Желчегонное и гепатотропное влияние экстракта Hypecoum erectum в эксперименте Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ЖЕЛЧЕГОННОЕ И ГЕПАТОТРОПНОЕ ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТА HYPECOUM ERECTUM В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Николаев С. М.12, Федоров А. В.2, Разуваева Я. Г.12, Самбуева З. Г.1, Торопова А. А.1 ' ФГБУН «Институт общей и экспериментальной биологии» СО РАН 2 ФГБОУ ВПО «Бурятский государственный университет», Улан-Удэ

THE CHOLERETIC AND HEPATOPROTECTIVE EFFECT OF HYPECOUM ERECTUM EXTRACT

Nikolaev S. M.1-2, Fedorov A. V.2, Razuvaeva Ya. G.1-2, Sambuyeva Z. G.1, Toropova A. A.1 ' FGBUN "Institute of General and Experimental Biology", SB RAS 2 FGBOU "Buryat state university" Ulan-Ude

Николаев С. М. — доктор медицинских наук, профессор, заведующий Отделом биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН; профессор кафедры фармакологии, клинической фармакологии и фитотерапии БГУ. Федоров А. В. — аспирант БГУ.

Разуваева Я. Г. — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории безопасности биологически активных веществ ИОЭБ СО РАН.

Самбуева З. Г. — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории безопасности биологически активных веществ ИОЭБ СО РАН.

Торопова А. А. — кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории безопасности биологически активных веществ ИОЭБ СО РАН.

Nikolaev S. M. — doctor of medical science, professor, head of Departmentof biological active substances of the Institute of general and experimental biology of SB RAS; prof. of Department of medicine. Fedorov A. V. — postgraduate student of Buryat State University.

Razuvaeva Ya. G. — candidate of biological science, scientific researcher of Laboratory of safety of biological active substances of the IGEB SB RAS.

Sambuyeva Z. G. — candidate of biological science, scientific researcher of Laboratory of safety of biological active substances of the IGEB SB RAS.

Toropova A. A. — candidate of biological science, scientific researcher of Laboratory of safety of biological active substances of the IGEB SB RAS.

Разуваева Янина Геннадьевна Razuvaeva Yanina G. E-mail: tatur75@mail.ru

Резюме

Проводили исследования по определению желчегонного и гепатопротекторного влияния экстракта Hypecoum erectum L. при токсическом гепатите. Экспериментальный гепатит вызывали введением D-галактозамина белым крысам (линия Wistar) в дозе 500 мг/кг массы 1 раз в сутки в течение 3 дней. Экстракт H. erectum вводили per os в дозе 50 мг/кг в течение 7 дней. Установлено, что экстракт H. erectum при D-галактозаминовом гепатите у белых крыс оказывает выраженное гепатопротекторное влияние, характеризующееся ингибированием нарушений холатосинтетической функции печени, увеличением скорости секреции желчи, сохранением концентрации холатов в ней. Показано, что экстракт H. erectum уменьшает дистрофические и некротические процессы в гепатоцитах, снижает интенсивность воспалительной инфильтрации в печени и стимулирует регенерацию печеночных клеток при D-галактозаминовом гепатите.

Ключевые слова: Hypecoum erectum L. экстракт, желчегонное, гепатопротекторное действие. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2014; 110 (10):59-63

Summary

The choleretic and hepatoprotective effect of Hypecoum erectum L. dry extract on toxic hepatitis was studied. Experimental hepatitis was caused by the introduction of D-galactosamine to Wistar white rats in the dose of 500 mg/kg of the animal weight once a day for 3 days. The H. erectum extract was administered per os in the dose of 50 mg/kg for 7 days. It has been established that H. erectum extract has a marked hepatoprotective effect in the case of D-galactosamine hepatitis in white rats that is characterized by inhibition of the disturbances in cholate-synthetic functions of the liver, increase of bile secretion rate, preservation of cholate concentration in the bile. The tested remedy diminishes dystrophic and necrotic processes, decreases the intensity of inflammatory infiltration in the liver and stimulates regeneration of liver cells in D-galactosamine hepatitis.

