CC BY
43
УДК 615.457.4+615.31: 611.018.74:611.841.2
Акулина И.В.1, Москвичев Е.В.1, Поздеева Н.А. 23, Фролычев И.А.2
1ФГОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова» 2Чебоксарский филиал ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Федорова» Минздрава РФ, г. Чебоксары 3АУ Чувашии «Институт усовершенствования врачей» МЗСР ЧР E-mail: ir.ak-na@mail.ru
ГИСТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ РЕПАРАТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ ГЕЛЯ ТЕРПЕНСУЛЬФИДА МЕНТАНОВОГО РЯДА НА РОГОВИЦУ ГЛАЗ КРОЛИКОВ
Изучены гистологические препараты роговицы глаз кроликов под влиянием 2% и 3% геля 2-(1'-гидрокси-4'-изопренил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноата (терпенсульфида ментанового ряда). Обнаружено, что скорость репаративных процессов при применении 3% геля изучаемого терпенсульфида ментанового ряда, по сравнению с данными контрольной группы, была выше. Морфологическая картина роговицы глаз кроликов, получающих 3% гель 2-(1'-гидрокси-4'-изопренил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноата, идентична строению нормальной роговицы.
Ключевые слова: терпенсульфид ментанового ряда, плоскостная непроникающая рана, ре-
парационная активность, кролики, роговица.
Актуальность
Последние годы отмечены ростом количества глазной травмы и ее тяжести [2]. Причем на поражения роговицы и их последствия приходится более 30% от общего числа заболеваний глаз [4]. В большинстве этих случаев эффективным и радикальным методом лечения остается микрохирургия. Однако наряду с дальнейшим совершенствованием хирургических методов лечения актуальным направлением остается разработка и внедрение новых, эффективных лекарственных препаратов, направленных на стимуляцию регенераторных процессов роговицы глаза [5]. К таковым потенциальным препаратам можно отнести гель серосодержащего терпеноида мен-танового ряда 2-(1/-гидрокси-4/-изопренил-1/-метилциклогексил-2/-тио)-метилэтаноат в виде 2%, 3% концентраций для наружного применения, созданный на кафедре общей и органической химии Казанского государственного медицинского университета под руководством заведующей кафедрой профессора Л.Е. Никитиной [1, 7].
Цель работы
Целью настоящего исследования явилось морфологическое изучение регенераторного действия 2%, 3% геля 2-(1/-гидрокси-4/-изопре-нил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтано-ата на модели плоскостной непроникающей раны роговицы глаза у кролика.
Материалы и методы
Экспериментальная работа выполнена на 50 глазах 25 кроликов породы Schinschilla массой 2,0-3,0 кг, у которых на двух глазах была выполнена несквозная плоскостная трепанаци-онная рана роговицы диаметром 4 мм с захватом переднего эпителия, боуменовой мембраны и частично стромы роговицы [6]. При проведении всех экспериментальных исследований руководствовались требованиями «Международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985)», приказом Минздравсоцраз-вития России от 19.06.2003 №267 «Об утверждении правил лабораторной практики Российской Федерации».
Животные были распределены на 5 групп по 5 животных в каждой группе: 2 опытные и 3 группы контроля. Опытным животным, разделенным на две опытных группы в глаза ин-стиллировали соответственно 2% и 3% гель
2-(1'-гидрокси-4'-изопренил-1'-метилцикло-гексил-2'-тио)-метилэтаноата 3 раза в день ежедневно в течение 3 недель после операции. Животные в первой группе контроля (интакт-ная группа) гелей и мазей не получали. Кролики во второй группе контроля получали 1% тет-рациклиновую глазную мазь 3 раза в день ежедневно в течение 3 недель, в третьей группе контроля получали «плацебо» (гель, не содержащий 2-(1 '-гидрокси-4'-изопренил-1 '-метилцик-логексил-2'-тио)-метилэтаноат.
Кроликов выводили из эксперимента под внутривенным наркозом этаминалом-натрия в дозе 50 мг/кг методом воздушной эмболии через ушную артерию. Материал для морфологического исследования забирался непосредственно после операции, а также 1, 3, 7, 14, 21 сутки после нанесения плоскостной непроникающей раны путем энуклеации глазных яблок по обычной методике. Глаза животных фиксировали в 10% нейтральном забуферном растворе формалина (рН 7,4) в течение 24 ч, обезвоживали в спиртах, заливали в парафин, с последующим формированием срезов толщиной 57 мкм. Выполнялось не менее 100 срезов с различных участков роговицы каждого глазного яблока. Полученные срезы окрашивали по стандартной методике гематоксилин-эозином, и пикрофуксином по методу Ван Гизона. Изучение микропрепаратов проводили на световом микроскопе фирмы Leica модели DM 4000 при увеличении х400 раз [3].
