CC BY
14
УДК 547.96332.057:542.95
ГИБРИДАЗНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ РНК*. ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДНЫЕ ЗОНДЫ С ВКЛЮЧЕНИЯМИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ НУКЛЕОЗИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ ПРИ С2'-АТОМЕ АМИНО- ИЛИ ГИДРОКСИЛЬНУЮ ГРУППУ
Е. М. Зубин, Н. Ф. Крынецкая, Е. А. Романова**, Т. С. Орецкая***
(кафедра химии природных соединений)
Исследована способность олигодезоксирибонуклеотидов с включениями 2'-амино-2'-дезокси-пиримидиновых нуклеозидов, 2'-амино-2'-дезоксиарабино-аденозина, рибонуклеозидов и ара-биноуридина образовывать дуплексы с комплементарными ДНК-матрицами. Изучены субстратные свойства гибридных дуплексов, образованных 5S РНК рибосом E. coli и синтезированными олигодезоксирибонуклеотидными зондами, по отношению к РНКазе Н из E. coli.
Комплексное решение проблем антисенсовой биотехнологии подразумевает получение такого олигонуклеоти-да, который проникал бы в клетку, существовал в ней определенное время, не будучи при этом токсичным, и образовывал устойчивый комплекс с НК-мишенью [1]. При конструировании такого модифицированного олигонукле-отидного зонда большое значение имеет способность образующегося модифицированного ДНК-РНК-дуплекса выступать эффективным субстратом РНКазы Н. При этом фермент расщепляет РНК в составе гетеродуплекса [2].
В литературе [3] подчеркивается уникальная роль заместителя при С2'-атоме углеводного фрагмента нуклеиновых кислот. Его природа непосредственно влияет на конформационное равновесие
СЗ'-эндо(Ы) . ' С2'-эндо(Б).
Этот факт обусловливает появление многочисленных исследований свойств нуклеозидов и олигонуклеотидов, содержащих различные заместители в этом положении.
Ранее было показано, что использование олигоде-зоксирибонуклеотидных зондов с включениями 2'-О-ме-тилрибо- [4], 2'-фтор- [5] или рибонуклеозидов [6] позволяет провести региоспецифическое гибридазное расщепление РНК РНКазой Н.
Модифицированные нуклеозиды, включенные в состав олигонуклеотидов, изменяли физико-химические и субстратные свойства последних. В настоящее время актуальной задачей является получение одно- и двутяжевых ДНК, содержащих в своем составе группировки, реакционная способность которых отличалась бы от реакционной способности функциональных групп природной ДНК. В рам-
ках этого направления нами был осуществлен синтез олигонуклеотидов, содержащих 2'-амино-2'-дезоксипиримиди-новые звенья [7], а также 2'-амино-2'-дезоксиарабиноаде-нозин [8]. Такие зонды могут быть использованы в антисенсовой терапии, поскольку они устойчивы к действию клеточных нуклеаз, а 2'-аминогруппа в составе олигонуклеотидов проявляет высокую реакционную способность в реакциях с электрофильными реагентами [7, 8]. Это позволит в дальнейшем ковалентно присоединять к олиго-нуклеотидам молекулы, облегчающие проникновение зондов через клеточную мембрану [9].
Настоящая работа является продолжением серии исследований, проводимых в нашей лаборатории, по поиску оптимальной структуры олигонуклеотидного зонда. Ее цель - изучение и последующее сравнение комплемента-ционных свойств олигодезоксирибонуклеотидов, имеющих в своем составе модифицированные нуклеозиды, при С2'-атоме которых содержится гидроксильная или аминогруппа (схема), а также исследование характера взаимодействия образованных ими и фрагментами 5S РНК двуспи-ральных комплексов с РНКазой Н. Особое внимание при этом уделялось тому, в какой степени конфигурация заместителей при С2'-атоме влияет на термическую стабильность полученных НК-дуплексов, выступающих в роли субстратов бактериальной РНКазы Н.
При изучении субстратной специфичности модифицированных гибридных дуплексов была использована РНКа-за Н из E. coli, поскольку она является одним из наиболее изученных ферментов этого класса и имеет большой процент гомологии с РНКазами Н человека и вирусов [10]. Исследование проводили на модельных гетеродуп-
* Под гибридазным расщеплением подразумевается катализируемый РНКазой Н (гибридазой) гидролиз РНК в составе гибридного дуплекса с комплементарным олигодезоксирибонуклеотидом. Префикс «d» (дезокси) при обозначении нуклеозидов и олигонуклеотидов 2'-дезоксиряда опущен.
** НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского.
*** Тел.: (095) 939-3148; Fax: (095) 939-3181; E-mail: [email protected]
Схема
Pyr = Cyt или Ura, R'-R8 - фрагменты олигонуклеотидных цепей
лексах, образованных фрагментами 5S РНК E. coli и модифицированных олигонуклеотидами, структуры которых представлены в табл. 1.
Олигонуклеотиды IV, V и XIII содержат вставки 2'-амино-2'-дезоксирибоцитидина (Cn), 2'-амино-2'-дезоксиа-рабиноаденозина (aAn) и 2'-амино-2'-дезоксирибоуридина
Т а б л и ц а 1
Термическая стабильность модифицированных ДНК-дуплексов
Шифр ДНК-дуплекс 5' ^ 3' 3' ^ 5' Тпл, oC (-1)
A I II ACCACCGCGCT CCTGGTGGCGCGAGTG 63
B III II ACCACrCGCGrCT CCTGGTG GCGC GAGTG 65
C IV II ACCACnCGCGCnT CCTGGTG GCGCG AGTG 53
D V II GaAnCCaAnCCGCGCT CC T GG T GGCGCGAGTG 57
E VI VII CTACTCTCGC GGATGAGAGCGT 50
F VIII VII CTACrUCrUCGC GGATG AG AGCGT 50
G IX VII CTACaUCaUCGC GGATG AG AGCGT 35
H X XI CACTTCTGAG AGTGAAGACTCA 48
J XII XI CACaUaUCTGAG AGTG A AGACTCA <10
K XIII XI CACTUnCUnGAG AGTGAA GA CTCA <10
(Un) соответственно. Нуклеотидные последовательности олигомеров (III), (VIII), (IX), и (XII) с включениями цити-дина (rC), уридина (rU) и арабиноуридина (aU) были выбраны с целью дальнейшего корректного сравнения свойств модифицированных ДНК-ДНК- и ДНК-РНК-дуплексов различных типов. Синтез модифицированных олигонуклеотидов описан нами ранее [7, 8, 11, 12].
На первом этапе работы необходимо было оценить, каким образом модифицированные звенья, находящиеся в одной из цепей, влияют на термическую устойчивость ДНК-дуплексов, и определить температурный режим проведения реакции ферментативного гидролиза. Следует подчеркнуть, что оценка термической стабильности модельных ДНК-дуплексов имеет большое значение, так как ранее было показано, что гибридазное расщепление протекает неэффективно, если образуется слабый комплекс между олигодезоксирибонуклеотидным зондом и РНК-мишенью [13].
Из данных табл. 1 видно, что включение в олигомер-ную цепь рибонуклеозидов не изменяет температуру плавления соответствующих НК-дуплексов B и F. Напротив, вставка арабиноуридина в одной из комплементарных цепей ДНК-дуплексов G и J обусловливает существенное понижение температуры плавления (на 15 и 40° С соответственно).
Было обнаружено, что наличие 2'-аминоарабиноадено-зина в составе олигонуклеотида приводит к некоторому понижению температуры плавления ДНК-дуплекса по сравнению с немодифицированным аналогом. Так, температура плавления дуплекса D (57° С) оказалась на 6° ниже температуры плавления соответствующего немоди-фицированного дуплекса A. Сравнение влияния 2'-амино-2'-дезоксицитидина и 2'-аминоарабиноаденозина на термическую устойчивость ДНК-дуплекса показало, что последний вносит меньшие искажения в структуру ДНК-дуплекса: температура плавления дуплекса С той же первичной структуры, но с 2'-амино-2'-дезоксицитидино-выми вставками оказалась на 10° ниже температуры плавления немодифицированного дуплекса А.
