CC BY
53
УДК 612.084: 616.36-002: 615.244: 615.038: 612.015.11: 577.121.7 Е03
ГЕПАТОПРОТЕКТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ НОВОГО ГЕРМАНИЙОРГАНИЧЕСКОГО БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА (МЕДГЕРМ) ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГЕПАТИТЕ
Олег Львович Тымчишин*
Одесский национальный медицинский университет
Реферат
Цель. Изучение влияния нового германийорганического биологически активного вещества (медгерм) на состояние перекисного окисления липидов и антиоксидантную систему у крыс при остром галактозаминовом гепатите.
Методы. Опыты проводили на крысах-самцах линии Вистар. Острый токсический гепатит у крыс вызывали путём внутрибрюшинного введения D-галактозамина. Экспериментальные животные были распределены на четыре группы: первая группа (n=10) — интактные животные, которым внутрибрюшинно вводили в течение всего времени наблюдения 0,9% раствор натрия хлорида (контрольная группа); вторая группа (n=40) — животные, которые получали только D-галактозамин; третья группа (n=40) — крысы, которым внутрибрюшинно вводили медгерм в течение 7 сут до введения и 7 сут после введения D-галактозамина. Доза и режим введения медгерма были определены ранее. Четвёртую группу (n=40) составили крысы, которым в таком же режиме вводили препарат сравнения эссенциале® Н. В сыворотке крови и супернатанте гомогената ткани печени в 1-е, 3-и, 5-е и 7-е сутки после введения гепатотоксина определяли концентрацию продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, восстановленного глутатиона, оценивали активность супероксиддисмутазы и каталазы.
Результаты. Медгерм оказывал выраженное влияние на состояние прооксидантно-антиоксидантного гомеостаза при остром токсическом галактозаминовом гепатите. Он достаточно эффективно предупреждал генерацию и накопление конечных продуктов липидопероксидации, а также сохранял активность неферментативной и ферментативной частей антиоксидантной системы. У животных, получавших медгерм, изучаемые показатели быстрее восстанавливались до исходного уровня, чем у крыс с экспериментальным гепатитом, не получавших данное соединение.
Вывод. Полученные результаты свидетельствуют об антиоксидантной активности медгерма и его опосредованном мембранопротективном действии при остром токсическом гепатите.
Ключевые слова: германийорганические соединения, медь, медгерм, острый токсический гепатит, антиоксидантная система защиты.
HEPATOPROTECTIVE ACTIVITY OF A NEW GERMANIUM-ORGANIC BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCE (MEDGERM) IN EXPERIMENTAL HEPATITIS O.L. Tymchyshin. Odessa National Medical University, Odessa, Ukraine. Aim. To study of the influence of new germanium-organic biologically active substance (medgerm) on lipid peroxidation and antioxidant system in rats with galactosamin-induced acute hepatitis. Methods. The experiments were carried out on Wistar male rats. Acute toxic hepatitis in rats was induced by intraperitoneal injection of D-galactosamine. Experimental animals were divided into 4 groups: first group (n=10) — intact animals that received 0.9% sodium chloride solution intraperitoneal injections throughout the observation period (control group); second group (n=40) — animals that received only D-galactosamine; third group (n=40) — rats that received medgerm intraperitoneal injections 7 days before and 7 days after the administration of D-galactosamine. The dose and administration regimen of medgerm were pre-defined. The fourth group (n=40) included rats that received Essentiale® N in the same mode as a comparator drug. Determination of thiobarbituric acid reactants, reduced glutathione levels in serum and liver homogenate supernatant, as well as superoxide dismutase and catalase activities were carried out in 1, 3, 5 and 7 days after the administration of liver toxins. Results. Medgerm has a significant effect on pro- and antioxidant homeostasis in acute toxic galactosamine-induced hepatitis. It effectively prevented the generation and accumulation of lipid peroxidation end products and preserved the activity of non-enzymatic and enzymatic antioxidant system parts. In animals treated with medgerm, studied parameters restored to reach the baseline level faster than in rats with galactosamine-induced hepatitis that were not treated with medgerm. Conclusion. The findings suggest that medgerm has the antioxidant activity and a membrane-mediated action in acute toxic hepatitis. Keywords: germanium-organic substances, copper, medgerm, acute toxic hepatitis, antioxidant protection.
Свободные радикалы и продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) играют важную роль в патогенезе острых и хронических гепатитов различной этиологии [1]. Баланс между ПОЛ и антиоксидантной системой (АОС) — условие, необходимое для поддержания нормальной жизнедеятельности клетки.