Результаты и обсуждение
В ходе морфологического исследования микропрепаратов ран роговицы глаз кроликов всех групп в исходном состоянии констатировали наличие плоскостной непроникающей раневой поверхности роговицы. Поверхность раны роговой оболочки ровная, лишена эпителия, передняя пограничная (боуменовая) оболочка роговицы повреждена (рис.1а, цветная вкладка). В строме роговицы наблюдаются признаки выраженной экссудативной реакции с разрыхлением волокон, в поверхностных слоях количество фибробластов уменьшено, наблюдается повреждение коллагеновых волокон (рис.1б, цветная вкладка).
На 1-е сутки эксперимента в дне раны отмечаются зоны отека стромы, передняя пограничная оболочка повреждена, роговица в зоне трепанации деэпителизирована. Сходная гистоморфо-логическая картина наблюдается у животных, получающих 2% и 3% гель 2-(1/-гидрокси-4/-изоп-ренил-1/-метилциклогексил-2/-тио)-метилэтано-ата, а также во всех группах контроля.
По данным гистологических исследований на
3-и сутки эксперимента на препаратах контрольной серии и в группе, получавшей «плацебо» (рис. 2а, цветная вкладка), отмечаются умеренно выраженные явления регенерации роговицы. Эпителиальные клетки наползают с периферии
роговой оболочки к центру. Наблюдается мета-хромазия коллагеновых волокон собственного вещества, выраженная лейкоцитарная инфильтрация с небольшим количеством эозинофильных лейкоцитов субэпителиальных отделов.
В опытных группах, получающих тиотер-пеноид и препарат сравнения тетрациклин, явления регенерации на 3-и сутки более выражены по сравнению с контролем. На препаратах опытных серий роговица эпителизирована на 50% от площади раневой поверхности. Эпителий на поверхности роговицы в 1-2 ряда, недифференцированный. При изготовлении препарата эпителиальный слой легко отслаивается от боуменовой мембраны (рис. 2б, цветная вкладка). В поверхностных слоях стромы значительно уменьшено количество фибробластов. Строма отечная, по периферии отмечается миграция к центру полиморфно-ядерных лейкоцитов.
На микропрепаратах роговицы животных, изготовленных через 7 суток после начала эксперимента, в группе, получавшей 2%, 3% гель 2-(1/-гидрокси-4/-изопренил-1/-метилциклогек-сил-2'-тио)-метилэтаноата и 1% тетрациклино-вую мазь, отмечена полная эпителизация раневого дефекта. Растущий эпителий состоит из клеток удлиненной формы с вытянутыми ядрами по их длиннику, расположенными между собой практически параллельно и имеющие оксифиль-ную цитоплазму. Эпителиоциты расположены в 2-3 слоя. Отмечается разрыхление и фрагментация волокон передней пограничной мембраны. Строма роговицы отечная, рыхлая, отмечается уменьшение миграции полиморфно-ядерных лейкоцитов в строму роговицы. В верхней трети стромы определяются единичные фибробласты. Отношение толщины рубца к толщине интакт-ной роговицы составляет 20%. В структуре рубцовой ткани преобладает волокнистый компонент (рис. 3а, цветная вкладка).
На микропрепаратах контрольной группы животных, а также в группе животных, получавшей «плацебо» к данному сроку заканчивается эпителизация роговой оболочки. Встречаются мелкие очаги деэпителизированной роговицы. По периферии конъюнктивальный эпителий в виде вала врастает на поверхность роговой оболочки. Эпителий многослойный, ближе к центру эпителиальный слой становится более упорядоченным, клетки цилиндрические, ядра плоские. В участках вновь образованного эпителия
количество слоев на 2-3 слоя превышает толщину интактного эпителия. Строма роговицы отечная, рыхлая, инфильтрирована полиморфноядерными лейкоцитами, единичными макрофагами. Наблюдается выраженная пролиферация фибробластов, которые имеют разнонаправленный ход. Отношение толщины рубца к толщине интактной роговицы составляет 26%. В структуре рубцовой ткани преобладает клеточный компонент (рис. 3б, цветная вкладка).
