CC BY
49
УДК: 616-006.441:577.12
ГЕНЫ ФОЛАТНОГО ЦИКЛА И СИСТЕМЫ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ КАК МАРКЕРЫ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАЗВИТИЮ НЕХОДЖКИНСКИХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ЛИМФОМ У ЖИТЕЛЕЙ г. НОВОСИБИРСКА
Ольга Валерьевна БЕРЕЗИНА1, Александра Сергеевна ШАДРИНА2, Татьяна Ивановна ПОСПЕЛОВА1, Максим Леонидович ФИЛИПЕНКО2
1 ГБОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России 630091, г. Новосибирск, Красный пр., 52
2 ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН 630090, г. Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 8
Изменения в генах фолатного цикла и системы биотрансформации ксенобиотиков могут опосредовать различную предрасположенность к неходжкинским злокачественным лимфомам (НХЗЛ). В настоящем исследовании изучена связь семи однонуклеотидных замен в генах фолатного цикла и делеций в генах глутатион^-трансфераз М1 и Т1 (GSTM1 и GSTT1) с риском развития НХЗЛ. Для полиморфного локуса G1258A гена МТИЕБ1 выявлена ассоциация мутантного 1958А-аллеля со снижением риска возникновения агрессивных лимфом (OR = 0,578, С. I. [0,415-0,805], р < 0,001). Сочетание мутантных 1420Т-аллелей в гомозиготном Т/Т-генотипе БИМТ1 обусловливает повышение риска развития данной группы лимфом в 2,2 раза (р < 0,02). У носителей мутантного генотипа 08ТМ1 повышен риск развития фолликулярных лимфом (OR = 1,96, С. I. [1,072-3,581], р < 0,02). Таким образом, указанные полиморфные локусы могут играть роль в патогенезе НХЗЛ и использоваться в диагностике этих заболеваний.
Ключевые слова: неходжкинские лимфомы, ДВККЛ, фолликулярная лимфома, гены биотрансформации ксенобиотиков, фолатный цикл, полиморфизм.
Достижения генетики и молекулярной биологии оказали огромное влияние на понимание природы инициализации и прогрессии злокачественных образований, что открыло принципиально новые возможности в диагностике и лечении опухолевых заболеваний. В настоящее время сформировалось несколько направлений использования молекулярных тестов в онкологии, одним из которых является генетическое тестирование онкологического риска путем исследования полиморфных вариантов генов [4]. Для некоторых заболеваний уже появилась возможность сформировать «геномный профиль болезни», представляющий собой распределение по геному полиморфных аллелей, характерных для определенной патологии [1]. В ряде исследований показана генетическая предрасположенность для не-ходжкинских злокачественных лимфом (НХЗЛ), что делает обоснованным поиск молекулярных
маркеров развития данной группы неоплазий [13, 18]. В исследованиях Е.Н. Воропаевой и соавторов была показана роль мутантных аллелей ряда полиморфных локусов генов системы репарации ДНК, програмированной клеточной смерти, хемокиновых рецепторов в развитии НХЗЛ у жителей г. Новосибирска [3, 5], но для создания геномного профиля необходимо продолжить поиск молекулярных маркеров заболевания. Такими маркерами могут являться гены фолатного цикла и системы биотрансформации ксенобиотиков, которые играют ключевую роль в процессах синтеза и метилирования ДНК, биотрансформации ксенобиотиков, а их полиморфизмы, изменяя свойства кодируемых белков, могут вызывать нестабильность генома, что в ряде случаев способствует предрасположенности носителей этих генов к развитию опухолей различной локализации. Вместе с тем роль данных полиморфизмов в па-
Березина О.В. - к.м.н., ассистент кафедры терапии, гематологии и трансфузиологии, e-mail: [email protected]
Шадрина А.С. - старший лаборант лаборатории фармакогеномики, [email protected] Поспелова Т. И. - д.м.н., проф., зав. кафедрой терапии, гематологии и трансфузиологии, e-mail: [email protected].
Филипенко М.Л. - к.б.н., руководитель лаборатории фармакогеномики, e-mail: [email protected]
тогенезе гемобластозов остается малоизученной. Ряд авторов указывают на то, что одни и те же аллели полиморфных локусов генов фолатного цикла и системы биотрансформации ксенобиотиков глутатион^-трансфераз T1 и М1 могут иметь как проонкогенный, так и защитный эффект, в зависимости от этнической принадлежности популяции, типа ткани, из которой развивается опухоль, и воздействия вредных факторов внешней среды [1], что делает обоснованным изучение их влияния на развитие НХЗЛ в популяции г. Новосибирска.
