценции интактного контроля, соответствует доле клеток, содержащих фрагментированную (по сравнению с контролем) ДНК. а положение дополнительного пика (медиана флюоресценции) — степень фрагментации ДНК.
В своих исследованиях мы использовали также метод прижизненного двойного окрашивания клеток Ан-нексином V-FITC (экстернализация PS) в комбина-ции с PI (накопление в ДНК при разрушении клеточной и ядерной мембраны), он позволяет выявлять поиуля-
--------------------
Ш/ТОМ2/2003
№3/том2/2003 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
О
О
о
о
Ої
2
н
5
=с
Конт о о ль 48 ч 7%
ДоксорубицинО,! мкгЛлп
23%
^—С—IV
ДоксорубицинО,5 мкг/мп
44% і
Л
^-------------Г?----------Г “V
Контроль 24
Контооль 48 ч 10%
> "11
Этопссил 1 МКГ/МП
23%
Этопозип 5 мкг/мп
42% 66%
Конт о о ль 24
12% 8% !.
■ *"'1]
?пГТіГ> °< і—.и ^
Контроль 48 ч
Цисппатин 3 мкг/мп
Цисппатин 12 мкг/мп
И нте н с и в н ост ь (|) J і юо рес це н ц и и
І’нс. 1.1 нею граммы распределения Juгkat-клcтoк после инкубации с противоопухолевым»! иренара гамн в течение 24 и 48 ч
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИОТЕРАПИЯ
Интенсивность флюоресценции
Рис. 2. Гистограммы интенсивности флуоресценции клеток Jurkat (окрашиваниеTUNEL) после инкубации с проти-воопухолевыми препаратами
Контроль 24 ч
<1
i • 1
77JH * 4.2 И - ^
Этопозид 5 мкг/мл
Этопыид 10 мкг/мл
I-
Анксгслк V-FITC
Ахнегаас V-F1TC
*• i.»1,' /•* 17,2 И
20,2 Н ■ зз.: н
". t 58,2 И
7,2 Yi М ■ * : ; «al ¿Ж П.2 Н
Рис. 3. Этонозил-ипдунированпый шишки клеток Jurkat. регистрируемый методом двойною прижизненного окрашивания клеток с помощью Аннексипа V-FTTC в комбинации с PI
ции клеток на разных стадиях апоптоза. С этой целью клетки после инкубации с препаратами окрашивали Аннексином V-FITC в комбинации с PI и количест венно оценивали методом проточной цитофлуориометрии. Клетки Jurkat инкубировали с доксорубицином (0.5 мкг/мл), циклоплатамом (5.0 и 20 мкг/мл). циспла-тином (3.0 и 12 мкг/мл) и этопозидом (5 и 10 мкг/мл).
На рис.З приведены результаты одного из экспериментов по изучению дозовой зависимости этопознд-индуцированного апоптоза через 24 ч инкубации. В режиме «dot plot» (правая панель) по оси X (FL-1) расположены клетки, окрашенные Аннексином V-FITC, по оси Y (FL-2) — клетки, окрашенные PI. В левом нижнем квадранте локализованы живые интактные клетки, негативно окрашенные по Аннексину V-FITC и по PI (F1TC-/P1-). в правом нижнем квадранте—ранние апоптотические клетки, положительные по Аинексн-пу V-FITC и отрицательные по PI (FITC+/P1-). в верхнем правом квадранте—предположительно некротические или позлзше апоптотические клетки, позитивно окрашенные и по Аннексину V-FITC. и по PI (FITC+/PI+). Видно. что в ннтактном контроле количество живых клеток составляет 77,8 %, ранних апоптотических клеток —
4.2 %, а условно некротических или поздних апопто-тическнх клеток — 9.5 %. После инкубации клеток с этопозидом (5,0 мкг/мл) популяция живых клеток уменьшается до 20.2 %. тогда как популяции ранних и поздних апоптотических клеток увеличиваются до
33.2 % и 37,2 % соответственно. При увеличении дозы до 10 мкг/мл количество живых клеток уменьшается до 7.2 %. количество ранних апоптотических клеток практически не изменяется, по количество клеток в позднем апоптозе увеличивается до 58.2 %. На левой
РОССИЙСКИЙ биотерапевтический журнал
№3/том2/2003
г
—
панели — гистограммы распределения клеток: по оси X отображена интенсивность флюоресценции по Ан-нексину У-РГГС. по оси У — число событий.
Одновременно признаки апоптоза оценивали качественно с помощью флюоресцентного микроскопа. Клетки, окрашенные Аннексином У-РГГС и Р1. идентифицировали по 3 критериям, как описано в разделе «Материалы и методы». На рис. 4 (на цветной вкладке) представлена флюоресцентная микроскопия клеток .1игка1 после их инкубации с этопозидом (10 мкг/ мл, 24 ч) и окрашенных Аннексином У-РГГС в сочетании с Р1. Указанные красители не проникают в интак-тные. поэтому виден только их слабый контур (см. рис. 4, Л), на этой же фотографии — ранняя апоптотичес-кая клетка с зеленой флюоресценцией на поверхности мембраны клеток. На рис.4 В видна апоптотическая клетка с зеленой флюоресценцией на поверхности мембраны клеток и с окрашенным ядром, на рис.4 С хорошо просматривается образование апоптотических телец с красной флюоресценцией, на рис.4 О — некротическая клетка с красной флюоресценцией ядра и зеленой флюоресценцией на мембране клеток. Аналогичные результаты получены при анализе клеточных популяций после инкубации с другими цнтостатнками.