Keywords: Hypecoum erectum L. extract, choleretic and hepatoprotective effect. Eksperimental'naya i Klinicheskaya Gastroenterologiya 2014; 110 (10):59-63

Желчеобразование и желчевыделение являются составной частью внешнесекреторной функции печени, угнетением которой сопровождаются многие заболевания. Незаменимым источником получения лекарственных средств для профилактики и лечения заболеваний печени и желче-выводящих путей являются растения, которые с глубокой древности человек использует с лечебной целью. В этой связи сохраняется актуальность изыскания и расширения номенклатуры гепатотропных препаратов за счет новых и малоизученных до настоящего времени видов растительных сырья, в частности, произрастающих в районах Сибири и Дальнего Востока. Исследование лекарственных растений, применяющихся при указанных патологических состояниях в практике тибетской медицины в течение многих веков, и научное обоснование их применения, может внести определенный вклад в расширение

Материал и методы исследования

Исследования выполнены на белых крысах линии Ш181аг обоего пола с исходной массой 180-200 г. Содержание животных соответствовало «Правилам лабораторной практики» (GLP) и Приказу МЗ РФ № 708Н от 23.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Перед началом животные, отвечающие критериям включения в эксперимент, распределялись на группы с учетом пола, возраста, массы и принципа рандомизации. Экспериментальную работу осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г.), «Правилами, принятыми в Европейской конвенции по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986). Протокол исследования согласован с этическим комитетом ИОЭБ СО РАН (протокол № 5 от 05.09.2010). Эвтаназию животных осуществляли методом мгновенной декапитации под легким эфирным наркозом.

арсенала лекарственных средств с желчегонным и гепатопротекторным действием. Одним из таких растений является гипекоум прямой — Нуресоит етесЫт L. (семейство Papaveraceae), используемый в практике тибетской и монгольской медицины, а также народов Сибири при инфекционных и онкологических заболеваниях [1, 2, 3]. Н. етес1ит содержит алкалоид гипекорин, гипекоринин, фу-маритин, протопин, сангвинарин, синактин, ^ 1 — стилопин; каротиноиды и другие биологически активные вещества [4, 5]. Ранее показано, что экстракт и сумма алкалоидов Н. етес1ит оказывают противовоспалительное, жаропонижающее и выраженное гипотензивное действие; обладают вирусостатическим и антибактериальным свойствами [6] .

Целью настоящей работы явилось определение желчегонного и гепатопротекторного действия экстракта сухого Н.етесЫт.

В первой серии экспериментов для определения желчегонной активности водный раствор экстракта H. erectum вводили интактным наркотизированным (тиопентал натрия, 45 мг/кг) животным однократно в двенадцатиперстную кишку в дозах 20, 50, 100 и 200 мг/кг. В каждую группу входило по 6 животных. Желчь у крыс после наркоза получали с помощью полиэтиленовой канюли, вставленной в общий желчный проток, через каждый час в течение 5 часов подряд. О степени желчегонной активности экстракта судили по скорости секреции и общему количеству выделенной желчи, а также по содержанию в желчи основных ее ингредиентов: билирубина [8], желчных кислот и холестерина [9].

Во второй серии экспериментов у крыс моделировали острое повреждение печени путем внутрибрюшинного введения D-галактозамина в дозе 500 мг/кг в течение 3 дней 1 раз в сутки [7]. Экстракт H. erectum в дозе 50 мг/кг в форме водного раствора вводили животным per os на фоне введения Д-галактозамина и затем еще в течение

Группы животных

Скорость секреции желчи в течение 5 часов, мг/мин. на 100 г

1 час 2 час 3 час 4 час 5 час

Контроль 5,7±0,1 4,8±0,1 4,4±0,1 4,3±0,1 3,8±0,3

m 20 мг/кг 5,8±0,4 5,5±0,3* 5,4±0,4* 5,3±0,3* 4,8±0,3*

tcu 50 мг/кг 5,8±0,2 6,3±0,2* 5,7±0,1* 5,6±0,1* 5,2±0,1*

cer w 100 мг/кг 5,7±0,3 6,0±0,2* 5,3±0,3* 5,2±0,2* 4,7±0,2*

Щ 200мг/кг 5,8±0,4 5,5±0,2* 5,3±0,4* 4,7±0,3* 4,5±0,4

Карсил, 50 мг/кг 5,5±0,2 6,0±0,2* 5,7±0,3* 5,3±0,2* 5,0±0,3*

Таблица 1.

Влияние Н. етесЬит на секрецию желчи у белых крыс.

Примечание:

* здесь и далее различия значимы по сравнению с контролем при Р <0,05.