Учитывая вышеизложенное, представляется значимым и перспективным исследование врожденных генетических полиморфизмов C677T и A1298C гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), A2756G гена метионинсинтазы (MTR), A66G гена редуктазы-метионинсинтазы (MTRR), G1958A гена метилентетрагидрофолат-дегидро-геназы (MTHFD1), С1420Т гена серингидро-ксиметилтрансферазы (SHMT1), T833C/844ins68 гена цистатионин-Р-синтазы (CBS), глутатион-S-трансфераз T1 и Ml (GSTT1 и GSTM1) у больных НХЗЛ с целью установления их роли в предрасположенности к развитию заболевания.
Цель работы - изучить полиморфные варианты генов ключевых ферментов фолатного цикла и второй фазы системы биотрансформации ксенобиотиков глутатион^-трансфераз T1 и Ml у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами и установить их связь с риском развития заболевания.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Реактивы. В работе были использованы Tween 20 («Serva», США), додецилсульфат натрия, Tris base, акриламид, N^N-метиленбисакри-ламид, ТЕМЕД (все «ICN», США), Taq ДНК-полимераза (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Россия), протеиназа К («Serva», США). Остальные реактивы были отечественного производства и имели категорию не ниже «хч». Дезоксинуклеозидтри-фосфаты (dNTP), TaqMan-зонды и олигонукле-отидные праймеры синтезированы в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.
Выборки. Группу обследованных составили 146 пациентов с впервые установленным диагнозом НХЗЛ. Средний возраст больных -52,4 ± 14,97 года (18-72 лет). По полу больные распределились поровну: мужчины и женщины по 73 человека. В соответствии с классификацией ВОЗ 2008 г. [17] пациенты были разделены на группы в зависимости от иммунологической при-
надлежности: с B-клеточными лимфомами - 135 человек (92,5 %), с T-клеточными - 11 пациентов (7,5 %). Агрессивные лимфомы (диффузная крупноклеточная, беркиттоподобная, плеоморфная, лимфобластная, центробластная, иммунобласт-ная, плазмобластная, анапластическая, мантий-ноклеточная, фолликулярная 3-го цитологического типа) были диагностированы у 89 пациентов (61 %), а индолентные (диффузная мелкоклеточная, пролимфоцитарная, центроцитарная, лимфо-плазмоцитарная, фолликулярная 1-го и 2-го цитологического типов, из клеток маргинальной зоны, MALT-лимфома) - у 57 человек (39 %). Средний возраст больных агрессивными лимфомами составил 49,4 ± 14,2 года, пациентов с индолент-ными лимфомами - 57,2 ± 13,5 года. Стадия заболевания определялась согласно классификации Ann Arbor (1971 г.). В обеих группах подавляющее большинство пациентов имели генерализованные (III и IV) стадии заболевания: 75 человек (84 %) в группе агрессивных НХЗЛ и 45 пациентов (79 %) в группе индолентных лимфом. Контрольная группа для генов ферментов фолатного цикла состояла из 549 доноров Новосибирского центра крови, средний возраст обследованных был равен 33,0 ± 11,0 года. Для полиморфных локусов GSTM1 и GSTT1 группу контроля составили 177 доноров Новосибирского центра крови, средний возраст 31,0 ± 12,0 года. Исследования выполнены в соответствии с этическими нормами Хельсинкской декларации (2000 г.), все пациенты подписывали информированное согласие на участие в исследовании в соответствии с требованиями этического комитета.
Генотипирование. ДНК выделяли из венозной крови с использованием стандартной процедуры, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз белков протеиназой К, очистку ДНК экстракцией примесей фенол-хлороформом и осаждение ДНК этанолом, а также из буккаль-ного эпителия с использованием стандартной методики выделения ДНК на силике.
