CC BY
35
УДК 636.2.034:636.2.082.
ХАРАКТЕРИСТИКА БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ С РАЗНЫМИ ГЕНОТИПАМИ БЕТА-КАЗЕИНА ПО ПРОИСХОЖДЕНИЮ
Ахметов Т.М., Тюлькин С.В.*, Вафин Р.Р.**, Кабиров И.Ф.
ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» ФГБУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория», г. Казань*
ГНУ «ТатНИИСХ РАСХН, г. Казань**
Ключевые слова: бык-производитель, бета-казеин, генотип, молочная продуктивность, ПЦР, ДНК.
Key words: bull-producer, beta-casein, genotype, milk production, PCR,
DNA.
В настоящее время в нашей стране практически отсутствуют характеристики генофонда различных пород крупного рогатого скота по генотипам, в то время как информация о генотипах аллелей молочных белков является у племенных животных существенным фактором, который должен быть учтен при разведении породы, особенно в стратегии выбора быков для стада. Селекционер должен иметь полную информацию о генотипе быка, который используется в стаде. Использование метода ДНК-анализа позволяет проводить широкомасштабные исследования генетического полиморфизма и отбор животных с желательными аллельными вариантами.
Фракция бета-казеина вторая по величине фракция казеина в молоке, по массе белка она уступает лишь ш^-казеину. В полипептидной цепи молекулы /-казеина насчитывается 209 аминокислотных остатков, из которых пять принадлежат фосфосерину (F. Grosclaude, 1979).
Встречаются несколько молекулярных форм бета-казеина (Äj, Ä2, А3, В, С, D, Е), которые различаются по аминокислотному составу и электрофоретической подвижности (B. Seibert et al., 1985; M Baranyi et al., 1993). В настоящее время известно 11 вариантов /-казеина (А.М. Машуров, 1980).
А.С. Митюков (1974) в своих исследованиях установил, что содержание бета-казеина ВВ в молоке коров всех пород положительно коррелируется с содержанием жира в молоке, а бета-казеина ÄÄ -отрицательно.
Установлено, что В-аллель бета-казеина благоприятно влияет на сыродельческие свойства молока (Н.Н. Мухаметгалиев, 2006). М.П. Афанасьев (1996) считает, что В-аллель /-казеина обладает
самостоятельным положительным влиянием на сыродельческие свойства молока и усиливает аналогичное действие В-аллеля каппа-казеина.
Молоко, содержащее бета-казеин типа ВВ, более термоустойчиво по сравнению с молоком, где имеется АА тип (D.M. Mc Lean et al., 1987). Однако в исследованиях Н.Н. Мухаметгалиева (2006) получены противоположные результаты. Так, отрицательное влияние В аллеля по локусу ^-казеина на термоустойчивость молока особенно четко проявлялось в группах чистопородных голштинских и айрширскийх коров. Коагуляция белков в молоке коров с генотипом АВ, в сравнении с показателем животных, имеющих в локусе ^-казеина А аллелли, происходила раньше на 28,4 и 14,7 мин., соответственно.
Всё выше сказанное говорит о важности оценки быков-производителей с разными генотипами бета-казеина по происхождению.
Материал и методика исследований. Исследования проводились в ГУП ГПП «Элита» Высокогорского района Республики Татарстан. Для проведения ДНК-диагностики и оценки по гену бета-казеина у 70 чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей были отобраны пробы крови.
Кровь, полученную из яремной вены животных, вносили в пробирки с 100 мМ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ.
ДНК из крови выделяли комбинированным щелочным способом: 100 мкл крови смешивали с 1 мл дистиллированной воды и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а к осадку добавляли 50 мкл 0,2 М NaOH и тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре до просветления суспензии. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин. К лизату добавляли равный объем (50 мкл) 1М Трис-HCl (pH 8,0) и тщательно встряхивали смесь на вортексте при комнатной температуре. К полученному гомогенату добавляли 500 мкл 96% этанола и выдерживали полученную смесь при -200С в течение 30 мин. Нуклеопротеидный комплекс осаждали центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а осадок высушивали при 600С в течение 12 мин с открытой пробиркой. К высушенному осадку добавляли 100 мкл 10% аммиака, тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре и выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин, затем повторно встряхивали на вортексе и выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 950С в течение 15 мин с открытой пробиркой.
ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей буфер (60 мМ трис-HCl (рН 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100), 0,25 мМ dNTP, 1 ед. Taq ДНК полимеразы, 0,5 мкМ праймеров O-bcas-F: 5/-AACATCCCTCC-TCTTACTCAAACCCCTG-3/ и O-bcas-R: 5/-
ATATCTCTCTGGGGATAGGGC-ACTGCTT-37 и I-bcas-F: 57-AATATCCAGTTGAGCCCTTTACTGAATGC-37 и I-bcas-R: 57-CAACATCAGTGAGAGTCAGGCTCAGC-37, сконструированных Г. Ринкон и Дж. Медрано (G. Rincon, J.F. Medrano, 2003) для амплификации фрагмента гена бета-казеина длиной 338 и 217 bp (аллель А) и 338 и 177 bp (аллель В), 1 мкл пробы ДНК в следующем режиме:
х1:94 0С - 4 мин; х40:94 0С - 10 сек, 63 0С - 10 сек, 72 0С - 10 сек; х1:72 0С - 7 мин; хранение: 10 0С.
Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5 % агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в 1хТВЕ буфере.
После электрофореза гель просматривали в УФ-трансиллюминаторе при длине волны 310 нм. Идентификацию генотипов определяли по количественным и качественным признакам.
В работе наряду с экспериментальными материалами использовались данные зоотехнического и племенного учета данного хозяйства, то есть племенные карточки (форма 1-МОЛ), а также каталоги и племенные свидетельства быков-производителей.
Частоту встречаемости генотипов определяли по формуле: р = n / N,
где р - частота определения генотипа, n - количество особей, имеющих определенный генотип, N - число особей.
Частоту отдельных аллелей определяли по формулам: РА = (2nAA+nAB) : 2N и qB = (2nBB+nAB) : 2N , где РА - частота аллеля А, qB - частота аллеля В, N - общее число аллелей.
По закону Харди-Вайнберга (В.Л. Петухов, А.И. Жигачёв, Г.А. Назарова, 1985) рассчитывали ожидаемые результаты частот генотипов в исследуемой популяции.
Вычислен родительский индекс по Н.А. Кравченко (1963) для каждого быка по удою и жирномолочности их женских предков. РИБ = (2М + ММ + МО) / 4,
где М - матери, ММ - матери матерей, МО - матери отцов. Полученные результаты в ходе научных исследований обработаны биометрическим методом с использованием ЭВМ и программного приложения Microsoft Excel.
Результаты собственных исследований. Для оценки качества работы известного протокола по генотипированию крупного рогатого скота по гену бета-казеина нами был протестирован набор олигонуклеотидных праймеров: O-bcas-F+O-bcas-R и I-bcas-R+I-bcas-F по оптимизированной нами технике ARMS-PCR (см. «Материал и методика исследований»).
Праймеры О-Ьсав-Р+О-ЬсаБ-Я и ЬЬсав-К+ЬЬсав-Р инициируют амплификацию А-аллель-специфичного и В-аллель-специфичного фрагментов ДНК гена бета-казеина крупного рогатого скота размером 338, 217 Ьр (аллель^) и 338, 177 Ьр (аллель В) соответственно (рис. 1).
М 1 2 3 4 5
300 Ьр 200 Ьр
100 Ьр
338 Ьр
217 Ьр 177 Ьр
Рис. 1. Электрофореграмма результата аллель-специфичной ПЦР для генотирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена бета-казеина с праймерами О-ЬсаБ-Р+О-ЬсаБ-Я и ЬЬсав-К+ЬЬсаБ-Р Обозначения: М) ДНК-маркеры 1000-100 Ьр (СибЭнзим); 1, 2, 5) генотип АА (338/217 Ьр); 3, 4) генотип АВ (338/217/177 Ьр).