Т а б л и ц а 2
Эффективность гидролиза гетеродуплекса РНКазой Н
Шифр ДНК -РНК-дуплекс 5' ^ 3' 3' ^ 5' Относительная степень гидролиза РНК, %
a I ACCACCGCGCT ...25UGGUGGCGCGA15... 100
b III ACCACrCGCGrCT ... 25UGGUG GCGC GA15... 100
c IV ACCACnCGCGCnT ... 25UGGUG GCGCG A15... 98
d V GaAnCCaAnCCGCGCT 25U GG U GCGCGA15... 90
e VI CTACTCTCGC ... 105 GAUGAGAGCG96 ... 100
f VIII CTACrUCrUCGC ... 105GAUG AG AGCG96... 100
g IX CTACaUCaUCGC ... 105GAUG AG AGCG96... 90
h X CACTTCTGAG ... 56GUGAAGACUC47... 100
j XII CACaUaUCTGAG ... 56GUG A AGACUC47... 30
k XIII CACTUnCUnGAG ... 56GUGAA GA CUC47... 20
Дестабилизирующий эффект в каждом конкретном случае зависит не только от типа модификации, но и от нуклеотидного состава зондов и их длины. Искажение вторичной структры фрагментов ДНК может нивелироваться при условии их богатого GC-состава. Например, температура плавления ДНК-дуплекса С выше температуры плавления дуплекса K более чем на 40° при том, что оба дуплекса содержат в своем составе 2'-амино-2'-дезоксинуклеозиды.
Обобщая полученные данные, с большой степенью уверенности можно утверждать: четкой аналогии в гибридиза-ционных свойствах олигонуклеотидов, содержащих, с одной стороны, рибонуклеозиды и арабинонуклеозиды, а с другой - 2'-амино-2'-дезоксирибо- и 2'-амино-2'-дезоксиараби-нонуклеозиды, не прослеживается. Если в случае 2'-гидро-ксильной группы изменение цис-ориентации относительно связи С1'- N на транс-ориентацию приводит к понижению термической устойчивости соответствующих ДНК-дуплексов, то в случае аминогруппы наблюдается обратная картина. Причем интересно то, что углеводный фрагмент 2'-амино-2'-дезоксиуридина имеет С2'-эндо-кон-
формацию (S-тип) [14], т. е. дестабилизирующий эффект данной модификации не связан с конформацией сахарного остатка, так как в В-форме ДНК углеводные фрагменты имеют как раз С2'-эндо-конформацию. Тот же тип кон-формации, по всей вероятности, имеет углеводный остаток 2'-амино-2'-дезоксиарабиноаденозина, когда последний находится в составе олигонуклеотида. Этот вывод был сделан на основе аналогии с арабинонуклеозидами: для раА - СЗ'-эндо-конформация (N-тип), для аАр - S-тип, а для aApaApaA - S-S-N [15].
По всей видимости, природа дестабилизирующего влияния арабино- и 2'-аминонуклеозидов на структуру двойной спирали и различный характер этого влияния для каждого типа модификации могут быть связаны с разной организацией пространственной структуры пар оснований, одно из которых связано с модифицированным углеводным фрагментом. Следует также учитывать, насколько локально данное нарушение двойной спирали. В какой-то степени эти предположения подтверждаются исследованиями межплоскостных взаимодействий гетероциклических оснований (стэкинг-взаимодействий) в динукле-озидфосфатах, содержащих арабиноуридин [ 16], 2'-амино-2'-дезоксирибоуридин [7], 2'-амино-2'-дезоксиара-биноаденозин [8].
Все синтезированные олигонуклеотидные зонды I - X были использованы в комплексе с 5 S РНК рибосом E. coli как субстраты бактериальной РНКазы Н. Олиго-нуклеотиды формируют гибридные дуплексы (табл. 2) с фрагментами 15 - 25 (дуплексы a - d); 96 - 105 (дуплексы e - g) и 47 - 56 (дуплексы h - k) в 5 S РНК рибосом E. coli.
Как видно из рис. 1 и 2, использование, например, немодифицированных олигодезоксирибонуклеотидных зондов I и VI приводит к множественному гидролизу РНК. Аналогичные результаты наблюдались для олигонуклеотидов IV и V, содержащих 2'-аминонуклеозиды (рис. 1). Эти данные подтверждают тот факт, что углеводные фрагменты 2'-аминонуклеозидов находятся в С2'-эндо-конформации. В случае применения зонда VIII происходит повышение селективности расщепления -гидролизуются только две фосфодиэфирные связи (рис. 2), что связано с введением в состав олигонук-леотида рибозвеньев.