Генотипы полиморфных локусов G1958A гена MTHFD1 и 844ins68 гена CBS определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с изучением полиморфизма длин рестрикци-онных фрагментов. Реакцию для определения данных SNPs проводили одновременно в одной пробирке. ПЦР выполняли в конечном объеме
15 мкл, содержащем 65 мМ Tris-HCl (рН 8,9),
16 мМ сульфат аммония; 3,5 мМ MgCl2; 0,05%-й Tween 20; 0,2 мМ dNTP; 0,3 мкМ растворы оли-гонуклеотидных праймеров (табл. 1), 20-100 нг ДНК и 1 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы на ДНК-амплификаторе фирмы «Eppendorf» (Германия) с начальной денатурацией при 95 оС 3 мин, далее в
Таблица 1
Последовательности олигонуклеотидных праймеров и TaqMan-зондов
Название локуса Последовательность праймеров Последовательность TagMan-зондов
C677TMTHFR 5'-ctgaagcacttgaaggag-3' 5'-tcacaaagcggaagaatg-3' 5'-R6G-ctgcgggagccgatttc-BHQ-3' 5'-FAM-ctgcgggagtcgatttcat-BHQ-3'
A1298C MTHFR 5'-aggagctgctgaagatgtg-3' 5'- atcactcactttgtgaccattc-3' 5'-FAM-ccagtgaagaaagtgtctttg-BHQ-3' 5'-R6G-ccagrgaagcaagtgtctttg-BHQ-3'
A2756G MTR 5'-ctatcttgcattttcagtgttcc-3' 5'-atctgtttctaccacttaccttgag-3' 5'-R6G-ctcataatggccctgtctaa-BHQ-3' 5'-FAM-ctcataatggtcctgtctaa-BHQ-3'
A66G MTRR 5'-ccttatcggattcactaatacagtg-3' 5'-tgaggaggtttctgttactatatgc-3' 5'-R6G-ttgctcacacatttcttct-BHQ-3' 5'-FAM-cttgctcacatatttcttct-BHQ-3'
C1420T SHMT1 5'-ccaggtgggtccagagtg-3' 5'-gagagactggcaggggataa-3'g 5'-R6G-cttcgcctctctcttccctct-BHQ-3' 5'-FAM-cttcgcctctttcttccctct-BHQ-3'
G1958A MTHFD1 5'-tccataccgttgaatgtgtggtc-3' 5'-ccaacaagcttgagtgcggtc-3'
844ins68 CBS 5'-caggcacctgcctttacttctgag-3' 5'-ggttgtctgctccgtctggttc-3'
GSTMl 5'-gtcaaggacatcatagacgagaa-3' 5'-ctcaggagaaactgaagccaaa-3'
GSTTl 5'- gctagttgctgaagtcctgctta-3' 5'- cttggccttcagaatgacct -3'
LTM 5'- tgggtgctagaggtataatcg -3' 5'- ttagaggaagctgggtaagag -3'
течение 38 циклов с денатурацией 10 с при 95 оС, отжигом праймеров 10 с при 63 оС и элонгацией 15 с при 72 оС. Финальную элонгацию проводили при 72 оС в течение 5 мин. Амплификационные продукты длиной (169 пар нуклеотидов, п. н.) обрабатывали эндонуклеазой рестрикции Bme18I. Длины фрагментов, получаемых в результате гидролиза, составляли: 129 + 20 п. н. при генотипе MTHFDl G/G, 149 + 129 + 20 п. н. при генотипе MTHFDl G/A, 149 + 20 п. н. при генотипе MTHFDl A/A, 271 + 68 + 48 п. н. при генотипе CBS D/D, 339 + 271 + 68 + 48 п. н. при генотипе CBS D/I, 339 + 48 п. н. при генотипе CBS I/I. Анализ продуктов гидролиза проводили в 8%-м ПААГ, гель окрашивали бромистым этидием с визуализацией ДНК УФ-светом, затем фотографировали с помощью цифровой видеокамеры.
Полиморфные варианты генов MTHFR, MTR, MTRR и SHMTl определяли методом ПЦР в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов, комплементарных полиморфной последовательности ДНК. ПЦР выполняли в конечном объеме 25 мкл, содержащем 65 мМ Tris-HCl (рН 8,9), 16 мМ сульфат аммония; 3,5 мМ MgCl2, 0,01%-й Tween 20, 0,2 мМ dNTP, 0,3 мкМ растворы олигонуклеотидных праймеров, 0,1 мкМ растворы TaqMan-зондов, 20-100 нг ДНК и 1 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы. Последовательности праймеров и TaqMan-зондов приведены в табл. 1. ПЦР проводили на ДНК-амплификаторе iCycler iQ5 («Bio-Rad», США)
c начальной денатурацией при 96 оС 2 мин, далее в течение 42 циклов: 96 оС 8 с, затем 60 оС для C677T MTHFR и C1420T SHMTI, 58 оС для A1298C MTHFR и A2756G MTR, 56 оС для A66G MTRR в течение 40 с.
