CC BY
33
УДК 617.7-001.17-089.844
клинико-морфологические аспекты применения наноструктурированного биоматериала на основе гиалуроновой кислоты при ожогах роговицы
Владимир Николаевич КАНЮКОВ1, Александр Абрамович СТАДНИКОВ2, Ольга Михайловна ТРУБИНА1, Ольга Михайловна ЯХИНА1
1 Оренбургский филиал ФГБУМНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Минздрава России
460047, г. Оренбург, ул. Салмышская, 17
2 ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздрава России 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6
Цель работы - изучить течение щелочного и кислотного ожогов роговицы при применении биопластического материала на основе гиалуроновой кислоты. Исследование выполнено на 36 кроликах (72 глаза) в двух сериях: в 1-й серии формировали щелочной (18 кроликов), а во 2-й - кислотный ожог роговицы (18 кроликов), при этом в опытной группе проводили аппликацию «Гиаматрикса», а в контрольной применяли глазной гель Солкосерил. «Гиаматрикс» - биоматериал, полученный из исходного гидрогеля гиалуроновой кислоты путем ультрафиолетового облучения. Обнаружено, что применение биоматериала создает условия для ускорения эпителизации, а также способствует сокращению течения экссудативной фазы воспаления, более быстрому переходу в завершающую пролиферативную фазу и сокращению сроков реабилитации.
Ключевые слова: биоматериал «Гиаматрикс», ожог роговицы, гиалуроновая кислота, регенерация, асептическое воспаление.
введение
Ведущее место в структуре глазного травматизма принадлежит ожогам глаз, которые характеризуются большим количеством неблагоприятных исходов [2, 3, 5-7]. Патологический механизм ожоговой болезни и ее последствий является многофакторным. Совокупность взаимодействия физиологических и биохимических изменений при ожогах глаз приводит к нарушению регенераторных процессов в роговице [1].
Целью лечения в остром периоде ожога глаз являются коррекция процесса асептического воспаления, ускорение восстановления поверхности глаза (эпителизации), профилактика вторичной инфекции, контроль гипертензии и купирование болевого синдрома [2, 5]. Однако консервативное лечение не гарантирует полного восстановления прозрачности роговой оболочки и зрительных функций из-за развития осложнений. Вследствие этого возникает необходимость применения хирургических методов лечения, таких как частич-
ное удаление участков некротизированной конъюнктивы, покрытие амниотической мембраной, трансплантация лимбальных стволовых клеток, трансплантация культивированных стволовых клеток роговичного эпителия в остром периоде ожога глаз [1-3, 7].
В отдаленном периоде ожоговой болезни глаз с целью реабилитации зрительных функций, как правило, выполняется сквозная или послойная кератопластика с одновременной реконструкцией переднего отрезка глаза в случае необходимости, кератопротезирование, успех которых зависит от структуры сформировавшегося бельма [3, 7]. Ре-паративные процессы роговицы изучены и описаны, однако вопрос возможности воздействия на них при той или иной патологии продолжает оставаться нерешенным [5, 8].
Цель работы - изучить течение щелочного и кислотного ожогов роговицы при применении биопластического материала на основе гиалуро-новой кислоты.
Канюков В.Н. - заслуженный врач РФ, проф., директор Стадников А.А. - заслуженный деятель науки РФ, проф., зав. кафедрой Трубина О.М. - к.м.н., доцент, заместитель директора по науке Яхина О.М. - врач-офтальмолог
материал и методы
Работа выполнена на 36 кроликах (72 глаза) в двух сериях: в 1-й серии эксперимента формировали щелочной (18 кроликов), во 2-й - кислотный ожог роговицы (18 кроликов), при этом в опытной группе оценивали влияние «Гиаматрикса» на репаративные процессы, а в контрольной - применяли глазной гель Солкосерил. Щелочной или кислотный ожог вызывали аппликацией фильтровальной бумаги (в виде круга диаметром 8 мм), смоченной 2,5 % раствором гидроксида натрия или 3 % раствором уксусной кислоты соответственно в течение 5 с на роговицу под местной анестезией 0,4 % инокаином. «Гиаматрикс» представляет собой биопластический материал, полученный из исходного гидрогеля гиалуроновой кислоты, который подвергали воздействию ультрафиолетового облучения. Он разрешен к применению в общей и пластической хирургии (регистрационное удостоверение ФСР 2011/10313 от 18.03.2011) [4].