Однако эффективность ферментативного гидролиза для ДНК - РНК-дуплексов, образованных разными зондами, различна (табл. 2). Использование олигонуклеотидов IV и V приводит к незначительному снижению эффективности гидролиза по сравнению с их немодифицированным аналогом I и зондом III.
Анализируя данные табл. 2, можно сделать вывод, что снижение эффективности гидролиза РНК происходит в присутствии зондов, образующих непрочный ДНК-дуплекс. Эффективность гидролиза гетеродуплексов j и k снижается до 30 и 20% соответственно. Если же использо-
они образуют устойчивый комплекс с НК-мишенью, не препятствуют функционированию РНКазы Н и поэтому могут быть успешно применены при конструировании антисенсовых олигонуклеотидов.
Материалы и методы
В работе использовали MES, MgCl2, NaCl, дитиотреит («Merck», Германия), EDTA, LiClO4 («Fluka», Швейцария), 5S РНК рибосом E. coli, акриламид, бисакриламид, трис («Sigma», США), полинуклеотидкиназу фага Т4 («Сибэнзим», Россия).
Необходимые для работы олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы амидофосфитным методом на авто-
Рис. 1. Радиоавтограф разделения в 20% ПААГ продуктов гидролиза 5'-[32Р]-меченого 1-41 фрагмента 58 РНК, катализируемого РНКазой Н в присутствии олигонуклеотидов: I - дорожка 2, IV - дорожка 3, V -дорожка 4, исходная РНК - дорожка 1. Время инкубации 10 мин. Справа отмечено положение красителей-маркеров: ксиленцианола (ХС) и бромфенолового синего (ВрВ)
вать олигонуклеотиды IV и IX с включениями 2'-амино-2'-дезоксирибоуридина и арабиноуридина, образующие более прочные комплексы с НК-мишенью, то эффективность гидролиза возрастает соответственно до 98 и 90%.
Полученные закономерности необходимо учитывать при конструировании олигонуклеотидных зондов для направленного гидролиза РНК. Сравнение свойств олиго-нуклеотидных зондов различных типов показало, что использование олигомеров с включениями 2'-амино-2'-дезок-синуклеозидов, в отличие от олигодезоксирибонуклеоти-дов, содержащих рибо-звенья, не обеспечивает сокращение числа гидролизуемых связей в РНК. С другой стороны, при условии достаточно богатого СС-состава
Рис. 2. Радиоавтограф разделения в 20% ПААГ продуктов гидролиза 3'-[32P]-меченой 58 РНК рибосом E. coli, катализируемого РНКазой Н в присутствии олигонуклеотидов: щелочной гидролиз 3'-[32Р]РНК - дорожка 1; исходная РНК - дорожка 2; VI - дорожка 3; VIII -дорожка 4. Время инкубации 60 мин. Стрелками отмечена длина олигонуклеотидных фрагментов
матическом синтезаторе «Applied Biosystems 380В» (США) c использованием коммерческих реагентов и растворителей. Температурную зависимость УФ-поглощения дуплексов измеряли на спектрофотометре «Hitachi Model 150-20» (Япония) при непрерывном повышении температуры со скоростью 0.5 град/мин в термостатируе-мых кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм. Концентрация дуплексов составляла 0. 310-4М.
Препарат РНКазы Н (КФ 3.1.26.4) из E. rnli с молекулярным весом 17.6 кДа, содержащий 4.05 мг/мл белка, был любезно предоставлен С. Каная (Институт инженерии белка, Осака, Япония).
Радиоактивную метку вводили в 5'-конец РНК с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4 в присутствии [у-32P]ATP, в 3'-конец с помощью Т4 РНК-лигазы в присутствии [32Р]рСр. Растворы ДНК-ДНК- и РНК-ДНК-дуплексов готовили смешением эквимолярных количеств соответствующих олигонуклеотидов. Концентрацию олиго-нуклеотидов определяли спектрофотометрически, исходя из молярных коэффициентов поглощения нуклеозидов.
5'-Фосфорилированные гибридные дуплексы с известной удельной радиоактивностью получали добавлением к определенному количеству РНК-ДНК-дуплекса 5'-[32Р]-оли-горибонуклеотида, затем проводили отжиг.