Амплификацию специфических участков генов GSTM1 и GSTT1 также проводили методом ПЦР в режиме реального времени. Для исключения отсутствия флуоресцентного сигнала в связи с отсутствием ДНК или ингибированием ПЦР в реакционные смеси добавляли в качестве внутреннего контроля легкоплавкие праймеры (LTM). Структуры праймеров приведены в табл. 1. ПЦР выполняли в стандартном буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 50 мМ KCl, 0,05 % Tween 20, 2,4 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTP, растворы праймеров (1 мМ LTM + 1 мМ GSTM1 или 0,5 мМ LTM + 1 мМ GSTT1), 0,8х SYBR Green, 0,5-2 нг/ мкл матрицы ДНК, 0,02 ед. акт. термостабильной Taq-полимеразы. Амплификацию осуществляли на ДНК-амплификаторе iCycler iQ5 с применением методики hot-старт, при этом праймеры и dNTP с помощью парафина отделяли от ДНК и Taq-полимеразы. Реакционный объем составлял 25 мкл, каждая реакционная смесь была покрыта равным объемом минерального масла. ПЦР проводили при следующих условиях: для GSTM1 -начальная денатурация 2 мин при 95 оС, далее 40 циклов при следующих условиях: денатурация 10 с при 95 оС, отжиг праймеров 10 с при 66,0 оС, элонгация 10 с при 72 оС, регистрация флуорес-
центного сигнала 10 с при 78 оС, затем 10 с при 85 оС; для GSTT1 - начальная денатурация 2 мин при 95 оС, далее 10 циклов при следующих условиях: денатурация 10 с при 95 оС, отжиг прайме-ров 10 с при 66 оС, элонгация 10 с при 72 оС, затем 30 циклов при следующих условиях: денатурация 10 с при 95 оС, отжиг праймеров 10 с при 64 оС, элонгация 10 с при 72 оС, регистрация флуоресцентного сигнала 10 с при 78 оС, затем 10 с при 91 оС. Далее регистрировали кривые плавления: 60 циклов по 10 с с повышением температуры на 0,5 оС в каждом цикле - начальная температура составила 65 °С для GSTM1 + LTM и 70 оС для GSTT1 + LTM, регистрацию флуоресцентного сигнала производили в каждом цикле. Полученные результаты интерпретировали, исходя из анализа графиков накопления флуоресценции, специфичность оценивали с помощью кривой плавления. Накопление флуоресцентного сигнала происходило прямо пропорционально накоплению фрагментов ДНК, так как использовался интеркалирующий краситель SYBR Green - вещество, способное к значительному увеличению флуоресценции при связывании с двуцепочечной молекулой ДНК. При регистрации кривой плавления происходила денатурация двуцепочечных продуктов ПЦР и, соответственно, снижался уровень флуоресцентного сигнала, температура плавления составляла 78 оС для LTM, 85 оС для GSTM1 и 91 оС для GSTT1.
Статистическая обработка данных. Частоты встречаемости аллелей и генотипов одно-нуклеотидных замен (SNPs) в генах фолатного цикла, делеционных генотипов GSTT1 и GSTM1 в выборке больных НХЗЛ сравнивали с таковыми в контрольной группе. Значимость различий оценивали с помощью критерия %2, статистически значимыми считали различия при р < 0,05. Соответствие контрольной выборки равновесию Харди - Вайнберга также проверяли с помощью критерия х2. Для оценки величины относительного риска использовали отношение шансов (OR) с его доверительным интервалом (C. I.) при уровне доверия 95 %. Вычисления проводили с помощью программы DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия, http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/ hw/hwa1.pl). Поиск публикаций для метаанализа осуществляли с помощью базы данных PubMed. При включении оригинальных исследований в метаанализ учитывали следующие критерии: а) исследование ассоциации одного из изучаемых SNP и НХЗЛ; б) дизайн эксперимента типа «case-control»; в) численность контрольной группы и группы пациентов с НХЗЛ не менее 150 человек; г) распределение генотипов в контрольной груп-
пе соответствует равновесию Харди - Вайнберга. Для метаанализа использовались значения OR и 95 % С. I. (редкий аллель против частый аллель).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящем исследовании изучена роль генов системы фолатного цикла и второй фазы системы биотрансформации ксенобиотиков ОБТМ1 и ОБТТ1, имеющих доказанное функциональное значение. Данные полиморфные варианты, изменяя активность, стабильность или количество соответствующих ферментов, могли бы обусловить нарушение баланса между важнейшими метаболическими путями цикла фолиевой кислоты- синтезом dTMP и пуриновых нуклеотидов и метилированием ДНК, приводить к повреждению ДНК и, как следствие, злокачественной трансформации путем накопления большего количества активных метаболитов, обладающих мутагенными и канцерогенными свойствами, тем самым влияя на индукцию канцерогенных процессов.
Были определены частоты встречаемости аллелей и генотипов исследуемых полиморфных локусов у пациентов с НХЗЛ и у лиц контрольной группы. Распределение частот встречаемости генотипов соответствовало закону Харди - Вайн-берга в группе контроля.