Состояние животных оценивали клинически по признакам: характер инъекции конъюнктивы и ее выраженность, отек конъюнктивы, диаметр дефекта роговицы после окрашивания 0,1% раствором флуоресцеина натрия, интенсивность помутнения роговицы. На сроках 3, 7, 14, 30 и 90 суток животных выводили из эксперимента для проведения светооптической и электронной микроскопии, иммуноцитохимических исследований.
результаты
Оценка стромального помутнения в опытной группе показала, что у всех экспериментальных животных оно занимало оптическую зону роговицы и сохранялось до 7 суток, а к 14 суткам уменьшалось до круга диаметром 4 мм, на месте которого формировалось стойкое помутнение, занимающее 1/3 часть роговицы, и у 4 кроликов сопровождалось неоваскуляризацией. При этом в контрольной группе помутнение роговицы сохранялось до 30 суток, на месте ожога отмечали формирование стойкого помутнения, которое занимало 2/3 роговицы и у 5 кроликов сопровождалось неоваскуляризацией.
Сразу после действия 3 % раствора уксусной кислоты в обеих группах, несмотря на отсутствие прокрашивания роговицы флуоресцеином, отмечались признаки роговичного синдрома: блефа-роспазм, светобоязнь, слезотечение. При биомикроскопии определяли инъекцию конъюнктивы, помутнение роговицы в области контакта с детергентом за счет отека эпителия. Отек роговицы на всех глазах опытной группы сохранялся до 7 суток, в то время как в контрольной группе - до 14
суток. Инъекция конъюнктивы в опытной группе усиливалась в первые 3 суток после аппликации, что могло быть связано с фиксацией биоматериала мягкой контактной линзой, а затем отмечась положительная динамика и полное исчезновение инъекции к 8-9 суткам. В контрольной группе инъекция конъюнктивы уменьшалась медленнее и проходила полностью к 14 суткам.
Морфологическое исследование течения щелочного ожога свидетельствовало о том, что повреждение переднего эпителия закономерно приводило к изменению местного обмена веществ; кроме того, развивалась интоксикация продуктами распада поврежденных клеток, которая особенно была выражена ввиду анатомических особенностей строения роговицы и ее кровоснабжения. Клинически это проявлялось резким увеличением отека и инъекции конъюнктивы, отеком роговицы, блефароспазмом, светобоязнью, слезотечением, помутнением роговицы в первые 7-10 суток, что характерно для острой фазы ожога. Повреждались не только те ткани, которые были подвергнуты прямому воздействию щелочи, но и глубжележащие структуры.
Светооптическое исследование на 3 сутки после щелочного ожога в обеих группах показало десквамацию клеток переднего эпителия, отек и дискомплексацию волокон собственного вещества роговицы (рис. 1), а применение биополимера гиалуроновой кислоты, кроме этого, сопровождалось лимитированием эпителизации раневой поверхности роговицы (рис. 2).
На сроке 7 суток на глазах кроликов опытной группы обнаруживали эпителиальные пролифе-раты погружного и покровного характера и отмечали наличие новообразованного эпителиального пласта в центральной зоне повреждения тканей роговицы (рис. 3), а в контрольной группе - лишь формирование малодифференцированной соединительной ткани (рис. 4).
Существенным являлось то обстоятельство, что по мере продолжения развития деструктивного процесса (сроки 7 и 14 суток) в прилежащих к некротизированным тканям участках возникало выраженное вторичное реактивное воспаление. Оно характеризовалось вазодилатацией, экстра-вазацией плазмы и форменных элементов крови с формированием демаркационной зоны. Демаркационная линия в исследованных участках глаза была выражена слабо, а в лимбальной зоне она отсутствовала. Это приводило к утяжелению и про-грессированию некротических процессов эпителиальных и соединительнотканных структур.
Альтерация тканей роговицы не сопровождалась адекватной экссудативной (сосудистой) и продуктивной (пролиферативной) реакциями,
Рис. 1. Световая микроскопия. Щелочной ожог роговицы, 3 сутки, контрольная группа. Ув. 400. Окраска: гематоксилин-эозин. Отек и дискомплексация волокон собственного вещества роговицы. Десквамация клеток переднего эпителия
Рис. 3. Световая микроскопия. Щелочной ожог роговицы, 7 сутки, опытная группа. Ув. 400. Окраска: гематоксилин-эозин. Эпителиальные пролифераты (погружного и покровного характера)
что свидетельствовало о сохранении дистрофических процессов в моделируемых условиях. Таким образом, фокус воспаления в связи с процессами экссудации не в полной мере выполнял дренажную и элиминативную функции при ожоговой травме роговицы в контрольной группе.