Гидролиз РНКазой Н (концентрация 310-7М) 5'-[32Р] или 3'-[ Р]РНК (концентрация 0,5.10- М) в присутствии немодифицированных и модифицированных олигонуклеотидов (концентрация 110-4 М) проводили в течение 10-60 мин при 20° С в 10 мМ Трис-НС1 буфера, рН 7.9, содержащего 0.1 мМ EDTA, 150 мМ NaCl, 0.5 мМ дити-отреит, 10 мМ MgCl2 [5]. Реакции останавливали, добавляя ацетат натрия, тРНК в качестве соосадителя и 5-кратный объем этанола, а затем выдерживали в течение 4 -1 6 ч при -20° С. Анализ продуктов гидролиза проводили методом электрофореза в 20%-м полиакриламидном геле (ПААГ), содержащем 7 М мочевину, в Трис-боратном буфере (0.05 М Трис-HCl, 0.05 М H3BO3, 1 мМ EDTA, рН 8.3). После проведения авторадиографии из геля вырезали зоны, соответствующие исходному материалу и продуктам гидролиза. Их радиоактивность измеряли по Че-ренкову на счетчике «Delta-300» (Tracor, Нидерланды). Степень гидролиза субстрата определяли как отношение радиоактивности продукта гидролиза к суммарной радиоактивности продукта и нерасщепленного субстрата. Степень гидролиза в присутствии немодифицированного зонда принимали за 100%.
Работу проводили при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (97-04-48624) и программы «Университеты России - фундаментальные исследования» (5-5166).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Cohen J.S. Oligonucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression L., 1989. P. 1.
2. Donis-Keller H. // Nucl. Acids Res. 1979. 7. P. 179.
3. Wohlrab F., Jamieson A.T., Hay J., Mengel R., Guschlbauer W. // Biochim. Biophys. Acta. 1985. 824. P. 233.
4. Метелев В.Г., Крынецкая Н.Ф., Пурмаль А.А., Шабарова З.А.
// Биоорган. химия. 1990. 16. С. 507.
5. Schmidt S., Nieman A., Krynetskaya N.F., Оretskaya T.S., Metelev
V.G., Sukhomlinov V.V., Shabarova Z.A., Cech D. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. 1130. P. 41.
6. Nakai C., Konishi A., Komatsu Y., Inoue H., Ohtsuka E., Kanaya S.
// FEBS Lett. 1994. 339. P. 67.
7. Кузнецова Л.Г., Романова Е.А., Волков Е.М., Ташлицкий В.Н., Орецкая Т.С., ^ынецкая Н.Ф., Шабарова З.А. // Биоорган. химия. 1993. 19. С. 455.
8. Zubin E.M., Antsypovich S.I., Oretskaya T.S., Romanova E.A., Volkov E.M., Tashlitsky V.N., Dolinnaya N.G., Shabarova Z.A. // Nucleosides and Nucleotides 1998. 17. P. 425.
9. Uhlmann E., Peyman A. // Chem. Rev. 1990. 90. P. 544.
10. Yang W., Hendricson W.A., Crouch R.J., Satow Y. // Science 1990. 249. P. 1398.
11. Романова Е.А., Орецкая Т.С., Сухомлинов В.В., Крынецкая Н.Ф., Метелев В.Г., Шабарова З.А. // Биоорган. химия. 1990. 16. С. 1348.
12. ИбрагимХ.К.Х. // Дис. ... канд. хим. наук. М., 1993.
13. Alexeev Y.I., Krynetskaya N.F., Tashlitsky V.N., Oretskaya T.S, Dolinnaya N.G., Morvan F., Rayner B., Malvy C., Shabarova Z.A. // Nucleosides and Nucleotides 1996. 15. P. 1545.
14. Guschlbauer W., Jankowski K. // Nucl. Acids Res. 1980. 8. P. 1421.
15. Doornfos J., Barascut J.L., Lazrek H., Imbach, J.L., van Westrenen J., Visser M.G., Boom J.H. van, Altona C. // Nucl. Acids Res. 1983. 11. P. 4583.
16. Sokolova N.I., Dolinnaya N.G., Krynetskaya N.F., Shabarova Z.A. // Nucleosides and Nucleotides 1990. 9. P. 515.
Поступила в редакцию 23.04.98