Таким образом, микроскопия клеток, окрашенных Аннексином У-РГГС и Р1, подтвердила, что противоопухолевые препараты вызывают в клетках типичные морфологические и биохимические изменения, характерные для различных этапов процесса апоптоза.
Нами были исследованы образцы периферической крови и костного мозга 83 онкогематолог ическнх боль-
я D
30% J1
J J
V 10' ÍP* П* 10*
Интенснвность флюоресценции
Рис. 5. Гнсгограммы распределения клеток, выделенных из периферической крови больного ХЛЛ до (А) н на фоне лечения (В).
Г нсгограммы распределения клеток, выделенных из костного мозга больного ОЛЛ до лечения (С) и на фоне (Б) лечения предннзолоном. Анализ поРІ
иых. При этом 37 были обследованы до и на фоне лечения. Уровень апоптоза в популяции лейкозных клеток оценивали по выявлению клеток С П1ПОДИПЛОИД-ным содержанием ДНК (окрашивание Р1). Анализ спонтанного и шщуцнрованного апоптоза клеток крови и костного мозга онкогематологической патологией показал, что при некоторых формах лимфопролиферативных заболеваний (ОЛЛ — острый лимфобластный лейкоз, ХЛЛ — хронический лимфоцитарный лейкоз) индукционная терапия способствовала статистически значимому увеличешпо доли апоптотических клеток по сравнению с уровнем спонтанного апоптоза. обнаруживаемым в дебюте заболевания. На рис.5 даны гистограммы распределения клеток, выделенных из периферической крови больного ХЛЛ до и на фоне лечения, а также гистограммы распределения клеток, выделенных из костного мозга больного ОЛЛ до н на фоне лечения предннзолоном.
На сегодняшний день принято считать, что сочетание нескольких методов исследования апоптоза, основанных на различных принципах выявления апоптотических клеток, позволяет более информативно судить о процессе апоптоза.
Так, с помошью метода TUNEL в сочетании с окрашиванием ДНК бисбензпмидом Hoechst 33342 можно одновременно идентифицировать апоптотпческие клетки, позитивно окрашенные по двум параметрам [17]. Протокол окрашивания клеток флуорохромом Hoechst 33342 в сочетании с методом TUNEL был адаптирован нами применительно к трепанбиоптатам костного мозга больных мнелодпспластическим синдромом (МДС). Апоптотпческие клетки идентифицировали методом флюоресцентной микроскопии. В каждом случае препараты оценивали по двум показателям. При возбуждающем УФ-свете регистрировали голубую флюоресценцию ДНК-содержаших фрагментов клеточных ядер, окрашенных флуорохромом Hoechst 33342. Зеленая флюоресценция (FITC) тех же фрагментов свидетельствовала о наличии в этих ядрах нитевых разрывов ДНК (окрашивание TUNEL); такие клетки учитывали как апоптотпческие. При отсутствии зеленой флюоресценции (F1TC) клетки оценивали как интактные. На рис.6 (на цветной вкладке) показан трепапоби-оптат больного МДС посте окрашивать методом TUNEL в сочетании с Hoechst 33342.
Одиако данная методика не позволяет определить. к какому ростку кроветворения относятся клетки, идентифицированные как апон готические. Поэтому мы применили также метод TUNEL с пероксидазным колорометрическим окрашиванием и докрашиванием гистологическими красителями. позволяющими одновременно с визуализацией TUNEL-позитивных клеток оценить их морфо-r истогенетические характеристики. По гистологическому заключению было выявлено, что у больных МДС апоптотпческие клетки в большей степени представлены молодыми клетками миелоидного ряда, в меньшей степени — клетками эритроидного ряда, что соответствует литературным данным [18; 19]. На рис.7 (на цветной вкладке) виден образец трепанбиоптата больного острым нелнмфобластным лейкозом (ОНЛЛ)
из контрольной группы и больного рефрактерной анемией (РА) в дебюте заболевания.
Таким образом, проведенные исследования апоп-тоза лейкозных клеток пациентов с онкогематологи-ческнмн заболеваниями подтверждают литерату рные данные о том. что при некоторых формах гемобласто-зов индукционная терапия инициирует гибель лейкоз-пых клеток по механизму апоптоза [15; 20]. Идентификация апоптотическнх клеток методом TUNEL с пероксидазным окрашиванием на трепанбиоптатах костного мозга больных МДС позволяет не только выявлять апоптотические клетки, но и оценивать морфологическую картину и определять, к какому ростку гемопоэза о!ш относятся.
Применение различных протоколов метода TUNEL подтверждает феномен апоптоза клеток костного мозга при МДС. Методы идентификации апоптоза могут быть использованы для качественной и количественной опенки эффективности назначаемой терапии опкогематологнческим больным.