Группы животных

Контрольная

20мг/кг

Общее кол-во желчи за 2-4 часы опыта, мг/100г

Желчные кислоты, мг%

Билирубин, мг% Холестерин, мг%

1038±32,8

1185,4±30,31

29,0±1,12

1260±62,3

1204,8±42,41

28,3±0,92

260,5±10,20

267,4±12,11

tu tc 50 мг/кг 1355±36,5* 1288,2±30,02* 28,0±2,10 270,9±15,62

er e H. 100 мг/ кг 1272±59,6* 1254,0±40,42 32,0±1,42 329,5±13,42*

200 мг/ кг 1200±81,0 1236,4±50,23 34,0±1,52* 318,3±14,60

Карсил, 50 мг/ кг 1326±37,9* 1328,1±40,42* 30,0±1,62 256,7±12,20

Таблица 2.

Влияние экстракта Н. етесЫт на общее количество и биохимический состав желчи у белых крыс.

4 дней. В качестве препарата сравнения использовали карсил в дозе 50 мг/кг, который вводили животным второй опытной группы по аналогичной схеме. Животные контрольной и интактной групп получали воду очищенную. В каждую группу входило по 10 животных. Исследование морфофунк-ционального состояния печени проводили на 3 и 7 сутки от начала введения D-галактозамина.

Для патоморфологических исследований кусочки печени крыс фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и заливали в парафин.

Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Для выявления активности нейтральных жиров свежезамороженные срезы печени окрашивали суданом IV [10] .

Данные экспериментов обработаны статистически для малой выборки с определением средней величины (М) и средней ошибки (т). Для оценки значимости различий между средними значениями использовали непараметрический критерий «и» Манна-Уитни. Различия считались значимыми при вероятности 95% (Р< 0,05) [11] .

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты исследований, представленные в таблице 1, свидетельствуют, что наиболее выраженное желчегонное действие экстракт Н. етесЫт оказывает в дозе 50 мг/кг. При этом скорость секреции желчи возрастает по сравнению с таковой у крыс контрольной группы на 30% — 37%, в то время как у препарата сравнения карсила — на 23% — 32% соответственно на 2-5 часы опыта. Общее количество выделенной желчи за 4 часа у животных данной опытной группы превышало контроль на 31%, а под влиянием карсила — на 28% (табл. 2). Холеретиче-ская реакция сохранялась в течение 4 часов.

Установлено, что экстракт Н. етесЫт в дозе 50 мг/ кг оказывает умеренное стимулирующее влияние на синтез и выделение холатов и секрецию билирубина с желчью (табл. 2). На фоне введения животным экстракта в дозах 100 и 200 мг/кг содержание билирубина в желчи повышалось на 10% и 17% соответственно, содержание холестерина — на 26% и 22% по сравнению с показателями контрольных животных. Экстракт Н. етесЫт в диапазоне доз от 50 до 200 мг/кг обладает выраженной желчегонной активностью.

В следующей серии экспериментов желчегонное и гепатопротекторное действие Н. етес1ит при D-галактозаминовом гепатите изучали в дозе 50 мг/кг. Как следует из данных, представленных в таблицах 3 и 4, развитие Э-галактозаминового гепатита сопровождается выраженным угнетением

желчеобразовательной и желчевыделительной функций печени. В частности, скорость секреции желчи у животных контрольной группы на 3 сутки опыта снижалась в среднем на 22%, а на 7 сутки — на 27% по отношению к показателям интактных крыс. Кроме этого, в контроле на 7 сутки опыта наблюдали более выраженное снижение содержания основных компонентов желчи по отношению к интакту: холаты — на 20%, билирубин — на 30% и холестерин на — 34%.

Введение животным экстракта Н. етес1ит ин-гибировало нарушения желчеобразовательной функции печени, вызванные введением животным Э -галактозамина. Так, скорость секреции желчи у животных опытной группы возрастала и превышала таковую у крыс контрольной группы на 3 сутки опыта в среднем на 19%, на 7 сутки — на 45%. Кроме того, экстракт Н. етесЫт повышал экскрецию билирубина и холестерина с желчью. Содержание их в желчи на 3 сутки опыта превышало контроль в среднем на 27%, а на 7 сутки соответственно на 19% и 41% (табл. 4). Содержание холатов в желчи превышало контроль на 13% и 18% соответственно срокам наблюдения.

Результаты патоморфологических исследований показали выраженные структурные изменения в печени животных контрольной группы на фоне введения Э-галактозамина, характерные для вирусного гепатита. На 3 сутки эксперимента в печени

Таблица 3.