Современная фармакотерапия острых и хронических болезней печени характеризуется применением лекарственных средств
как этиотропной, так и патогенетической фармакотерапии. Одной из основных задач патогенетической составляющей лечения гепатитов является предупреждение или устранение одного из ведущих звеньев механизма поражения печени — дестабилизации морфофункционального состояния мембран гепато-цитов, связанной со свободнорадикальным окислением [7].
Несмотря на достаточно большой арсенал гепатопротекторов, они не всегда до-
Адрес для переписки: [email protected] 628
статочно эффективны, поэтому разработка новых препаратов гепатопротективного действия остаётся актуальной проблемой гепатофармакологии [10]. В последнее время значительное развитие получили исследования фармакологических свойств германийорганических соединений [5, 14]. Проведённые доклинические и клинические испытания комплексных германийсодержащих соединений показали, что они положительно влияют на организм, имея разносторонние фармакодинамиче-ские свойства (гепато-, нейро-, кардиопро-тективное, антигипоксическое и др.) [13]. Особый интерес германий представляет в комплексных соединениях с различными биолигандами [5], среди которых особое внимание занимает оксиэтилидендифосфо-новая кислота. Наряду с низкой токсичностью она обладает высокой биологической активностью, её производные достаточно широко применяют в клинической практике как регуляторы минерального обмена, противоопухолевые средства, антидоты при отравлении токсичными и радиоактивными элементами и т.д. [11, 12]. По этой причине целенаправленным синтезом был создан новый класс биологически активных веществ — оксиэтилидендифосфона-тогерманатов. Как одно из перспективных веществ в этом ряду можно рассматривать комплексное соединение германия и ок-сиэтилендифосфоновой кислоты с эссен-циальным микроэлементом медью — куп-рум-оксиэтилиден-дифосфонато-германат (лабораторный шифр — медгерм).
Интерес к меди обусловлен тем, что она играет большую роль в поддержании морфофункциональной структуры миелино-вых оболочек нервов, кровеносных сосудов, лёгочных альвеол и пр. Кроме того, медь влияет на углеводный обмен, процессы кроветворения, способствует усвоению железа, входит в состав многих важных ферментов, таких как Cu/Zn-супероксиддисмутаза (Cu/ Zn-СОД), цитохромоксидаза, тирозиназа, аскорбиназа и другие, обладает противовоспалительными и иммуномодулирующими свойствами [4, 6]. В метаболизме меди большую роль играет печень, где синтезируется медьсодержащий белок церулоплазмин, обладающий различными биологическими свойствами [2].
Всё это и обусловило цель данного исследования — изучение влияния медгерма на состояние ПОЛ и АОС у крыс при остром галактозаминовом гепатите.
Опыты проводили на крысах-самцах линии Вистар с массой тела 180-220 г, разведённых в виварии Одесского национального медицинского университета. Животных содержали в обычных условиях на стандартном пищевом и водном рационе. Острый токсический гепатит у крыс вызывали путём внутрибрюшинного (в/б) введения D-галактозамина из расчёта 400 мг/кг в виде 20% водного раствора (полулетальная доза) [8]. Ранее было показано, что для изучения новых гепатопротекторов с предполагаемой мембранотропной активностью наиболее показательна галактозаминовая модель поражения печени, поскольку она протекает, во-первых, «мягче», во-вторых, с привлечением практически всех патогенетических механизмов, наблюдаемых при гепатитах различной этиологии, в том числе вирусной [3].
Экспериментальные животные были распределены на четыре группы: первая группа (п=10) — интактные животные, которым в/б вводили в течение всего времени наблюдения 0,9% раствор натрия хлорида (контрольная группа); вторая группа (п=40) — животные, которые получали только D-галактозамин; третья группа (п=40) — крысы, которым в/б вводили медгерм в дозе 0,4 мг/кг в течение 7 сут до введения и 7 сут после введения D-галактозамина. Доза и режим введения медгерма были определены ранее [9]. Четвёртую группу (п=40) составили крысы, которым в таком же режиме в/б вводили препарат сравнения эссенциа-ле® Н («Авентис Фарма Дойчланд ГмбХ», «Эй. Наттерман энд Сайи ГмбХ», Германия) в дозе 5 мг/кг.
Исследование показателей ПОЛ и АОС проводили в 1-е, 3-и, 5-е и 7-е сутки после введения гепатотоксина в сыворотке крови (СК) и супернатанте гомогената ткани печени (ТП). Состояние процессов ПОЛ у животных с галактозаминовым гепатитом оценивали по содержанию в крови и ТП конечных продуктов ПОЛ, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-Р). Состояние основных компонентов АОС оценивали по уровню одного из основных компонентов её неферментативного звена — глутатиона восстановленного (по G.L. Е11тап, 1959), а также по активности двух ключевых ферментов её энзимной составляющей — каталазы (по М.А. Королюк, 1988) и СОД (по В.А. Костюк и соавт., 1990).
