CC BY
85
УДК 636.2.034:636.2.082.2
МОЛОЧНАЯ ПРОДУКТИВНОСТЬ КОРОВ С РАЗНЫМИ ГЕНОТИПАМИ БЕТА-ЛАКТОГЛОБУЛИНА Ахметов Т.М., Тюлькин С.В., Валиуллина Э.Ф.
Казанская государственная академия ветеринарной медицины
Ключевые слова: молочная продуктивность, черно-пестро х голштинская корова, бета-лактоглобулин, генотип, полиморфизм, ПЦР, ДНК.
Key words: milk production, holstien black-and-white cow, beta-lactoglobulin, genotype, PCR, DNA.
Молочная продуктивность оценивается количеством и качеством молока, получаемого от коровы за определенный промежуток времени. Она зависит от целого комплекса внутренних и внешних факторов. Внешние факторы обуславливаются условиями кормления, содержания и зоной разведения животных, а внутренние факторы - породными особенностями животных и их наследственностью. Среди внутренних факторов, обуславливающих уровень молочной продуктивности и свойства молока, наследственные особенности животных имеют важное значение. Высокопродуктивные животные, от которых можно получить молоко с большим содержанием жира и белка, обладающие хорошими технологическими свойствами - важная задача в селекции молочного животноводства. Благодаря современным достижениям молекулярной генетики, стало возможным идентифицировать гены, отвечающие за хозяйственно-полезные признаки. Идентифицировать гены можно не только у коров, но и у телок, а также у быков-производителей, что позволяет значительно ускорить решение селекционных задач.
Исследования ряда авторов показывают, что показатели молочной продуктивности зависят от генотипа бета-лактоглобулина (H. Bovenhuis et al., 1992; A.M. Tsiaras, 2005; О.В. Костюнина, 2005; Н.Н. Мухаметгалиев, 2006).
Всё выше сказанное говорит о важности изучения молочной продуктивности коров с разными генотипами бета-лактоглобулина.
Материал и методика исследований. Исследования проводились в ООО «Дусым» Атнинского района РТ на 158 черно-пёстро х голштинских коровах.
Для проведения ДНК-диагностики и оценки по гену бета-лактоглобулина у животных были отобраны пробы крови.
Кровь, полученную из яремной вены животных, вносили в пробирки с 100 мМ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ.
ДНК из крови выделяли комбинированным щелочным способом, оптимизированным Р.Р. Вафиным (2006): 100 мкл крови смешивали с 1 мл дистиллированной воды и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а к осадку добавляли 50 мкл 0,2 М NaOH и тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре до просветления суспензии. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин. К лизату добавляли равный объем (50 мкл) 1М Трис-HCl (pH 8,0) и тщательно встряхивали смесь на вортексте при комнатной температуре. К полученному гомогенату добавляли 500 мкл 96% этанола и выдерживали полученную смесь при -200С в течение 30 мин. Нуклеопротеидный комплекс осаждали центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а осадок высушивали при 600С в течение 12 мин с открытой пробиркой. К высушенному осадку добавляли 100 мкл 10% аммиака, тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре и выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин, затем повторно встряхивали на вортексе и выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 950С в течение 15 мин с открытой пробиркой.
ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей буфер (60 мМ трис-HCl (рН 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100), 0,2 мМ dNTP, 0,2 мкл Taq ДНК полимеразы, 0,5 мкМ праймера BLGP3: 5' -GTC CTT GTG CTG GAC ACC GAC TAC A - 3', 0,5 мкМ праймера BLGP4: 5' - CAG GAC ACC GGC TCC CGG TAT ATG A - 3', сконструированных J.F. Medrano и E. Aguilar-Cordova (1990) для амплификации фрагмента гена бета-лактоглобулина длиной 262 пары нуклеотидов, 1 мкл пробы ДНК в следующем режиме:
х1:94 0С - 4 мин;
х38:94 0С - 10 сек, 60 0С - 10 сек, 72 0С - 10 сек;
х1:72 0С - 5 мин;
хранение: 4 С.
Для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина по вариантам А и В 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 5 ед. эндонуклеазы рестрикции Hae III в 1хбуфере «С» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С течение ночи.
Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5 % агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в 1хТВЕ буфере.
После электрофореза гель просматривали в УФ-
трансиллюминаторе при длине волны 310 нм. Идентификацию генотипов определяли по количественным и качественным признакам ПЦР ПДРФ.