Преобладающее большинство эмигрирующих лейкоцитов составили сегментоядерные ней-трофилы, значительно реже экстравазации подвергались лимфоциты, моноциты, базофильные гранулоциты и эозинофилы. Клетки продвигались в зону повреждения роговицы между волокнистыми структурами по направлению к центру воспаления, где и наблюдалось их наибольшее скопление.
В области повреждения роговицы и прилежащих участков конъюнктивы по мере угасания воспалительного процесса происходила активи-
Рис. 2. Световая микроскопия. Щелочной ожог роговицы, 3 сутки, опытная группа. Ув. 80. Окраска: гематоксилин-эозин. Лимитирование эпителизации раневой поверхности роговицы
Рис. 4. Световая микроскопия. Щелочной ожог роговицы, 7 сутки, контрольная группа. Ув. 400. Окраска: гематоксилин-эозин. Формирование малодифференцирован-ной соединительной ткани
зация камбиальных клеток и клеток фибробла-стического дифферона, что было более выражено в опытной группе, чем в контрольной. При этом образовывались волокнистые структуры без разрастаний эпителиальной ткани. Обобщая полученные результаты, можно сделать вывод о том, что щелочное повреждение роговицы экспериментальных животных (кроликов) приводило к развитию некротического воспаления.
На фоне восстановления гемомикроцирку-ляции (до трех месяцев с момента ожога) развивались пролиферативные и регенераторные процессы, которые обеспечивали впоследствии образование коллагеновых волокон и межуточного вещества стромы поверхностных тканей глаза. В процессе регенерации участки некроза ткани заполнялись не специфической стромальной тканью, а соединительной с формированием рубца.
На протяжении стадии ранних исходов ожогового процесса, до 90 суток с момента ожога, субэпителиально осуществлялись фибропластиче-ские процессы, формировалась грануляционная ткань.
В сроки свыше 2 недель процессы в обеих группах были сходными, ведущими к стабилизации раневого процесса. Однако их завершение в опытной группе протекало быстрее. Для подтверждения этого было проведено иммуноци-тохимическое исследование, которое показало, что при применении биополимера гиалуроновой кислоты снижалась апоптотическая доминанта эпителиоцитов и фибробластов роговицы, взятой для исследования на 3 и 15 сутки эксперимента. С другой стороны, возрастала экспрессия протеина Ьс12, что свидетельствовало о выраженности пролиферативной фазы воспаления. В целом результаты иммуноцитохимического исследования подтверждали тот факт, что аппликация биополимера гиалуроновой кислоты оптимизирует репа-ративные гистогенезы с включением механизмов лимитирования экспрессии проапоптотическо-го гена р53, снижая число иммунопозитивных эпителиоцитов в 2,5-3 раза по сравнению с контрольной группой.
Морфологические изменения роговицы при кислотном ожоге имели особенности и соответствующую клиническую картину. Они представляли собой коагуляционный некроз поверхностных слоев с формированием плотного струпа на роговице, что обусловило роговичный синдром, но не дало возможности прокрашивания стро-мы флуоресцеином. На сроке наблюдения 3 суток светооптическое исследование показало, что клетки переднего эпителия роговицы животных обеих групп были повреждены, в мелких сосудах формировались тромбы, при этом плазма выходила в окружающие ткани, что клинически проявлялось отеком конъюнктивы. Кроме деструктивных изменений эпителиоцитов, отмечались нарушения в строме, которые строго соответствовали участку ожога и захватывали не менее 1/3 толщины стромы. Морфологически определяли признаки токсического действия продуктов распада поврежденных клеток. Таким образом, при кислотном ожоге, в отличие от щелочного, возникал коагуляционный (сухой) некроз - кислотная денатурация белков, благодаря которой кислота не проникала в подлежащие слои ткани. При проведении световой и электронной микроскопии выявлено, что процессы регенерации в опытной группе протекали активнее, чем в контрольной. Это выражалось в более быстрой эпителизации поврежденного участка роговицы, митотической активности клеток переднего эпителия.
При иммуноцитохимическом исследовании установлено, что, также как и при щелочном ожоге, при кислотном ожоге в роговице снижалась апоптотическая доминанта эпителиоцитов и фи-бробластов, но возрастала экспрессия белка bcl2, свидетельствующая о выраженности пролифера-тивной фазы воспаления.
