CC BY
126
УДК 617.713-001
Канюков В.Н.1, Стадников А.А.2, Трубина О.М.1, Яхина О.М.1
1Оренбургский филиал МНТК «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова 2Оренбургская государственная медицинская академия E-mail: nauka@ofmntk.ru
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ТРАВМАТИЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЙ РОГОВИЦЫ
На глазах экспериментальных животных (кроликов) смоделированы эрозия роговицы по методу С. Hanna, J-Е. O'Brien, щелочной ожог роговицы по методу Обенбергера, кислотный ожог роговицы по аналогии со щелочным ожогом. Состояние животных оценивалось в динамике: клинически и морфологически. Исследование показало, что данные модели отражают суть репаративных процессов, а данные, полученные при проведении эксперимента, могут быть экстраполированы в клинике.
Ключевые слова: эрозия роговицы, щелочной ожог роговицы, кислотный ожог роговицы, экспериментальная модель.
Актуальность
Современные исследования трудно представить без эксперимента [1]. В биомедицинских исследованиях планирование экспериментального раздела имеет особенно большое значение по причине широкой вариабельности свойств, характерной для биологических объектов. Эта особенность является основной причиной трудностей, связанных с интерпретацией результатов, которые могут значительно различаться от опыта к опыту [2].
Кроме того при проведении любых исследований для достоверной экстраполяции данных, полученных в эксперименте важно учитывать репрезентативность выборки. Поэтому цель планирования эксперимента заключается в создании схемы, которая необходима для получения как можно большей информации при наименьших затратах для выполнения исследования. Более точно планирование эксперимента можно определить как процедуру выбора числа и условий проведения опытов, необходимых и достаточных для решения поставленной задачи с требуемой точностью [2].
Таким образом, каждый раз при планировании исследования перед ученым возникает вопрос о том, как in vivo смоделировать ту или иную патологию.
В ходе проведения экспериментальных исследований удалось ответить на важные вопросы офтальмологии: этиология и патогенез витреоретинальной патологии, прогрессирующей близорукости, глаукомы, тромбоза центральной вены сетчатки и многих других заболеваний, а также установить возможности их предупреждения и лечения. Однако вопрос по-
лучения травматических поражений глаза в эксперименте, особенно их патоморфологическая картина остаются малоизученными, кроме того в доступной литературе описание методики формирования кислотного ожога в эксперименте отсутствовало.
Цель исследования
Представить наиболее достоверные модели эрозии и химического ожога роговицы экспериментальных животных (кроликов).
Материал и методы
Для создания модели травматической эрозии, химического ожога (щелочного и кислотного) экспериментальные исследования были проведены на 120-ти глазах 60-и кроликов в 3-х сериях: в первой - смоделирована эрозия роговицы (20 кроликов, 40 глаз), во второй - щелочной ожог (20 кроликов, 40 глаз) и в третьей - кислотный ожог (20 кроликов, 40 глаз). Состояние животных оценивалось динамически ежедневно в течение семи дней, последующие наблюдения проводились 2 раза в неделю в сроки до 90 суток с фоторегистрацией.
Анализ данных литературы показал, что при формировании эрозии в эксперименте исследователи применяют метод С. Hanna, J.E. O'Brien (1960) [3], согласно которому под местной анестезией (0,4% инокаином) легким прижатием трепана с поршнем диаметром 8 мм на роговицу наносят метку, окрашенную 0,1% раствором флю-оресцеина натрия (рис. 1, цветная вкладка). В пределах метки лезвием соскабливают эпителий роговицы. Дефект эпителия снова окрашивают раствором флюоресцеина для того, чтобы
отчетливее были видны форма и размер эрозии роговицы (рис. 2, цветная вкладка).
В качестве экспериментальной модели щелочного ожога роговицы у кроликов применяют метод Обенбергера [4]. Методика формирования щелочного ожога в эксперименте заключается в следующем: щелочной ожог вызывают аппликацией диска фильтровальной бумаги (в виде круга диаметром 8 мм), смоченной 2,5% раствором гидроксида натрия с экспозицией 5 секунд на роговицу под местной анестезией (0,4% инокаином) (рис. 3, 4, цветная вкладка).
Кислотный ожог в эксперименте формировали по собственному методу по аналогии со щелочным ожогом. Под местной анестезией (0,4% инокаином) аппликацией фильтровальной бумаги (в виде круга диаметром 8 мм), смоченной 3% раствором уксусной кислоты с экспозицией 5 секунд на роговицу (рис. 5, 6, цветная вкладка).