После проведения ПЦР-анализа распределение животных по генотипам локуса гена бета-казеина было следующим: 61 (87,1%) быков-производителей имели генотип АА, 9 (12,9%) - генотип АВ, при этом животных с генотип ВВ не обнаружено. Частота аллеля А достигла 0,94, аллеля В - 0,06 (табл. 1).
1. Полиморфизм гена бета-казеина у быков-производителей
Генотипы Частота
Хозяйство п АА А В ВВ аллелей Х2
п % п % п % А В
ГУП ГПП Н 70 61 87,1 9 12,9 0 0 0,94 0,06 0,14
«Элита» О 62 88,6 8 11,4 0 0
Н - наблюдаемое распределение генотипов, О - ожидаемое распределение генотипов
Для оценки быков-производителей по происхождению использованы индексы племенной оценки быков, в которые входили показатели ближайших женских предков. Родительский индекс показывает степень возможной передачи потомству молочной продуктивности, то есть
давления генотипа производителя на молочную продуктивность потомства. Характеристика быков-производителей по происхождению представлена в таблице 2.
Анализ таблицы показывает, что наибольшие показатели по удою и содержанию жира в молоке имели матери быков с генотипом АА бета-казеина (8752 кг и 3,89%), которые были выше, чем у матерей быков с генотипом АВ на 389 кг и 0,09% соответственно.
Более высокий удой был характерен для матерей матерей (ММ) быков с генотипом АВ (8104 кг), тогда как по содержанию жира в молоке выделялись матери матерей быков с генотипом АА (3,89%). При этом разница между матерями матерей с генотипом бета-казеина АА и АВ по содержанию жира составила 0,15% (Р<0,05).
2. Характеристика быков-производителей с разными генотипами бета-казеина по молочной продуктивности женских предков
Показатели Генотип быков по локусу бета-казеина Разница АА-АВ
АА АВ
Число быков 61 9 -
Матери удой, кг 8752±225,5 8363±654,2 +389
жир, % 3,89±0,03 3,80±0,04 +0,09
ММ удой, кг 7201±262,5 8104±1226,4 -903
жир, % 3,89±0,05 3,74±0,04 +0,15*
МО удой, кг 10678±394,9 10230±227,8 +448
жир, % 4,04±0,05 4,13±0,18 -0,09
Родословный индекс быка (РИБ) удой, кг 8846±225,8 8765±570,6 +81
жир, % 3,92±0,03 3,87±0,05 +0,05
* - Р<0,05
Более высокий удой характерен для матерей отцов (МО) быков с генотипом АА (10678 кг), а более высоким содержанием жира в молоке отличались аналоги с генотипом АВ (4,13%). При этом разница по этим показателям составила 448 кг и 0,09%.
Оценка быков по родительскому индексу позволила выявить, что используемые быки не равноценны по происхождению. Так, родительский индекс (РИБ) быков с генотипом АА бета-казеина обладал более высокой молочностью - 8846 кг и жирностью молока - 3,92%, что незначительно выше, чем у быков с генотипом АВ (на 81 кг и 0,05%).