При расчётах содержания анализируемых веществ и активности ферментов в ТП
19,1% (см. табл. 1, 2). У крыс четвёртой группы по сравнению с контрольной уровень ТБК-Р повышался в СК на 49,2%, в ТП — на 64,9%; содержание восстановленного глута-тиона уменьшалось в СК на 44,7%, в ТП — на 36,4%; активность каталазы снижалась в СК на 25,9%, в ТП — на 28,5%; активность СОД уменьшалась в СК на 47,3%, в ТП — на 31,6% (см. табл. 1, 2).
Как свидетельствуют данные таблиц, динамика изучаемых показателей при остром галактозаминовом гепатите в каждой опытной группе имела свои особенности. Так, у животных второй группы изменения изучаемых показателей в СК и в ТП были самыми выраженными и достоверно отличались от показателей крыс контрольной группы вплоть до 7-го дня наблюдения.
У животных третьей группы на фоне профилактически-лечебного введения мед-герма выраженность патологических изменений изучаемых показателей была значительно меньше, а их восстановление к исходным значениям контрольных крыс происходило намного раньше, чем у нелеченых животных второй группы. Так, повышение содержания ТБК-реактатнтов и в СК, и в ТП было достоверным только до 3-х суток наблюдения, а к 5-м суткам гепатита и в СК, и в ТП их содержание прибли-
Таблица 1
Содержание веществ, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-Р), и глутатиона восстановленного в сыворот ке крови (СК) и ткани печени (ТП) крыс разных опытных групп, М±т
День гепатита Содержание ТБК-Р Содержание восстановленного глутати-она
GK, нмоль/л ХП, нмоль/г CK, мкмоль/л TП, мкмоль/г
Первая группа (контроль) 27,81±1,67 0,31±0,01 54,1+3,13 155,35+8,10
Вторая группа (нелеченый гепатит)
1-й 69,2+3,11* 1,08±0,05* 25,15+1,30* 62,50+3,13*
3-й 57,19+2,90* 0,78+0,04* 26,04+0,52* 54,61+2,18*
5-й 53,04+2,70* 0,46+0,02* 29,30+1,79* 81,64+2,45*
7-й 42,79+2,11* 0,41+0,01* 36,86+0,88* 113,93+5,70*
Tретья группа (гепатит на фоне в/б введения медгерма в дозе 0,4 мг/кг)
1-й 34,39+1,42* 0,41+0,02* 30,31+1,55* 114,22+5,70*
3-й 32,20+0,98* 0,39+0,02* 35,2+0,70* 133,48+5,32*
5-й 28,68±1,16 0,33+0,02 45,57+2,36* 145,29+4,36
7-й 27,35+0,90 0,31+0,01 53,17+2,71 160,34+8,02
Четвёртая группа (гепатит на фоне в/б введения эссенциале® Н в дозе 5 мг/кг)
1-й 41,5+1,10* 0,5+0,03* 29,92+1,50* 98,82+4,94*
3-й 41,02+2,12* 0,39+0,02* 31,87+1,14* 122,17+4,90*
5-й 33,75^1,76* 0,34+0,02 36,39+1,83* 124,25+3,71*
7-й 30,13±1,52 0,31+0,01 43,91+2,25* 138,49+6,89
Примечание: ТБК — тиобарбитуровая кислота; в/б — внутрибрюшинное; *р <0,05 по сравнению с показателями крыс контрольной группы.
учитывали массу ТП и степень разведения гомогената. Статистическую обработку полученных данных проводили, используя программу Мiсrosoft Excel, методом вычисления среднего арифметического и уровня его статистической значимости по критерию достоверности Стьюдента.
Проведённые исследования показали, что у животных второй группы в 1-е сутки острого галактозаминового гепатита происходило резкое повышение уровня ТБК-Р (СК — в 2,49 раза, ТП — 3,47 раза), уменьшалось содержание восстановленного глу-татиона (СК — на 53,5%, ТП — на 59,8%), снижалась активность каталазы (в обоих субстратах на 30,0%) и СОД (в СК — на 58,3%, в ТП — на 49,2%) по сравнению с животными первой группы (табл. 1, 2).