Результаты
Учитывая, что регенераторная активность клеток роговичного эпителия в центре и на периферии различна, а именно в периферической части роговицы она выше, эрозию роговицы формировали в оптической зоне роговицы. Диаметр выполняемой эрозии был выбран нами не более 8 мм.
Клиническое состояние глаз кроликов сразу после нанесения механической травмы характеризовалось признаками роговичного синдрома: светобоязнью, блефароспазмом, слезотечением. У экспериментальных животных объективно при проведении биомикроскопии отмечали: конъюнктивальную инъекцию, поверхностный дефект роговицы.
Оценивая гистологические структуры глаз кроликов при формировании эрозии, определяли большую активность фибропласти-ческих процессов, вызванных эрозией, включающих дистрофические и деструктивные изменения.
В центральной зоне в крае дефекта эпителия клетки переднего эпителия были частично некротизированы, оставшаяся жизнеспособная часть эпителиоцитов была дискомплексирова-на (в ней отсутствовали фигуры митотическо-го деления). Цитоплазма большинства клеток становилась более плотной, распадалась на мелкие глыбки, превращаясь в детритные массы. Коллагеновые фибриллы собственного ве-
щества роговицы подвергались дискомплекса-ции и гомогенизировались.
На периферии клетки эпителия были дифференцированные, располагались в 4 ряда, ближе к центральной зоне в 2 ряда. В строме роговицы отмечали воспалительную реакцию, которая проявлялась миграцией в слои роговицы макрофагов и лимфоцитов, более выраженная на периферии, клеточная реакция с участием фибробластов продолжалась вплоть до 7 суток.
Модель щелочного ожога по Обенбергеру широко используют в нашей стране и за рубежом как для исследования репаративных процессов в глазу при его повреждении, так и для разработки методов лечения, поскольку процессы, развивающиеся после щелочного ожога роговицы у кроликов, соответствуют течению ожогового процесса глаз у человека [4]. Для создания условий приближенных к клинической практике после формирования как щелочного, так и кислотного ожога сразу же проводилось промывание конъюнктивальной полости глаза большим количеством 0,9% раствора хлорида натрия в течение 15 минут. После чего на роговицу помещали полоску индикаторной лакмусовой бумаги на две-три секунды, затем ее сравнивали с прилагаемой цветовой шкалой и вычисляли значение рН. Убедившись в достижении физиологического значения рН роговицы (от 6,8 до 7,5) промывание прекращали, в конъюнктивальную полость инсталлировали 0,4% раствор инокаи-на и 0,3% раствор Ципромеда.
При этом формировался ожог роговицы средней степени тяжести по классификации Б.П. Поляка (1957), характеризующийся следующим симптомокомплексом: светобоязнь; умеренная гиперемия и отек конъюнктивы (хе-моз); незначительное помутнение роговицы, через которое удавалось просмотреть фрагменты радужной оболочки.
Сразу после воздействия щелочи в области контакта с детергентом определяли дефект эпителия роговицы, который прокрашивался флу-оресцеином в виде круга диаметром 7 мм. Воздействие 3% раствора уксусной кислоты на роговицу вызывало поверхностное помутнение. При инсталляции 0,1% раствора флюоресцеина натрия прокрашивание роговицы не отмечали. Но наряду с этим наблюдали признаки роговичного синдрома, а при биомикроскопии - инъекцию конъюнктивы, помутнение роговицы в об-
XXV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием
ласти контакта с детергентом за счет отека эпителия. Влага передней камеры была прозрачной, радужная оболочка с четким рисунком, зрачок диаметром 7 мм, реакция на свет вялая, рефлекс с глазного дна розовый.
Патогенное воздействие химических веществ на роговицу неодинаково. Оно зависит от ионного состава детергента, то есть от принадлежности его к классу кислот либо щелочей [5]. Известно, что щелочи быстро проникают в роговицу, действуя эмульгирующе, вызывая повреждение переднего эпителия (колликваци-онный некроз). Так, например, натриевая щелочь уже по истечении 5 мин. проникает в переднюю камеру глаза, тогда как 30% кислота через тот же промежуток времени не обнаруживается во влаге передней камеры. При этом му-коидные субстраты роговицы подвергаются денатурированию или отсоединяются от коллагена, который является одним из главных компонентов в роговице [5].