На 14 сутки с начала эксперимента в опытной группе, получавшей 2% гель тиотерпенои-да ментанового ряда, поверхность роговицы покрыта эпителием в 3-4 перекрывающих друг друга клеточных слоя, эпителий дифференцированный. Наблюдается разрыхление и некоторая фрагментация волокон передней переходной оболочки и коллагеновых волокон собственного вещества роговицы. Среди коллагеновых волокон отмечены единичные эозинофи-лы и плазматические клетки. Отношение толщины рубца к толщине интактной роговицы составляет 4,8%. В структуре рубцовой ткани преобладает волокнистый компонент, визуализируются единичные клеточные элементы.
Гистоморфологическая картина роговицы глаза кроликов, получающих 3% гель 2-(1'-гид-рокси-4/-изопренил-1/-метилциклогексил-2/-тио)-метилэтаноата, идентична строению нормальной роговицы. Поверхностный слой эпителия состоит из 4-5 слоев многослойного плоского неороговевающего эпителия, прилегающего к боуменовой оболочке. Собственное вещество роговой оболочки представлено параллельно расположенными коллагеновыми волокнами, верхние слои которых более компактно прилежат к боуменовой оболочке (рис. 4а, цветная вкладка).
На микропрепаратах передний эпителий роговицы кроликов, получавших 1% тетрацик-линовую мазь, истончен, местами, до 1-2 слоев клеток, но в основном определяются три слоя клеток. Среди волокон передней пограничной мембраны определяется рассеянный лимфоцитарный инфильтрат, в основном, состоящий из зрелых плазматических клеток. Эпителий в зоне воспалительной инфильтрации истончен до одного - двух слоев клеток. Местами в цитоплазме эпителиальных клеток определяются зернистые оксифильные гранулы. Отношение толщины рубца к толщине интактной ро-
говицы составляет 6%. В структуре рубцовой ткани преобладает клеточный компонент.
Роговица животных группы контроля и группы «плацебо» на 14-е сути после начала эксперимента имела схожее строение. Клетки переднего эпителия роговицы лежат в 4-5 слоев, эпителиальный пласт утолщен (в 1,5-2 раза толще, чем в норме), местами определяется неглубокое акантотическое погружение эпителия в переходную мембрану. Клетки базального слоя эпителия роговицы увеличены в размерах, с крупными ядрами не имеют базальной ориентировки. Отек и инфильтрация стромы значительно уменьшились, по сравнению с гистомор-фологическими данными 7-х суток, встречаются единичные фибробласты. Отношение толщины рубца к толщине интактной роговицы составляет 11,7% (рис.4б, цветная вкладка).
Цитоархитектоника эпителиального регенерата на 21-е сутки у всех групп животных, как опытных, так и контрольных, соответствовала картине опытов, проведенных на14-е сутки. Так в опытной группе, получающей 2% гель 2-(1'-гид-рокси-4/-изопренил-1/-метилциклогексил-2/-тио)-метилэтаноата, отмечена полная эпителиза-ция раневого дефекта, многослойность эпителиального пласта: поверхность роговицы покрыта эпителием в 4-5 перекрывающих друг друга клеточных слоя. Боуменова оболочка и собственное вещество роговицы структурированы. Гистомор-фологическая картина роговицы глаза кроликов, получающих 3% гель 2-(1/-гидрокси-4/-изопре-нил-1 /-метилциклогексил-2/-тио)-метилэтаноа-та идентична строению нормальной роговицы.
У кроликов, получавших 1% тетрацикли-новую мазь, поверхность роговицы покрыта 45 слоями плоскоклеточного неороговевающего эпителия, представленного бокаловидными клетками с характерным для клеток эпителия роговицы ядерно-цитоплазменным индексом. Среди волокон передней пограничной мембраны и стромы роговицы встречаются единичные плазматические клетки.
На микропрепаратах роговицы животных контрольной группы и группы, получавшей «плацебо» наряду с полной эпителизацией дефекта, на фоне многослойного эпителиального пласта, отмечается очаговый паракератоз собственного вещества в зоне альтерации, что свидетельствует о нарушении прозрачности роговицы глаза кроликов.