Влияние экстракта Н. етесЬит на скорость секреции желчи у белых крыс при D — галактозаминовом гепатите.

Группа животных

Скорость секреции желчи в течение 3 часов, мг/мин на 100 г

Таблица 4.

Влияние экстракта Н. етесЬит на общее количество и биохимический состав желчи у белых крыс при D — галактозаминовом гепатите.

1 час

2 часа

3 часа

3 сутки

Интактная (Н2О) 7,2 ± 0,37 7,0 ± 0,25 6,5 ± 0,36

Контрольная (D-галактозамин+Н^О) 5,7 ± 0,23 5,4 ± 0,23 5,0 ± 0,31

Опытная (D-галактозамин + H. erectum) 6,8 ±0,24* 6,5±0,11* 6,0 ± 0,42

Опытная (D-галактозамин+карсил) 6,4 ± 0,32 6,0 ± 0,42 5,8 ±0,33-

7 сутки

Интактная (Н2О) 6,8 ± 0,37 6,5 ± 0,25 6,2 ± 0,36

Контрольная (D-галактозамин+Н^О) 5,0 ± 0,34 4,7 ± 0,33 4,3 ± 0,32

Опытная (D-галактозамин + H. erectum) 7,4± 0,18* 6,7± 0,26* 6,0±0,41*

Опытная (D-галактозамин+карсил) 6,3±0,24* 5,8± 0,16* 5,5±0,34*

Группа животных Общее кол-во желчи за 3 ч опыта, мг/100г Желчные кислоты мг% Билирубин мг% Холестерин мг%

3 сутки

Интактная (Н2О) 1242±31,2 907,7±30,42 29,0±1,12 46,9±1,14

Контрольная (D-галактозамин + Н2О) 968±20,5 740,6±20,21 15,0±0,72 32,8±1,28

Опытная (D-галактозамин+H. erectum) 1122±27,6* 821,9±21,12* 19,0±0,42* 41,6±1,12*

Опытная (D-галактозамин+карсил) 1092±53,0 833,4±22,60* 17,0±0,59 35,6±0,92

7 сутки

Интактная (Н2О) 1170±24,6 934,8±36,20 27,0±0,98 48,6±0,92

Контрольная (D-галактозамин+Н^О) 840±22,4 752,4±34,19 19,0±0,89 32,0±1,12

Опытная (D-галактоза-мин + H. erectum) 1206±23,5* 843,6±31,21 22,6±0,52* 45,2±0,96*

Опытная (D-галактозамин+карсил) 1056±20,9* 889,2±26,12* 22,0±0,42* 37,0±1,02*

контрольных животных выявлялись кровенаполнение центральных вен с эритростазами, краевое стояние и диапедез лейкоцитов. Синусоидальные пространства, прилежащие к центральным венам, были неравномерно расширены и заполнены слипшимися эритроцитами. В строме дольки по ходу синусоидных капилляров отмечали мелкие очажки слабо выраженной полиморфноклеточной инфильтрации; в зоне портальных трактов — значительное количество апоптотических гепатоцитов с эози-нофильной цитоплазмой и гиперхромным ядром. Наблюдали выраженную зернистую дистрофию гепатоцитов, локально — гидропическую с наличием вакуолей, а также пятнистый некроз. На 7 сутки наблюдений в печени животных контрольной группы дистрофические и некротические изменения приобретали более масштабные размеры. У 6 из 10 животных наблюдалась тотальная гидропиче-ская дистрофия гепатоцитов, сопровождающаяся множественным мелкоочаговым некрозом. У двух животных гидропическая дистрофия гепатоцитов сочеталась с жировой дистрофией. Увеличилось количество гепатоцитов с баллонной дистрофией. В некротизированных зонах отмечалась лейкоцитарная инфильтрация; повсеместно — гиперплазия и очаговая пролиферация звездчатых эндотелио-цитов; в зоне портальных трактов — гепатоциты с эозинофильной цитоплазмой. В результате чего балочно-радиальное строение печёночных долек было стёртым.