Кислоты обычно немедленно свертывают белок роговичного эпителия и вызывают его помутнение (коагуляционный некроз). Поверхностные слои стромы роговицы могут быть повреждены таким же образом, хотя в меньшей степени. Повреждение эндотелия менее выражено, за исключением самых тяжелых случаев, что подтвердило морфологическое исследование. Может развиться легкий отек стромы обычно в месте, прилегающем к участку, поврежденному кислотой. Поврежденный эпителий быстро слущивается и заменяется новыми клетками нормальной прозрачности. В случаях ожогов кислотами вначале может наступить небольшое помутнение роговицы, которое в дальнейшем рассасывается. Впоследствии прозрачность роговицы восстанавливается.
Передний поверхностный эпителий является одной из важнейших структур, обеспечивающих гомеостаз роговицы и глаза в целом, при его повреждении закономерно изменяется местный обмен веществ; кроме того развивается интоксикация продуктами распада повреж-
денных клеток, которая особенно выражена в глазу в виду его анатомических особенностей, строения и кровоснабжения. Ведь отсутствие сосудов в роговице является одной из причин замедленного обмена веществ во внутренних слоях, что имеет отрицательное значение при патологических процессах. Клинически это проявлялось резким увеличением отека и инъекции конъюнктивы, отеком роговицы, блефа-роспазмом, светобоязнью, слезотечением, помутнением роговицы в первые 7-10 суток, что соответствовало острой фазе ожога. Повреждались не только те ткани, которые подверглись прямому воздействию, но щелочь вызывала повреждение глубжележащих структур, как показали морфологические исследования.
При кислотном ожоге с помощью световой микроскопии были определены особенности, обуславливающие соответствующую клиническую картину: повреждения эпителия представляли собой коагуляционный некроз поверхностных слоев с формированием плотного струпа на роговице, что обусловило роговичный синдром, но не дало возможности прокрашивания стромы флуоресцеином и привело к ложно-отрицательному результату пробы. Кроме деструктивных изменений эпителиоцитов, отмечались нарушения в строме, которые строго соответствовали участку ожога и захватывали не менее 1/3 толщины стромы. Морфологически определяли признаки токсического действия продуктов распада поврежденных клеток.
Таким образом, при кислотном ожоге в отличие от щелочного ожога, возникал коагуля-ционный (сухой) некроз - кислотная денатурация белков, благодаря которой кислота не проникала в подлежащие слои ткани.
Заключение
Описанные модели отражают суть репара-тивных процессов с точки зрения доказательной медицины, а данные, полученные при проведении эксперимента, могут быть экстраполированы в клинике.
3.10.2014
Список литературы:
1. Уайтхед, А.Н. Избранные работы по философии / А.Н. Уайтхед. - М.: Прогресс, 1990. - 716 с.
2. Большаков, О.П. Дидактические и этические аспекты проведения исследований на биомоделях и на лабораторных животных / О.П. Большаков, Н.Г. Незнанов, Р.В. Бабаханян // Качественная клиническая практика. - 2002 г. - №1. - С. 58-61.
3. Hanna, C. Cellturnover in the adult human eye / C. Hanna, D.S. Bicknell, J.E. O'Brien // Arch Ophthalmol. - 1961. -Vol. 65. -P. 695-703.
4. Obenberger, J. Paper strips and rings as simple tools for standartization of experimental eye injuries /J. Obenberger // Ophthalmol. Res. - 1975. - Vol. 7. - P. 363-366.
5. Wagoner, M.D. Chemikal injuries of the eye: Current concepts in pathophysiology and therapy / M.D. Wagoner // Surv. Ophthalmol. - 1997. - Vol. 41. - P. 275-312.
Сведения об авторах:
Канюков Владимир Николаевич, директор Оренбургского филиала МНТК «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н.Федорова Минздрава России, доктор медицинских наук, профессор
Трубина Ольга Михайловна, врач-офтальмолог высшей категории, заместитель директора по научной работе Оренбургского филиала МНТК «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н.Федорова, доцент, кандидат медицинских наук
Яхина Ольга Михайловна, врач-офтальмолог Оренбургского филиала МНТК «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н.Федорова, кандидат медицинских наук
460047, г. Оренбург, ул. Салмышская, 17, e-mail: nauka@ofmntk.ru
Стадников Александр Абрамович, Заслуженный деятель науки РФ, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии Оренбургской государственной медицинской академии,
доктор биологических наук, профессор
460000 г. Оренбург, ул. Максима Горького 45, e-mail: alexander.stadnikov@yandex.ru