Были представлены основные in большого разнообразия существующих на сегодняшний день методов идентификации апоптотическнх клеток. Идентификация программированной клеточной гибели различными методами позволяет количественно или качественно оценить способность разнообразных индукторов инициировать апоптоз клеток. Каждый из методов имеет свои области применения, преимущества и недостатки. Выбор комплекса методов регистрации апоптоза в значительной степени зависит от объекта исследования, апоптоз-нпдуцнруюшнх агентов и стадии развития апоптоза.
ЛИТЕРА ТУРА
1. Falcieri Е. Martclli AM, Bareggi R el al The protein kinase inhibitor staurosporine induces morphological changes typical of apopiosis in MOLT-4 without concomitani DNA fragmentatiuon II Biochem Biophys Res Com. — 1993. — Vol. 193. —P. 19-23.
2. Gavrieli Y. Sherman Y. and Ben Sasson S. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation// J. Cell Biol. — 1992. — Vol. 119. — P.493-501.
3. Labat-Moleur F., Guillcrment C.. Larmier P TUNEL apoptic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement II The Journal of Histochemistrv & Cytochemistry. — 1998. — Vol 46 (3). — P. 327-334.'
4. Negoescu A.. Lorimier P Labat-Moleur F et al. TUNEL: Improvement and evaluation of the method for in situ apototic cell identification // BIOCHBMICA. — 1997. — № 2.
5. Gorczyca W.. GongJ.. Darzynkiewicz Z.. Dctcction of DNA strand breaks individual apoptotic cells by the in situ by the terminal deoxynuclcotidyl transferase and nick translation
assays//Canccr Res. — 1993. — Vol. 52. —P 1945-1951.
6. Godard T.. Deslandes E . LebaUly P. et al. Early detection of staurosporine-induced apoptosis // Histchem. Cell Biol. — 1999.— Vol. 112— P. 155-161.
7. Labat-Moleur F. Guillerment C., Lorimier P TUNEL apoptic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement II The Journal of Histochemistrv & Cytochemistry. 1998. — Vol. 46 (3). — P. 327-334.'
8. Fadok V.A.. Voelker P.A., Campbell J.J. et al. Exposure of phosphatidylethanol-amine on the surface of apoptotic cells // Exp. Cell. Res. — 1992. — Vol. 232. — P. 430-4.
9. KoopmanG.. RcutelingspergerC.P.M.. KuijtenG.A.M.. Kcehnen R.M.J. Pals S. T & van Ors M.H.J. Annexin V for Flow Cytometric Detection of phosphatidylserine exspression on B celis undergoing apoptosis // Blood. — 1994. — Vol. 84, —P. 1415-1420.
10. KuypersFA.. Lewis R A.. Hua M.. Schott M A , Disclier D.. Ernst J D. & Lubin B H Detection of altered membrane phospholipid asymmclrx in subpopulations of human red blood cells using fluorescentlv labeled Annexin V // Blood.
— 1996 Vol. 87. — P 1179-1187.
11. Van Engelaiul M.. Nielanil L ./.. Ramaekers F C. Schulte B.. and Rcutelingsperger C. P Annexin V-affinily assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure II Cytometry. — 1998. — Vol. 31. — P. 1-9.
12. BuscoZ.. Everson B.R. and Eluason J. The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highlv fragmented // Cancer Research. — 2000. — Vol. 60. — P. 4623-8.
13. Vermes 1. Haanen C. Steffens-Nakken H . Rcutelingsperger C. A novel assay for apoptosis: flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V //J Immunol Methods.
— 1995. —Vol. 184. — P 39-51.
14 Savill J , Fadok V., Henson P and Haslett C Phagocyte recognition of cells undergoing apoptosis // Immunol Today. — 1993. — Vol. 14. — P. 131-6.
15. Tsangaris G.T.. Moschovi M.. Mikraki V. et al. Study of apopiosis in peripheral blood of patients with acute lumphoblastic leukemia during induction therapy. // Anticancer Research.-1996. — V 16. P 3133-3140.
16. Nicoletti I. Migliorati G.. Pagliacci M C. el al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. II J Immunol Methods. — 1991. — V. 139. — P. 271-280.
17. Whiteside G. and Munglani R TUNEL. Hoechst and immunohistochemistry triple-labeling: an improved method for detection of apopiosis in tissue sections — an update // Brain Research Protocols. — Vol. 3. — P 52-3.
18. RazaA.. GescrS.. Mundle S. et al. Apoptosis in bone marrow biopsy samples involving stromal and hematopoietic cells in 50 patients with myelodvsplastic svndromes II Blood. — 1995. — Vol 86. — P 268-276.
19. Bouscury D . De VosJ.. Guesnu M etal. Fas/APO-1 (CD95) expression and apoptosis in patients with myclodysplastic syndromes II Leukemia. — 1997. — Vol. 11. — P 839-845
20. Schuler M . Bossy-WetzelE.. Goldstein J.C. etal p53 induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome c release//J Biol.Chem 2000. — Vol. 275.
— P. 7337-7342.