Вывод. По результатам оценки быков-производителей по происхождению более высокие показатели были у быков с генотипом АА бета-казеина, чьи женские предки имели более высокую молочную продуктивность.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Афанасьев, М.П. Генетическая структура, белковый состав и технологические свойства молока холмогорской, венгерской, голштинофризской пород скота и их помесей: автореф. дис. канд. биол. наук: 06.02.01. / Афанасьев Михаил Павлович. - Казань, 1996. -24 с. 2. Машуров, А. М. Генетические маркеры в селекции животных / А.М. Машуров. - М.: Наука. - 1980. - 315 с. 3. Митюков, А.С. Генетическая обусловленность внутрипородных качественных вариаций полиморфных систем белков молока: автореф дисс. канд. биол. наук: 06.02.01 / Митюков Александр Сергеевич. - Л. - Пушкин, 1974. - 15 с. 4. Мухаметгалиев, Н.Н. Использование генетической и паратипической изменчивости белкового состава молока для улучшения технологических свойств сырья и повышения качества молочных продуктов: автореф. дисс. докт. биол. наук: 06.02.01 / Нурвахит Нургалиевич Мухаметгалиев. - 2006. - 34 с. 5. Baranyi, M. Genetic Polymorphism of Milk Protein in Hungarian Spotted and Hungarian Grey Cattle: A Possible New Genetic Variants of P-lactoglobulin / M. Baranyi [et al.] // J. Dairy Sci. - 1993. - № 76. - Р. 630-636. 6. Grosclaude, F. Polymorphism of milk proteins: some biochemical and genetical aspects / F. Grosclaud // Proc. of the 18 th International Conference on animal blood groups (Leningrad). - 1979. - V. 1. - P. 54-62. 7. Mc Lean, D.M. Effect of milk protein genetic variants and composition on heat stability of milk / D.M. Mc Lean [et al.] // J. Dairy Res. - 1987. - № 54. - Р. 219-235. 8. Rincon, G. Single nucleotide polymorphism genotyping of bovine milk protein genes using the tetra-primer ARMS-PCR / G. Rincon, J.F. Medrano // J. Anim. Breed. Genet. - 2003. - V. 120 - P. 331-337. 9. Seibert, B. Procedure for simultaneous phenotyping of genetic variants in cow's milk by isoelectric focusing / B. Seibert, G. Erhardt. B. Senft // Animal Blood Groups and Biochemical Genetics. - 1985. - № 16. - Р. 183-191.
ХАРАКТЕРИСТИКА БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ С РАЗНЫМИ ГЕНОТИПАМИ БЕТА-КАЗЕИНА ПО ПРОИСХОЖДЕНИЮ
Ахметов Т.М., Тюлькин С.В., Вафин Р.Р., Кабиров И.Ф.
Резюме
Представлена предварительная оценка племенной ценности быков-производителей с разными генотипами бета-казеина. Изучены признаки молочной продуктивности (удой, содержание и количество молочного жира) ближайших женских предков быков-производителей с генотипами АА и АВ бета-казеина. Исследования показали, что более высокую оценку по происхождению имели быки-производители с генотипом АА бета-казеина.
THE CHARACTERISTICS OF BULL-PRODUCERS WITH DIFFERENT GENOTYPES
OF BETA-CASEIN BY ORIGIN
Ahmetov T.M., Tjulkin S.V., Vafin R.R., Kabirov I.F.
Summary
We presented (showed) preliminary estimate of tribal value bull-producers with difference genotypes of beta-casein. Were studied signs to milk productivity (the yield of milk, content and amount of milk fat) nearest female forefather bull-producer with АА and AB genotypes of beta-casein. Researches have shown, that bull-producers with genotype АА of beta casein are more highly appreciated by origin.
УДК 619:616:636.2
ИЗУЧЕНИЕ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ
Базекин Г.В., Исмагилова А.Ф.
ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет»
Ключевые слова: солодка, тритерпеновые гликозиды, глицирризиновая кислота, кумуляция, хроническая токсичность, пестициды, детоксикационная терапия.
Key words: Licorice, triterpene glycosides, glycyrrhizic acid, accumulation, chronic toxicity, pesticides, detoxification therapy, TMTD, reduces the degree of its cumulative effect.
Актуальность. Способность к кумуляции в организме животных соединений, загрязняющих окружающую среду, занимает одно из важнейших мест в экологической оценке препаратов, так как кумулятивные эффекты определяют потенциальную опасность хронического отравления людей, а также позволяют прогнозировать отдаленные последствия их действия [4]. Интерес к производным глицирризиновой кислоты вызван высокой и разнообразной биологической активностью и низкой токсичностью [1]. Для снижения токсического воздействия пестицидов в организме животных перспективными соединениями зарекомендовали себя производные тритерпенового гликозида - глицирризиновая кислота (ГК), являющаяся основным биологически активным компонентом экстракта корней солодки голой и уральской [2,3].