У крыс третьей и четвёртой групп в тот же период гепатита происходили аналогичные по направленности изменения, но их выраженность была значительно меньшей. По сравнению с животными первой группы у крыс третьей группы уровень ТБК-Р повышался в СК только на 23,7%, а в ТП — на 33,6%; содержание восстановленного глутатиона уменьшалось в СК на 44,0%, в ТП — на 26,6%; активность каталазы снижалась в СК на 9,2%, в ТП — на 21,4%; активность СОД уменьшалась в СК на 16,3%, в ТП — на
жалось к референтным значениям. Содержание восстановленного глутатиона в СК было достоверно снижено и к 5-м суткам наблюдения, а в ТП уже к 3-м суткам острого галактозаминового гепатита приближалось к значениям контрольных животных. Уменьшение активности каталазы в СК достоверно отличалось от аналогичного показателя крыс первой группы только на 1-е сутки наблюдения, а на 5-е сутки острого гепатита активность каталазы укладывалась в референтный интервал и в ТП. Активность СОД в СК и ТП к 5-м суткам острого галактозаминового гепатита не отличалась от контрольных значений.
У крыс четвёртой группы на фоне про-филактически-лечебного введения эссен-циале® Н снижение содержания ТБК-реактатнтов в СК и ТП было достоверным вплоть до 5-х суток эксперимента. Содержание восстановленного глутатиона в СК и ТП даже к 7-м суткам наблюдения оставалось достоверно меньше, чем у животных контрольной группы. Активность каталазы в СК только к 7-м суткам укладывалась в референтные границы, а в ТП — к 5-м суткам. Активность СОД в СК и на 7-е сутки всё ещё была достоверно снижена, а в ТП восстановление активности СОД наступило только на 7-е сутки острого галактозамино-вого гепатита (см. табл. 1, 2).
Таким образом, оценивая характер влияния координационного соединения германия с медью на состояние прооксидантно-антиоксидантного гомеостаза при остром токсическом галактозаминовом гепатите, необходимо отметить его способность достаточно эффективно предупреждать генерацию и накопление конечных продуктов ПОЛ, а также сохранять активность неферментативной и ферментативной частей АОС. Всё это в конечном итоге обеспечивает предупреждение нарушения функций мембран гепатоцитов, а следовательно, и уменьшение токсического влияния гепато-токсиканта на печень.
Убедительным свидетельством этого служит предупреждение образования и накопления в 1-е сутки острого галактозами-нового гепатита конечных продуктов ПОЛ (ТБК-Р) у крыс третьей группы в отличие от нелеченых животных второй группы. При этом у животных, которые получали мед-герм, уровень ТБК-Р был значительно меньшим, чем у животных второй группы, как в СК, так и в ТП (соответственно в 2,0 и 2,6 раза). Подобная картина у крыс второй группы зарегистрирована при изучении неферментативного и ферментативного звеньев АОС. У животных, предварительно получавших медгерм, в 1-е сутки острого токсического галактозаминового гепатита
Таблица 2
Активность каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) в сыворотке крови (СК) и ткани печени (ТП)
крыс разных опытных групп, М±т
День гепатита Активность каталазы Активность СОД
СК, кат/л ТП, кат/г СК, у.е. ТП, у.е./г
Первая группа (контроль) 152,14±6,12 1065,00+14,55 63,72+5,05 0,33+0,02
Вторая группа (нелеченый гепатит)
1-й 106,94+5,45* 731,66+36,58* 26,57+1,04* 0,17+0,01*
3-й 110,01±3,41* 836,56+33,46* 28,12+1,04* 0,16+0,01*
5-й 120,27±1,20* 881,18+26,44* 32,64+2,38* 0,20+0,01*
7-й 124,37+6,22* 938,69+46,93* 42,95+2,58* 0,27+0,01*
Третья группа (гепатит на фоне в/б введения медгерма в дозе 0,4 мг/кг)
1-й 138,14+3,87* 837,09+41,85* 53,33+2,67* 0,27+0,01*
3-й 144,82+6,52 949,02+37,96* 56,15+2,81* 0,26+0,01*
5-й 147,71±5,61 999,72+29,99 58,48+0,64 0,30+0,02
7-й 154,03±2,93 1050,94+52,55 63,49+2,73 0,33+0,01
Четвёртая группа (гепатит на фоне в/б введения эссенциале® Н в дозе 5 мг/кг)
1-й 112,67+5,63* 762,01+38,10* 33,56+1,68* 0,23+0,01*
3-й 114,27±5,71* 853,38+34,14* 37,73+1,89* 0,24+0,01*
5-й 121,32±6,31* 1007,06+30,21 43,43+2,17* 0,29+0,01*
7-й 136,06±6,80 1089,46+54,47 52,09+2,03* 0,30+0,01
Примечание: у.е. — условные единицы; *р <0,05 по сравнению с показателями крыс контрольной группы.
