CC BY
65
УДК 615.277.3:576.367
М. V. Оgorodnikova, A. Yu. Baryshnikov, N. A. Oborotova, Yu. VShishkin
FLOW CYTOMETRY ANALYSIS OF APOPTOSIS INDUCTION BY CYCLOPLATAM AND OXALIPLATIN
N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
ABSTRACT
The have examined the effect of phase III clinical study Pt-contained anticancer drugs on apoptosis induction in induction in Jurkat, T-cell acute lymphoblastoma cells. For quantitative estimation of the number of apoptotic cells, the Annexin/ PI double staining and active caspase-3 staining were performed. The both anticancer drugs induced apoptosis in Jurkat cells.
Key words: cycloplatam, oxaliplatin, apoptosis.
М. В. Огородникова, А. Ю. Барышников, Н. А. Оборотова, Ю. В. Шишкин
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ЦИКЛОПЛАТАМА И ОКСАЛИПЛАТИНА НА ИНДУКЦИЮ АПОПТОЗА МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛЮОРИМЕТРИИ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
РЕЗЮМЕ
Проведен сравнительный анализ индукции апоптоза противоопухолевыми препаратами 2-го поколения из класса комплексных соединений платины, достигших 3-й фазы клинических испытаний и разрешенных для практического применения. Показано влияние оксалиплатина (элоксантин, Бапой "^ПЬтор 1пёш1пе, Франция) и оригинального отечественного производного платины - циклоплатама на индукцию апоптоза клеточной линии Тигка методами определения активной каспазы-3 и прижизненного двойного окрашивания Аннексин V/ Р1.
Ключевые слова: циклоплатам, оксалиплатин, апоптоз.
ВВЕДЕНИЕ
Установлено, что результатом действия большинства химиотерапевтических препаратов является индукция последовательных необратимых событий, приводящих опухолевую клетку к гибели путем апоптоза [10; 13; 17]. Особое место в этом аспекте занимают препараты, относящиеся к группе комплексных соединений платины.
С момента открытия цисплатина Розенбергом в 1960 г. как соединения, обладающего противоопухолевой активностью, прошло около 45 лет; за это время интерес к поиску новых комплексных соединений платины возрос [8; 21; 24; 25]. В настоящее время, помимо цисплатина, широко используются такие препараты, как карбоплатин, оксалиплатин, а также проходят испытания ряд новых комплексных соединений
платины 3-го поколения: таких, как сатраплатин, не-даплатин, 7Б0473 (Ж 473), ВВЯ3464 [8; 21; 24; 25].
Среди комплексных соединений двухвалентной платины большой интерес представляют оксалипла-тин и отечественный препарат циклоплатам.
Оксалиплатин ((1Я,2Я-диаминоциклогексан) ок-салатоплатин II), наиболее известный, как элоксатин, впервые был синтезирован в 1976 г.[15]. Как и другие производные платины, оксалиплатин взаимодействует с ДНК, образуя внутри межспиральные сшивки, что блокирует ее синтез и последующую репликацию. Синтез связей оксалиплатина с ДНК быстрый и составляет 15 мин, тогда как у цисплатина этот процесс двухфазный с замедленной 4-8-ч фазой. Нарушение синтеза ДНК ведет к ингибированию синтеза РНК и клеточного белка [15; 19].
Исследования in vitro показали, что в результате действия оксалиплатина на опухолевые клетки рака кишечника (клеточная линия НСТ 116) происходит остановка клеточного цикла в фазе G2/M, что приводит к запуску апоптоза. Оксалиплатин индуцирует апоптотический каскад, который характеризуется транслокацией Вах в митохондриях и высвобождением цитохрома С в цитозоль [7].
В настоящее время в разных странах оксалипла-тин разрешен для применения только при колоректальном раке, а в России еще и при раке яичников. Тем не менее растет число сообщений об его эффективности и при других злокачественных новообразованиях [4]. Исследования показали, что препарат обладает равной или большей по сравнению с цисплати-ном противоопухолевой активностью в отношении опухолей яичников, прямой кишки, молочной железы, лейкемии и других новообразований [9]. Оксалипла-тин показал полное отсутствие перекрестной резистентности с цисплатином или небольшую ее степень при раке яичников, прямой кишки [22]. Высокая активность при колоректальном раке, в том числе резистентном к фторпиримидинам, синергизм с 5-фторурацилом позволяют считать оксалиплатин перспективным препаратом. Оксалиплатин отличается также хорошей выводимостью из организма: период его полувыведения составляет 14 мин [23]. К недостаткам препарата относится его нейротоксичность: оксалиплатин блокирует натриевые каналы [21].