На сроке от 30 суток и выше наблюдали завершение фибробластических процессов как в опытной, так и в контрольной группе.
заключение
Полученные в ходе проведенного экспериментального исследования данные свидетельствуют об оптимизации процессов эпителизации раневой зоны, стимуляции митотической активности базальных и шиповатых клеток переднего эпителия, лимитировании апоптотической доминанты эпителиоцитов и фибробластов собственного вещества роговицы в условиях применения биоматериала, что также было подтверждено им-муноцитохимическим исследованием.
Применение аппликации биопластического материала на начальном этапе лечения химического ожога роговицы способствовало стабилизации эпителио-соединительнотканных взаимоотношений в более ранние сроки эксперимента, создавало условия для ускорения эпителизации, а также способствовало сокращению течения экс-судативной фазы воспаления, более быстрому переходу в завершающую пролиферативную фазу и сокращению сроков реабилитации.
список литературы
1. Дадашева З.Р. Хирургическая тактика при лечении тяжелой и особо тяжелой ожоговой травмы глаз: автореф. дис. ...канд. мед. наук. М., 2004.
2. Макаров П.В., Гундорова Р.А., Чернетс-кий И.С., Оганесян О.Г. Лимбальная трансплантация в хирургической реабилитации пациентов, перенесших тяжелые ожоги глаз // Вестник офтальмологии. 2007. 123. 3. 9-12.
3. Мороз З.И. Современные направления хирургического лечения патологии роговицы // Съезд офтальмологов России, 9-й: тез. докл. М.: 2010. 298-299.
4. Рахматуллин Р. Р. Биопластический материал на основе гиалуроновой кислоты: биофизические аспекты фармакологических свойств // Фармация. 2011. 4. 36-39.
5. Севостьянов А.Е. Использование фитоэк-дистероида (экдистен) при заболеваниях роговицы с повреждением переднего эпителия (экспериментально-клиническое исследование): автореф. дис. ... канд. мед. наук. Самара, 2010.
6. Ульянов А.Н., Шиловских О.В., Фечин О.Б. Первый опыт реконструкции поверхности роговицы методом конъюнктивально-лимбальной трансплантации в реабилитации пациентов с ожоговыми бельмами // Офтальмохирургия. 2008. 1. 9-12.
7. Per Fagerholm, Neil S. Lagali, David J. Carlsson, Kimberley Merrett, May Griffith. Corneal
regeneration following implantation of a biomimetic tissue-engineered substitute // Clin. Trans. Sci. 2009. 2. 162-164.
8. Schwab I., Reyes M., Isseroff R.R. Successful transplantation of bioengineered tissue replacements inpatient with ocular surface disease// Cornea. 2000. 343. 421-426.
clinical and morphological aspects of application of hyaluronic acid nanostructured biomaterial at corneal burns
Vladimir Nikolaevich KANYUKOV1, Aleksandr Abramovich STADNIKOV2, Olga Mikhailovna TRUBINA1, Olga Mikhailovna YAKHINA1
1 The S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution Orenburg Branch 460047, Orenburg, Salmishskaya str., 17
2 Orenburg State Medical Academy 460000, Orenburg, Sovetskaya str., 6
The aim of the study was to investigate the course of alkaline and acid corneal burns at bioplastic material based on hyaluronic acid usage. The study was performed on 36 rabbits (72 eyes) in 2 series: in the first series alkaline burn was formed (18 rabbits), and in the second one - the acid burn of the cornea (18 rabbits). At that the application of «Hyamatrix» was conducted in the experimental group and the eye gel «Solkoseryl» - in the control group. "Hyamatrix" is a biomaterial derived from a starting hyaluronic acid hydrogel exposed to ultraviolet irradiation. The application of biomaterial has created the conditions for the epithelialization acceleration and also helped to reduce the course of exudative phase of inflammation, a more rapid transition to the final proliferative phase and reduction of the rehabilitation
Key words: biomaterial «Hyamatrix», corneal burn, experiment, hyaluronic acid, regeneration, aseptic inflammation.
Kanyukov V.N. - honored doctor of the RF, professor, director
Stadnikov A.A. - honored worker of science of the RF, professor, head of department
Trubina O.M. - candidate of medical sciences, associate professor, deputy director for scientific work
Yakhina O.M. - ophthalmologist