Молочную продуктивность определяли ежемесячно путём проведения контрольных доек (3 раза в месяц). На основании контрольных доек рассчитывали общую молочную продуктивность за 305 дней лактации, а также за укороченную лактацию, но не меньше 240 дней. Содержание жира в молоке определяли кислотным методом по Г ербергу, а содержание белка - методом измерения массовой доли общего азота по Кьельдалю и определения массовой доли белка.
В работе наряду с экспериментальными материалами использовались данные зоотехнического и племенного учета хозяйств, то есть племенные карточки (2-МОЛ).
Полученные результаты в ходе научных исследований обработаны биометрическим методом с использованием ЭВМ и программного приложения Microsoft Excel.
Результаты собственных исследований. Для оценки качества работы известных протоколов по генотипированию крупного рогатого скота по гену бета-лактоглобулина нами была протестирована пара олигонуклеотидных праймеров: BLGP3: 5' -
GTCCTTGTGCTGGACACCGACTACA - 3', праймера BLGP4: 5' -CAGGACACCGGCTCCCGGTATATGA - 3' по оптимизированной нами технике ПЦР-ПДРФ (см. «Материал и методика исследований»).
Праймеры BLGP3+BLGP4 инициируют амплификацию фрагмента гена бета-лактоглобулина крупного рогатого скота длиной 262 bp, а fi-LGB-ПДРФ-HaeIII профиль (AA=153/109 bp, BB=109/79/74 bp и AB=153/109/79/74) идентифицирует его генотипы (рис. 1).
Для определения влияния генотипа по локусу гена бета-лактоглобулина на молочную продуктивность коров нами проведены исследования по изучению таких признаков, как продолжительность лактации, удой, содержание, выход жира и белка в молоке.
Данные таблицы 1 показывают, что разница между группами по продолжительности лактации была незначительная и составила 1 - 2 дня. При этом коровы, имеющие в своём генотипе А аллель в большей части превосходили аналогов с генотипом ВВ.
В среднем удой коров за первую лактацию в группе животных с генотипом бета-лактоглобулина ВВ составил 3969 кг, АВ - 4273 кг, АА -4325 кг. Коровы с генотипом бета-лактоглобулина ВВ уступали сверстницам на 304 - 356 кг (P<0,05) молока.
600 Ьр 500 Ьр 400 Ьр
300 Ьр 200 Ьр
100 Ьр
1. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена
в-лактоглобулина крупного рогатого скота с праймерами БЬОР3+БЬОР4 и эндонуклеазным расщеплением ферментом ИавШ
Обозначения: М) ДНК-маркеры 1000-100 Ьр (СибЭнзим); 1, 4, 5) генотип АВ (153/109/79/74 Ьр); 2, 8) генотип АА (153/109 Ьр); 3, 6, 7) генотип ВВ (109/79/74 Ьр); 9) цельный ПЦР-фрагмент гена бета-лактоглобулина (262 Ьр).
По содержанию жира в молоке коровы с гомозиготным генотипом бета-лактоглобулина ВВ незначительно превосходили аналогов, имеющих в геноме аллельный вариант А в гетерозиготной и гомозиготной форме на
0,01 - 0,02%. При этом от животных, имеющих аллель А бета-лактоглобулина получено в среднем за лактацию на 11,0 - 13,5 кг (Р<0,05) молочного жира больше, чем от коров с генотипом ВВ.
Полученные результаты также показали, что коровы с генотипом АВ и АА превосходили по содержанию белка в молоке животных с гомозиготным генотипом ВВ на 0,03 - 0,05% (Р<0,05 и 0,001). От коров, несущим в своем геноме аллель А в сравнении с аналогами ВВ было получено за лактацию на 11,0 - 13,5 кг (Р<0,01) молочного белка больше, чем от коров с гомозиготным генотипом бета-лактоглобулина ВВ. Как по содержанию белка, так и по выходу молочного белка за лактацию коровы с генотипом АВ занимали промежуточное положение.
Животные с генотипом бета-лактоглобулина ВВ уступали животным других генотипов по удою на 1 день лактации и по интенсивности молокоотдачи, при этом разница по удою на 1 день лактации была достоверной.