Циклоплатам - Б(-)-малатоамин (циклопентила-мин) платино(П) был синтезирован П. А. Чельцовым в лаборатории координационных соединений платиновых металлов Института общей и неорганической химии им. Н. С. Курнакова РАН. Препарат характеризуется хорошей растворимостью в воде, широким спектром и высокой противоопухолевой активностью, отсутствием нефротоксичности и перекрестной резистентности с известными платиновыми и некоторыми цитостатиками других групп [1]. Лиофилизированная форма циклоплатама, разработанная в ГУ РОНЦ им.
Н. Н. Блохина РАМН, разрешена для медицинского применения при раке яичников, мезотелиоме плевры и множественной миеломе [2; 3].
В отличие от препаратов первого поколения (цис-платин, карбоплатин), обладающих высокой нефро-токсичностью, циклоплатаму присущи менее выраженные побочные токсические эффекты [20]. Все разработанные режимы химиотерапии с циклоплатамом оказались хорошо переносимыми и эффективными. Они перспективны для дальнейших исследований. Кроме того, учитывая довольно умеренную токсичность циклоплатама, в будущем возможно создание новых оригинальных режимов для лечения опухолей желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы и других локализаций [2; 3].
Молекулярные механизмы действия циклоплата-ма мало изучены. Как и у других препаратов комплексных соединений платины, мишенью цитотокси-ческого действия циклоплатама является суперспи-
ральная ДНК. При сравнительном изучении в опытах in vitro циклоплатам в терапевтической концентрации оказался более эффективным при действии на ДНК, чем цисплатин [6]. При этом воздействие циклопла-тама на ДНК клеток лейкоза in vivo может быть обнаружено уже через 24 ч. В механизмах действия цик-лоплатама показано, что он модулирует Р-адренорецепторную активность плазматической мембраны [5]. Имеются данные об ингибирующем влиянии циклоплатама на протеинкиназу С [18].
Цель данной работы - изучение апоптоза, индуцированного действием циклоплатама в сравнении с оксалиплатином на клеточной линии Jurkat.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Культура клеток
В исследовании использована клеточная линия Jurkat. Клетки культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10 % телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ глютамина, 4,5 г/Л глюкозы, 10 мМ НЕРЕS, 1 мМ пируват натрия, 100 мкг/мл гентамицина, при 37 °С в атмосфере 5 % СО2. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоянным пересевом культуры через 2-З дня.
В исследовании использовали следующие химиопрепараты: Циклоплатам (лаборатория разработки лекарственных форм ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН), Оксалиплатин (элоксатин Sanofi Winthrop Industrie, Франция).
Определение апоптоза методом двойного окрашивания
К суспензии клеток (5x104 клеток/180 мкл среды) добавляли 20 мкл химиопрепарата в концентрациях 0,5x10"5 М, 1x10"5 М, 1x10"4 М и инкубировали в 96-луночных плоскодонных планшетах 24; 4В; 72 ч при
37 °С и в атмосфере 5 % СО2. Контролем служили интактные клетки, которые инкубировали в тех же условиях, но в отсутствии препарата. После окончания инкубации клетки собирали в пробирки, осаждали на центрифуге (Bekman) при 1000 об/мин в течение 10 мин. Затем осадок дважды отмывали в двусолевом фосфатном буфере (PBS) без азида, к осадку добавляли 100 мкл связывающего буфера, 5 мкл АннексинаV FITC, 10 мкл пропидиума йодида PI (5 мкг/мл). Образцы встряхивали на вортексе и инкубировали в темноте в течение 15 мин при комнатной температуре. После инкубации к пробам добавляли 400 мкл связывающего буфера, затем производили подсчет проб на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dikinson, США) с возбуждением флюоресценции аргоновым лазером (488 нм) и регистрацией эмиссии зеленого диапазона по каналу FL1(525 нм), красного диапазона - по каналу FL2 (585 нм). Прямое и боковое светорассеивание регистрировали по каналам FSC и SSC. Результаты оценивали по следующим параметрам: интактные (живые) клетки не связывают ни Аннексин V-FITC, ни PI (А^" PI "), ранние апоптоти-ческие клетки окрашиваются только Аннексином
V(AnV+ PI-), а поздние апоптотические или некротические клетки - и Aннексином V, и PI (AnV+ PI+).