отмечено значимое уменьшение содержания восстановленного глутатиона и активности каталазы. Однако у крыс третьей группы эти патологические изменения были значительно меньшими, чем у крыс второй группы.
Кроме этого, у животных, получавших медгерм, показатели ПОЛ и АОС быстрее восстанавливались до исходного уровня по сравнению с аналогичными показателями у нелеченых крыс второй группы.
D-галактозамин вызывает инициирование ПОЛ, что ведёт к истощению АОС клеток и нарушению функционирования плазматических, митохондриальных мембран и мембран эндоплазматического ретикулума. Полученные результаты при профилакти-чески-лечебном применении изучаемого биологически активного вещества при остром токсическом гепатите, вызванном D-галактозамином, свидетельствуют об анти-оксидантной активности медгерма и его опосредованном мембранопротективном действии.
Следует подчеркнуть, что исследуемое биологически активное вещество проявляет сходную антиоксидантную активность с препаратом сравнения — эссенциале® Н.
ВЫВОД
На основании полученных данных можно сделать вывод, что в основе механизма гепатопротективного действия исследуемого германийорганического комплекса, скорее всего, лежит его способность реализовать антиоксидантные и антирадикальные свойства, предупреждая таким образом избыточный расход запасов эндогенных антиоксидантов и одновременно снижая чрезмерное образование активных форм кислорода, которые инициируют процесс перекисного окисления липидов.
ЛИTEPАTУPА
1. Буеверов А.О. Оксидативный стресс и его роль в повреждении печени // Рос. ж. гастроэнтерол., гепа-тол., колопроктол. — 2002. — №4. — С. 21-24.
2. Ващенко В.И., Ващенко Т.Н. Церулоплазмин — от метаболита до лекарственного средства // Психо-фармакол. и биол. наркол. — 2006. — T. 6, вып. 3. — С. 1254-1269.
3. Годован В.В., Кресюн В.Й. Галактозаміновий гепатит як модель вивчення морфофункціональних порушень клітинних мембран // Одеський медичний ж. — 2005. — №3. — С. 11-15.
4. Дзюба А.Н., Сорокин Ю.Н. Лечение рассеянного склероза и динамика антиоксидантного статуса // Укр. мед. часопис. — 2008. — №1. — С. 79-82.
5. Лукевиц ЭЯ., Гар Т.К., Игнатович Л.М. и др. Биологическая активность соединений германия. — Рига: Зинатне, 1990. — 191 с.
6. Мазепа А.І., Мазепа первой. В. Роль міді та цинку в розвитку патології сполучної тканини // Медична хімія. — 2002. — T. 4, №2. — С. 71-76.
7. Оковитый С.В., Шуленини С.Н., Смирнов А.В. Елиническая фармакология антигипоксантов и антиоксидантов. — СПб.: ФАРМиндекс, 2006. — 70 с.
8. Доклинические исследования лекарственных средств. Метод рекомендации / Под ред. А.В. Стефанова. — K.: ГФЦ МЗ Украины, 2002. — 567 с.
9. Тимчишин О.Л., Кресюн В.Й., Годован В.В. і др. Гепатопротекторні властивості нової комплексної сполуки германію з купрумом (медгерму) при експериментальному токсичному гепатиті // Досягнення біології та медицини. — 2011. — №2. — С. 64-69.
10. Ушкалова Е.А. Проблемы применения гепато-протекторов // Фарматека. — 2004. — №4. — С. 45-55.
11. Юрьева Э.А., Матковская Т.А. О бисфосфонатах как о лекарственных соединениях (по материалам международного конгресса в Нидерландах, 2001) // Рос. вестн. перинатал. и педиатр. — 2001. — №3. — С. 59.
12. Glorieux F.H. Experience with bisphosphonates in osteogenesis imperfecta // Pediatrics. — 2007. — Vol. 119, N 2. — P. 163-165.
13. Lee J.H., Kim K.W., Yoon M.Y. et al. Antiinflammatory effect of germanium-concentrated yeast against paw oedema is related to the inhibition of arachidonic acid release and prostaglandin E production in RBL 2H3 cells // Auton. Autacoid. Pharmacol. — 2005. — Vol. 25, N 4. — P. 129-134.
14. Massey P.B. Dietary supplements // Med. Clin. North Am. — 2002. — Vol. 86, N 1. — P. 127-147.