Курсовое введение животным экстракта Н. етесЫт и карсила ограничивало развитие дистрофических и некротических изменений, воспалительных процессов в паренхиме печени на фоне D-галактозаминового гепатита во все сроки наблюдений. Так, на 3 сутки эксперимента в отдельных

центральных венах печени животных опытных групп выявлялись кровенаполнение и стаз эритроцитов, краевое стояние в них лейкоцитов и их диапедез. Синусоидальные пространства, прилежащие к центральным венам, были умеренно расширены. В капиллярах не отмечали стаз эритроцитов. Локально встречались клетки с умеренной гидропической и единично с жировой дистрофией. Некрозу были подвержены единичные гепатоциты. На 7 сутки наблюдений гидропической дистрофии были подвержены гепатоциты, расположенные в зоне центральной вены. Единично встречались гепатоциты с баллонной дистрофией. Наблюдали локальный пятнистый некроз гепатоцитов. Ба-лочно-радиальное строение печёночных долек не было нарушено.

Таким образом, экстракт Н. етесЫт в диапазоне указанных доз обладает выраженной желчегонной активностью, а также проявляет выраженное гепатопротекторное влияние при экспериментальном D-галатозаминовом гепатите, ингибируя нарушения холатосинтетической и холатокине-тической функций печени на фоне ограничения дистрофических и некротических изменений в печени, интенсивность воспалительной инфильтрации, а также стимулируя инволюцию органических изменений и регенерацию печеночных клеток. Нормализация процессов желчеобразования и желчевыделения связана со свойством биофлавоноидов, содержащихся в значительном количестве в исследуемом экстракте,— активизировать энергетический обмен в гепатоцитах и проявлять выраженное антиоксидантное действие [12]. Определенно, биофлавоноиды, инги-бируя процессы перекисного окисления липи-дов, предотвращают дезинтеграцию активности

холестерингидроксилазы — основного фермента утилизации холестерина в желчные кислоты. Наряду с этим, полифенолы способствуют транспорту холатов, экскреции билирубина и холестерина, а также ускоряют регенерацию и восстановление

Литература

1. Асеева Т. А., Базарон Э. Г., Резанова О. И. Расшифровка тибетского названия «Бар-ба-да» и его применение в индо-тибетской медицине. Растительные ресурсы, 1979, Т. 15, вып.2, сс. 293-296.

2. Блинова К. Ф., Куваев Б. В. Лекарственные растения тибетской медицины Забайкалья. Вопросы фармакогнозии, 1965, Т.19, Вып. 3, сс. 163-178.

3. Сумати Праджня «Кунпан — Дудзи» (Полезный для всех экстракт амриты): Большой рецептурный справочник Агинского дацана/Д. Б. Дашиева (пер. с тибетского). — М., 2008.

4. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Magno1iaceae — Limoniaceae. — Л., 1984.

5. Степанова Т. А. Химическое изучение флавоноидов пижмы северной и пижмы сибирской: Автореф.... дис. канд. фарм.наук. — М., 1982.

6. Яхонтова Л. Д., Комарова М. Н., Перельсон М. Е. и соавт. Алкалоиды Hypecoum eтectum. Строение гирекорина и гипекоринина. Химия природных соединений, 1972, № 5, сс. 624-628.

7. Венгеровский А. И., Саратиков А. С. Методические указания по изучению гепатозащитной активности

функциональной активности гепатоцитов [13]. Холеретические и гепатопротекторные свойства экстракта H. erectum являются весьма ценным сочетанием для комплексного лечения и профилактики заболеваний печени и желчевыводящих путей.

фармакологических веществ. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. — М., 2005, сс. 683-691.

8. Скакун Н. П. Нейрогуморальный механизм желчегонного действия инсулина. Проблемы эндокринологии, 1956, № 6, сс.75-78.

9. Мирошниченко В. П., Громашевская Л. Л., Касаткина М. Г. и соавт. Определение содержания желчных кислот и холестерина в желчи. Лабораторное дело, 1978, № 3, сс. 149-153.

10. Микроскопическая техника: Руководство/Д. С. Сар-кисова и Ю. Л. Перова (ред). — М., 1996.

11. Сергиенко В. И., Бондарева И. Б. Математическая статистика в клинических исследованиях. — М., 2006.

12. Торопова А. А., РазуваеваЯ. Г., Николаев С. М. и соавт. Антиоксидантная и мембраностабилизирующая активность экстрактов Lomatogonium carinthiacum (Wulfen) Reichenb and Hypecoum erectum L. в модельных системах. Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, 2012, 6 (88), сс. 94-97.

13. Николаев С. М. Растительные лекарственные препараты при повреждениях гепатобилиарной системы. — Новосибирск, 1992.