Определение активной каспазы-3
К суспензии клеток (5xl04 клеток в180 мкл среды) добавляли 20 мкл цитостатика в концентрациях
0,5xl0-5 М; lxlO-5 М; lxlO-4 М и инкубировали в 96-луночных плоскодонных планшетах 24 ч при 37 °С и в атмосфере 5 % СО2. Контролем служили ин-тактные клетки, которые инкубировали в тех же условиях, но в отсутствии препарата. После окончания инкубации клетки собирали в пробирки для подсчета клеток на проточном цитофлюориметре, осаждали на центрифуге при 1000 об/мин в течение 10 мин. Затем дважды отмывали в холодном PBS. К пробам добавляли Cytofix/Cytoperm раствор из расчета 0,5 мл раствора на lxlO6 клеток, инкубировали 20 мин при +4 °С. После окончания инкубации пробы осаждали 7 мин при 1200об/мин, дважды отмывали Perm/Wash буфером (0,5 мл на 1 пробу). Затем к каждой пробе добавляли по 100 мкл раствора, содержащего 20 мкл антител к каспазе-3 и B0 мкл Perm/Wash буфера, инкубировали 30 мин при комнатной температуре. После окончания инкубации пробы промывали Perm/Wash буфером (1мл на 1 пробу). Далее каждую пробу ресуспендировали в
0,5 мл Perm/Wash буфера и анализировали на проточном цитофлюориметре.
Статистический анализ полученных данных проводили с использованием программы 6.0.
При сопоставлении средних величин использовали критерий значимости Стьюдента (различия считали статистически значимыми при р<0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Определение апоптоза методом двойного окрашивания проводили после инкубации клеток с циклопла-тамом или оксалиплатином в течении 24; 48; 72 ч (см. таблицу).
Через 24 ч инкубации с циклоплатамом в концентрациях 0,5х10"5 М; 1х10"5 М; 1х10"4 М количество клеток в раннем апоптозе (АпУ+ Р1") составило 14,6 %; 34 %; 37 %, для оксалиплатина - 4 %; 6 %; 19 % соответственно. Количество клеток, положительных по АпУ+ и Р1+ (предположительно поздние апототиче-ские или некротические клетки), для циклоплатама составило 3 %; 4 %; 36 %, а для оксалиплатина - 2 % (р>0,05); 2 % (р>0,05); 4 % соответственно.
Через 48 ч под действием циклоплатама количество клеток в раннем апоптозе (АпУ+ Р1 ") увеличилось и составило 25 %; 38 %; 32 %, для оксалиплатина 10 %; 13 %; 30 % (р>0,05) соответственно. Популяция клеток, положительных по АпУ+ и Р1+, для циклоплатама составила 22 %;
38 %; 50 %, для оксалиплатина - 5 %; 6 %; 20 %.