Результаты наблюдений за экспериментальными животными и морфологические исследования роговицы с поврежденным эпителием показали большую эффективность 3% геля 2-(1'-гидрокси-4/-изопренил-1/-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноата по сравнению с данными контрольной группы, а также c группой получающей 1% тетрациклиновую мазь, о чем свидетельствует раннее заполнение просвета раневого канала эпителиальной пробкой в первые 3 дня наблюдения на фоне применения изучаемого препарата. В группе, получающей гель 2-(1'-гидрокси-4/-изопренил-1/-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноатом, на 3 и 14 сутки после ранения отмечали менее выраженный отек стромы вокруг поражения, быструю регрессию эпителиальной пробки, раннюю миграцию фиброб-ластов. К последнему сроку исследования в опытных группах отсутствовали явления отека роговицы, отношение толщины рубца к толщине роговицы кроликов интактной группы было в среднем в 1,5 раза ниже, чем этот же показатель в контрольной группе. Признаком благоприятного воздействия изучаемого серосодержащего тер-пеноида ментанового ряда на структуру рубца было преобладание волокнистого компонента
над клеточным пролифератом [8]. Сравнение результатов опытной группы, получающей изучаемый тиотерпеноид, с группой животных, получающих «плацебо», указывает на индифферентность состава геля в части влияния на регенераторную активность и доказывает, что репе-ративный эффект обусловлен действием 2-(1'-гидрокси-4'-изопренил-1'-метилциклогексил-2/-тио)-метилэтаноата.
Заключение
Таким образом, применение 3% геля 2-(1'-гидрокси-4'-изопренил-1'-метилциклогексил-2/-тио)-метилэтаноата способствует более раннему наступлению репаративных процессов роговицы, позволяя добиться более прозрачного заживления роговицы и значительного сокращения сроков восстановительного лечения. Поэтому 3% гель 2-(1/-гидрокси-4/-изопренил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноата позволяет рассматривать его в качестве перспективного репаранта и рекомендовать его в качестве стимулятора репарации роговицы после травм и после оперативных вмешательств, а также для лечения пациентов с патологией глазной поверхности.
---------------------------- 10.02.2013
Список литературы:
1. Никитина Л.Е., Артемова Н.П., Старцева В.А., Сиразиева Е.В., Дорофеева Л.Ю., Глушко Н.И., Лисовская С.А., Гараев Р.С., Акулина И.В. 2-(Г-гидрокси-4’-изо-пренил-Г-метил-циклогексил-2’-тио) метилэтаноат, обладающий фунгицидным и про-тивовспалительным действием: заявка на изобретение №2010130104 от 20.11.2010.
2. Гундорова Р.А., Нероев В.В., Кашников В.В. Травмы глаза. - 2009. - 560 с.
3. Коржевский Д.Э., Гиляров А.В. Основы гистологической техники / Д.Э. Коржевский, А.В. Гиляров.- СПб: СпецЛит, 2010.95 с.
4. Кун Ф. Травматология глазного яблока / Ф. Кун; пер. с англ.; под ред. В.В. Волкова. - М.: Логосфера, 2011. - 576 с.
5. Сысуев Б.Б., Смирнов А.В., Митрофанова И.Ю. Изучение морфологических особенностей процессов репарации кожных ран под влиянием глазных капель бишофита // Современные проблемы науки и образования. - 2011. - №5. [Электронный ресурс]. URL: http://www.science-education.ru/99-4787.
6. Сернов Л.Н., Гацура В.В. Элементы экспериментальной фармакологии / Л.Н. Сернов, В.В. Гацура. - М.: ВНЦБАВ, 2000. -135 с.
7. Akulina I.V., Nikitina L.E., Artemova N.P.et al. Estimation of influence of 2-(1-hydroxy-4-isopropenyl-1-methylcyclohexyl-2-thio)-methylethanoate on lipidperoxidation and antioxidant system of animals in chronic proliferative inflammation // International journal of applied and fundamental research. - 2011. - №10. - P. 5.
8. Qin Li, Ken Fukuda, Ying Lu, Yoshikuni Nakamura, Tai-ichiro Chikama, Naoki Kumagai, and Teruo Nishida. Enhancement by neutrophils of collagen degradation by cornealfbroblasts // Journal of Leukocyte Biology. - 2003. - Vol.74 [Электронный ресурс]. URL: http://wwwjleukbio.org/content/74/3/412.full.pdf.