1. Молочная продуктивность коров с разными генотипами
бета-лактоглобулина
Показатели Г енотипы
ВВ АВ АА ВВ±АВ ВВ±АА
П 60 73 25 - -
дойных дней 296±1,9 294±1,7 297±1,9 -2 +1
удой, кг 3969±83,8 4273±84,9 4325±134,0 +304* +356*
жир, % 3,85±0,03 3,83±0,02 3,84±0,03 -0,02 -0,01
молочный жир, кг 152,8±3,14 163,7±3,33 166,1±5,33 +10,9* +13,3*
белок, % 3,19±0,01 3,22±0,01 3,24±0,01 +0,03* +0,05***
молочный белок, кг 126,6±2,72 137,6±2,73 140,1±4,31 +11,0** +13,5**
интенсивность
молокоотдачи, 1,81 ±0,02 1,83±0,03 1,84±0,02 +0,02 +0,03
кг/мин.
удой на 1 день лактации, кг 13,4±0,28 14,5±0,30 14,6±0,42 +1,1** +1,2*
* - P<0,05, ** - P<0,01, *** - P<0,001
Вывод. Более высокую молочную продуктивность имели коров с генотипом бета-лактоглобулина АВ и АА. При этом животные с генотипом ВВ незначительно превосходили своих сверстниц по содержанию жира в молоке.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Костюнина, О. В. Молекулярная диагностика генетического полиморфизма основных молочных белков и их связь с технологическими свойствами молока : автореф. дисс. канд. биол. наук : 03.00.23 /Костюнина Ольга Васильевна. - Дубровицы. - 2005. - 21 с. 2. Мухаметгалиев, Н. Н. Использование генетической и паратипической изменчивости белкового состава молока для улучшения технологических свойств сырья и повышения качества молочных продуктов : автореф. дисс. докт. биол. наук : 06.02.01 / Нурвахит Нургалиевич Мухаметгалиев -2006.-34с. 3. Хабибрахманова, Я. М. Полиморфизм молочных белков и гормонов крупного рогатого скота : автореф. дисс.канд.биол.наук : 06.02.01 / Хабибрахманова Язиля Аминовна. - Лесные Поляны. - 2009. -23 с. 4. Bovenhuis, H. Associations between milk protein polymorphysms and milk productions traits / H. Bovenhuis, J. A. M. Van Arendock, S. Korver // J. Dairy Sci. - 1992. - 75. - P. 2549. 5. Medrano, J. F. Polymerase chain reaction of bovine p-lactoglobuline genomic sequences and identification of genetic variants by RFLP analysis. / J. F. Medrano, Е. Aguilar-Cordova // Animal Biotechnology. - 1990. - № 1. - P. 73-77. 6. Tsiaras, A. M. Effect of KappaCasein and Beta-Lactoblobulin Loci on Milk Production Traits and Reproductive Performance of Holstein Cows / A. M. Tsiaras, G. G.
Bargouli, G. Banos [et al.] // J. Dairy Sci. - 2005. - № 88. - P. 327-334.
МОЛОЧНАЯ ПРОДУКТИВНОСТЬ КОРОВ С РАЗНЫМИ ГЕНОТИПАМИ БЕТА-ЛАКТОГЛОБУЛИНА
Ахметов Т.М., Тюлькин С.В., Валиуллина Э.Ф.
Резюме
В данной работе представлены результаты влияния генотипа бета-лактоглобулина на молочную продуктивность черно-пёстро х голштинских коров. Наибольшая молочная продуктивность (удой, содержание и количество молочного белка) была у коров, несущих в своем геноме А аллель бета-лактоглобулина.
MILK PRODUCTION HOLSTIEN BLACK-AND-WHITE COWS WITH DIFFERENT GENOTYPES OF BETA-LACTOGLOBULIN GENE
Ahmetov T.M., Tjulkin S.V., Valiullina E.F.
Summary
In the given work effect of beta-lactoglobulin gene polymorphism on milk production holstien black-and-white cows is studied. Cows with of the A allele beta-lactoglobulin gene have more milk production (milk yield, protein content and yield).
УДК 636.2.034:636.2.082.2
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА БЕТА-ЛАКТОГЛОБУЛИНА В СТАДАХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Ахметов Т.М., Тюлькин С.В., Зарипов О.Г.
Казанская государственная академия ветеринарной медицины
Ключевые слова: крупный рогатый скот, бета-лактоглобулин, генотип, полиморфизм, ПЦР, ДНК.
Key words: livestock, beta-lactoglobulin, genotype, polymorphism,
PCR, DNA.
Все белки молока характеризуются наличием генетически обусловленных полиморфных вариантов, отличающихся одной или несколькими аминокислотами. Полиморфизм молочных белков был обнаружен на белковом уровне, а затем, по мере развития молекулярногенетических методов, на уровне последовательности ДНК соответствующих генов. Генотип животного по молочным белкам служит