Через 72 ч количество ранних апоптотических клеток при использовании концентрации 0,5х10-5 М
Лекарственно-индуцированный апоптоз клеток линии Jurkat
Препарат, концентрация Живые интактные клетки, % (AN-/PI-) Ранние апоптотические клетки,% (AN +/PI-) Поздние апоптотические или некротические клетки, % (AN +/PI+)
Время инкубации, ч
24 4B 72 24 4B 72 24 4B 72
Интактный контроль 88±4 90±З 92±4 4±5 2±З 4±2 З±2 2±1 2±1
0,5xl0-5 М
Циклоплатам 77±2 57±2 19±4 14±2 25±5 60±4 З±2* 22±5 19±4
Оксалиплатин 91 ±2* B 1±2 74±4 4±1* 10±4 17±2 2±2*’** 5±2* 7±1*
lxlO-5 М
Циклоплатам 64±З З2±2 2З±4 З4±2 3B±5 62±2 4±1* З8±4 24±4
Оксалиплатин 92±З* 7B±2 66±2 6±4* 1З±6 25±2 2±2*’** 6±1* 7±З*
lxlO-4 М
Циклоплатам 27±З 20±1 B±3 З7±1 З2±4 77±З З6±З 50±1 15±2
Оксалиплатин 75±5 4B±3 27±З 19±5 З0±1** З9±2 4±2* 20±5 14±2**
р>0,05, в остальных случаях р<0,05 в сравнении с интактным контролем; р>0,05, в остальных случаях р<0,05 в сравнении с циклоплатамом
для циклоплатама увеличилось и составило 60 %, для оксалиплатина - 17 %. При использовании дозы 1х10-5 М количество поздних апоптотических или некротических клеток для циклоплатама и оксалиплатина уменьшилось и составило 24 % и 7 % соответственно. При увеличении дозы (1х10-4 М) популяция клеток, положительных по АпУ+ и отрицательных по РГ, увеличилась как для циклоплатама, так и для оксалипла-тина и составила 77 % и 39 % соответственно. Количество клеток, положительных по АпУ+ и Р1+, наоборот, уменьшилось и составило для циклоплатама 15 %, для оксалиплатина 14 % (р>0,05). Распределение популяций клеток (АпУ'/РГ, АпУ+/РГ, АпУ+/Р1+), в зависимости от времени инкубации и используемой дозы препарата, представлено на рис. 1; 2 и 3.
Таким образом, под действием циклоплатама при инкубации 24 ч количество клеток в раннем апоптозе (АпУ+Р1") и предположительно позднем апотозе или некрозе (АпУ+Р1+) увеличивается пропорционально увеличению дозы цитостатика. При увеличении времени инкубации до 48 ч процент клеток в раннем апоптозе уменьшается, а в позднем или некрозе увеличивается. При инкубации 72 ч процент клеток в раннем апоптозе увеличивается, а в позднем или некрозе уменьшается. Под действием оксалиплатина прослеживается аналогичная тенденция.
Ключевая роль в запуске и развитии процесса апоптоза принадлежит группе цистеиновых протеаз, названных каспазами. В каспазном каскаде каспаза-3 играет основную роль в дезагрегации ядра во время апоптоза, вызывает фрагментацию ДНК и конденсацию хроматина [11], активирует фактор фрагментации ДНК (ОББ) путем его расщепления и тем самым индуцирует образование лестницы ДНК [16]. Каспаза-3
АП-/РІ-
Ап+/Р1-
Ап+/Р1+
АП-/РІ-
Ап+/Р1-
Ап+/Р1+
~\tT
£ 100 90
£ 80
О £ 70
§ R0
в н S0
и и г 40
в ч 30
а 20
10 0
______________ав еЩ а_____________________
24 48 72 24 48 72 24 48 72
Время инкубации с препаратом, ч
Рис. 1. Распределение популяций клеток в зависимости от времени инкубации с химиопрепаратом в дозе 0,5х10"5 М:
^ контроль;
О циклоплатам;
□ оксалиплатин.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
№
24 48 72 24 48 72 24 48 72
Время инкубации с препаратом, ч
Рис. 2. Распределение популяций клеток в зависимости от времени инкубации с химиопрепаратом в дозе 1х10-5М:
Ш
контроль;
О циклоплатам;
□ оксалиплатин.
A n+/P I -
АП+УРІ +
24 48 72 24 48 72 24 48 72
Время инкубации с препаратом, ч
Рис. 3. Распределение популяций клеток в зависимости от времени инкубации с химиопрепаратом в дозе 1х10"4М:
Ш
контроль;
□ циклоплатам;
□ оксалиплатин.
является принципиальным медиатором образования апоптотических телец, активируя PAK2 (p21-activated kinase) в CD95 и TNF-опосредованном апоптозе [14].