Сведения об авторах:
Акулина Ирина Владимировна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры фармакологии и биохимии Чувашского государственного университетв им. И.Н. Ульянова, e-mail: ir.ak-na@mail.ru Москвичев Евгений Васильевич, доцент кафедры нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией Чувашского государственного университетв им. И.Н. Ульянова, кандидат медицинских наук, e-mail: moskvichev@rambler.ru 428015, Чувашская Республика, г. Чебоксары, Московский пр-т, д. 15,
Поздеева Надежда Александровна, заместитель директора по научной работе Чебоксарского филиала «МНТК «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н.Федорова» Минздрава России, доцент курса глазных болезней АУ Чувашии «Институт усовершенствования врачей» Минздравсоцразвития Чувашии, кандидат медицинских наук
Фролычев Иван Александрович, младший научный сотрудник Чебоксарского филиала МНТК «Микрохирургия глаза», e-mail: ivan-f@yandex.ru 428028 Чебоксары, пр. Тракторостроителей, 10. тел.: (8352)305081, e-mail: npozdeeva@mail.ru
UDC 615.457.4+615.31: 611.018.74:611.841.2 Akulina I.V., Мoskvichev Е^., Pozdeyeva N^., Frolychev I.A.
E-mail: ir.ak-na@mail.ru
HISTOMORPHOLOGICAL MONITORING OF REPARATIVE ACTIVITY OF GEL 2-(1’-HYDROXI-4’-ISO-PROPENIL-1’-METHYLCYCLOGEXIL-2’-TIO)-METYLETANOAT ON THE CORNEA OF EYES OF RABBITS
Histological preparations of corneas of rabbits under the influence of the 2% and 3% gel of 2-(1-hydroxy-4-isopropenyl-1-methylcyclohexyl-2-thio)-methylethanoate (sulphur containing terpenoid of mentan series) were studied. It is found that the rate of repair processes in the application of 3% gel of sulphur containing terpenoid of mentan series, compared to the data of the control group was higher. The morphological picture of the corneas of rabbits treated with 3% gel of 2-(1-hydroxy-4-isopropenyl-1-methylcyclohexyl-2-thio)-methylethanoate is identical to the structure of the normal cornea of rabbits.
Key words: terpenesulphide of terpane series, flat non-penetrating wound, reparative activity, rabbits, cornea.
Bibliography:
1. Nikitin L.E., Artemov N.P., Startseva V.A., Sirazieva E.V., Dorofeeva L.Y, Glushko N.I., Lisovskaya S.A., Garayev R.S., Akulina I.V. Metiletanoat having fungicidal and anti-inflammatory action: application for invention 2010130104: publ. 20.11.2010.
2. Gundorova P.A., Neroev V.V., Kashnikov V.V. Eye traumas. - М., 2009. - 560p.
3. Korzhevsky D.E., Gilarov A.B. Fundamentals of histological techniques / D.E. Korzhevsky, A.V. Gilyarov. - St. Petersburg: SpetsLit, 2010. - 95 p.
4. Kun F. Ocular Traumatology. - М.: Logosphera, 2011. - 576 p.
5. Sysuyev B.B., Smirnov A.V., Mitrofanov I.Yu. Morphological features of the processes of repair of skin wounds under the influence of eye drops bischofite // Modern problems of science and education. - 2011. - №5. [Electronic resource]. URL: http://www.science-education.ru/99-4787.
6. Sernov L.N., Gatsura V.V. Elements of Experimental Pharmacology / L.N. Sernov, V.V. Gatsura. - Moscow: VNTSBAV, 2000. - 135 p.
7. Akulina I.V., Nikitina L.E., Artemova N.P.et al. Estimation of influence of 2-(1-hydroxy-4-isopropenyl-1- methylcyclohexyl-2-thio)-methylethanoate on lipidperoxidation and antioxidant system of animals in chronic proliferative inflammation / / International journal of applied and fundamental research. - 2011. - №10. - P. 5.
8. Qin Li, Ken Fukuda, Ying Lu, Yoshikuni Nakamura, Tai-ichiro Chikama, Naoki Kumagai, and Teruo Nishida. Enhancement by neutrophils of collagen degradation by corneal?broblasts // Journal of Leukocyte Biology. - 2003. - Vol.74 [Electronic resource]. URL: http://www.jleukbio.org/content/74/3/412.full.pdf.