В связи с вышеизложенными данными для определения лекарственно-индуцированного апоптоза использовали метод определения экспрессии активной каспазы-3. Через 24 ч инкубации клеток линии Jurkat с циклоплатамом в концентрациях 0,5х10"5 М; 1х10"5 М; 1 х 10-4 М количество клеток, экспрессирующих актив-
81 % (негатив- 4.
ную каспазу-3, составило 14 %; 31 ный контроль 7 %) (рис. 4, А).
Количество клеток, экспрессирующих активную каспазу-3, после 24-ч инкубации с оксалиплатином в концентрациях 0,5 х10-5 М; 1х10-5 М; 1х10-4 М, составило 5,3 %; 6,4 %; 11,9 % соответственно (негативный контроль - 4,3 %) (рис. 4, В).
Количество клеток, положительных по каспазе-3, увеличивается пропорционально увеличению дозы препарата. Уровень экспрессии активной каспазы-3 после действия оксалиплатина в дозе 1х10-4 М ниже, чем уровень экспрессии после действия циклоплатама.
Метод двойного окрашивания аннексин У/Р1 не дает точного ответа, по какому типу происходит гибель клеток: апоптоза или некроза, в связи с этим целесообразно сочетать этот метод с методом определения экспрессии активной каспазы-3, наличие которой свидетельствует об апоптотической гибели клеток.
ВЫВОДЫ
1. Противоопухолевые препараты из группы комплексных соединений платины циклоплатам и ок-салиплатин индуцируют гибель клеток линии 1иг-ка! по механизму апоптоза.
2. Лекарственно-индуцированный апоптоз клеток линии 1игка1 зависит от концентрации и/или времени инкубации с препаратами.
3. Установлен высокий процент гибели клеток линии 1игка1 по типу апоптоза (77,0 %) через 72 ч инкубации с циклоплатамом в дозе 1х10-4 М.
5.
Концентрация циклоплатама, вызывающая наибольшую экспрессию (81 %) активной каспазы-3, составила 1 х 10-4 М.
Метод определения активной каспазы-3 совместно с методом двойного окрашивания Аннексин У/Р1 позволяет идентифицировать гибель опухолевых клеток по типу апоптоза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Оборотова Н. А. Противоопухолевые субстанции и их лекарственные формы, созданные в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. - В кн. Экспериментальная онкология на рубеже веков. Под ред. М. И. Давыдова и А. Ю. Барышникова. - М.: Издательская группа РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН,
2003. - С. 5-58.
2. Горбунова В. А, Оборотова Н. А, Чельцов П. А. и др. Новый препарат платины второго поколения -циклоплатам лиофилизированный // Вестник РОНЦ. -2001. - №4. - С. 53-7.
3. Горбунова В. А. Препарат циклоплатам. Результаты клинических испытаний при резистентных солидных опухолях // Вестн. моск. онкол. общества. -
2004. - № 11. - С. 11-4.
4. Семенов Н. Н. Активность оксалиплатина (элоксатина) при платиночувствительных опухолях // Фарматека. - 2005. - № 18. - С. 63-5.
5. Солнцева Т. И. Влияние циклоплатама на мембранные свойства опухолевых клеток: Р-адренергические рецепторы и адгезия на пластике. - Циклоплатам: Сб.
Л
\о
о
I
§,
1*104М
1 80.6%
> М1
СаБраБе-З НТС
102
С«разе-3 ПТС
103
Сазраэе-З Р1ТС
Савраве-З ГГГС
Интенсивность флюоресценции
Рис. 4. Гистограммы распределения клеток 1игка1 по флюоресценции после окрашивания их ИТС-МКА к активной каспазе—3 через 24 ч инкубации с циклоплатамом (А) и оксалиплатином (Б):
сплошная заливка - контроль; контурная линия - эксперимент.
научн. тр. - М.: ОНЦ РАМН, 1993. - С.100-6.
6. Стручков В. А. Механизм действия циклопла-тама на структуры ДНК опухолевых клеток. - Циклоплатам: Сб. научн. тр. - М.: ОНЦ РАМН, 1993. - С. 90-9.
7. Arango D., Wilson AJ. et al. Molecular mechanisms of action and prediction of response to oxaliplatin in colorectal cancer cells // Br J Cancer. - 2004. - Vol. 91(11). - Р. 1931-46.
8. Boulikas T., Vougiouka M. Cisplatin and platinum drugs at the molecular level // Oncol Rep. - 2003. -Vol. 16. - P. 1663-82.
9. Chollet P., Bensmaine M. A., Brienza S. Single agent activity of oxaliplatin in heavity pretreated advanced epithelial ovarian cancer // Ann. Oncol. - 1996. -Vol. 7. - P. 1065-70.
10. Dive C., Hichman J. A. Drug target interactions: only the first step in the commitment of a cell to a programmed cell death // Science. - 1991. - Vol. 278. - P. 6879.
11. Earnshaw W. C. Apoptosis: lessons from in vitro systems // Cell. - 1995. - Vol. 81. - P. 226-68.
12. Gerasimova G. H., Mikhaevich I. S., Vlasenkova N. K. Antiproliferative effect of complexes of platinum (II) with plas many 1-(N-acyl)-ethanolamine, an inhibitor of protein kinase C // Anticancer Drugs. - 1992. -Vol. 3. - P. 513-7.
13. Hannun Y. Apoptosis and dilemma of cancer chemotherapy // Blood. - 1997. - Vol. 89. - P. 1845-953.
14. Hirata H., Takahashi A., Kobayashi S.Y. at el. Caspases are activated in branched proteases cascade and control downstream processes in Fas-induced apoptosis // J.Exp.Med. - 1998. - Vol. 187. - P. 587-600.
15. Kidani Y., Inagaki K., Tsugagoshi S. Examination of antitumoral activities of platinum complexes of
1,2-diaminocyclohexane-diamine isomers their related complex // Gann. - 1976. - Vol. 67. - P. 921-2.
16. Liu X.S ., Zou H., Slaughter C., and Wang XD. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apop-tosis // Cell. - 1997. - Vol. 89. - P. 175-84.
17. Makin G., Hickman J. A. Apoptosis and cancer chemotherapy // Cell. - 2000. - Vol. 301. - P. 143-52.
18. Michaevich I. S., Vlasenkova N. K., Gerasimova G. K. Platinum drugs, cisplatin and cycloplatam inhibit protein kinase C in cell free system and in human melanoma BRO cells // Himiko-farmacevtichesky. - 1996. -Vol. 1 - P. 24-9.
19. Misset J. L., Kidani Y. Oxalyplatinum (I-OHP): experimental and clinical studies. Platinum and other metal coordination compounds in cancer chemotherapy. - NY Pienum Press, 1991. - P. 75.
20. Presnov M. A., Konovalova A. L. Cycloplatam and oxaliplatin - the new antitumor platinum compounds of the second generation // Arch. Geschwulstforsch. -1988. - Vol. 1. - P. 43-9.
21. Raymond E., Faivre S., Chaney S. et al. Cellular and molecular pharmacology of oxaliplatin // Mol Cancer Ther. - 2002. - Vol. 1. - P. 227-35.
22. Rixe O., Ortuzar W., Alvarez M. Oxaliplatin, cisplatin and carboplatin: spectrum of activity in drug-resistant cell lines and in the cell lines of the National Cancer Institutes Anticancer Drug Screen Panel // Bio-chem. Pharm. - 1996. - Vol. 52. - P. 1855-65.
23. Screnci D., Er H.M., Hasmbley T.W. et al. Stereoselective peripheral sensory neurotoxicity of dia-minocyclohexane platinum enantiomers related to orma-platin and oxaliplatin // Br J cancer. - 1997. - Vol. 7. -P. 502-10.
24. Sessa S., Capri G., Gianni L. et al. Clinical and pharmacological phase1 study with accelerated titration design of a daily times five schedule of BBR3464, a novel cationic triplatinum complex // Ann Oncol. - 2000. - Vol.
11. - P. 977-83.
25. Sharp S. Y., O’Neill C. F., Rogers P. et al. Retention of activity by the new generation platinum agents AMD0473 in four human tumor cell lines possessing acquired resistance to oxaliplatin // Eur J Cancer. - 2002. -Vol. 38. - P. 2309-15.
Поступила 29.11.2006.