Для полиморфного локуса G1958A гена МТИЕВ1 выявлена сильная ассоциация аллеля 1958А со сниженным риском развития ДВККЛ ^ = 0,429; С. I. [0,279-0,659], р < 0,00008, табл. 2), которая является наиболее частым гистологическим вариантом агрессивных НХЗЛ. Для индолентных лимфом ассоциации данного полиморфного локуса с риском развития НХЗЛ не обнаружено. Однонуклеотидная замена G1958A приводит к замене Arg653Gln в формилтетрагид-рафолатсинтетазном домене фермента MTHFD и уменьшает его термостабильность и метаболическую активность [9]. Субстратом MTHFD является тетрагидрофолат, накопление которого может приводить к увеличению концентрации 5,10-метилентетрагидрофолата, что, в свою очередь, способно увеличивать эффективность синтеза тимидилата и метилирования ДНК, тем самым препятствуя злокачественной трансформации. К настоящему времени существует ряд исследований, указывающих на протективный эффект фолата (предшественника тетрагидро-фолата) в отношении НХЗЛ [11, 12, 16]. Однако данных о связи полиморфного локуса G1958A МТИЕВ1 с увеличением внутриклеточной концентрации тетрагидрофолата на сегодняшний день не обнаружено. В работе Christensen et а1. [9]
Таблица 2
Анализ ассоциации полиморфных локусов G1958A MTHFD1 и С1420Т SHMT1 с риском развития
агрессивных лимфом
Ассоциация аллелей Ассоциация генотипов
G1958A MTHFD1
G, % (n) A, % (n) G/G, % (n) G/A,% (n) A/A,% (n)
Больные ДВККЛ (n = 54) и ККЛ (n = 27) 70 (76) 30 (32) 50 (27) 41 (22) 9 (5)
Контроль (n = 539) 50,5 (544) 49,5 (534) 26 (141) 49 (262) 25 (136)
OR 2,331 0,429 5,209 0,439 0,192
C. I. 1,517-3,584 0,279-0,659 1,949-3,918 0,241-0,798 0,072-0,513
P 0,00008 0,00008 0,0003 0,006 0,0003
C1420T SHMT1
C, % (n) T, % (n) C/C, % (n) C/T, % (n) T/T, % (n)
Больные агрессивными лимфомами (n = 85) 61 (104) 39 (66) 40 (34) 42 (36) 18 (15)
Контроль (n = 504) 68 (689) 32 (319) 46 (231) 45 (227) 9 (46)
OR 0,730 1,371 0,451 1,077 2,215
C. I. 0,521-1,021 0,980-1,918 0,228-1,895 0,651-1,782 1,117-4,395
P 0,06 0,9 0,02 0,7 0,02
показана ассоциация аллеля 1958A со снижением эффективности синтеза пуриновых нуклеотидов, что могло бы, напротив, обусловить влияние полиморфного аллеля на увеличение риска онкологических заболеваний. В исследовании Wang L. et al. [21] обнаружена ассоциация генотипа 1958AA с риском рака желудка, что может быть обусловлено как раз эффектом данной замены. Вероятно, для одних видов неоплазий, в том числе индолентных НХЗЛ, процесс синтеза пуринов играет более существенную роль, чем синтез ти-мидилата и метилирование ДНК, для других же, например для агрессивных лимфом, важнее два последних процесса.
При анализе влияния аллелей и генотипов полиморфного локуса С1420Т гена SHMT1 на развитие НХЗЛ обнаружена ассоциация минорного T-аллеля с повышенным риском развития агрессивных НХЗЛ на грани статистической значимости (OR = 1,371, C. I. [0,980-1,918], p = 0,06). Однако сочетание аллелей T в гомозиготном T/T-генотипе обусловливает повышение риска развития агрессивных лимфом в 2,2 раза (p < 0,02), что говорит о суммации эффектов минорных аллелей (см. табл. 2). Фермент SHMT1 имеет решающее значение в обеспечении метильными группами для синтеза пуринов, тимидилата и метионина, а также имеет другие метаболические функции. Однонуклеотидная замена С1420Т в гене SHMT1 приводит к замене лейцина на фенилаланин в 427 позиции (Leu427Phe), что приводит к уменьшению каталитической активности фермента и,
как следствие, снижению эффективности синтеза ДНК [14]. Данные по влиянию этой однонукле-отидной замены на внутриклеточный уровень фолатов противоречивы, так же как и сведения о ее влиянии на развитие разных видов неоплазий. Skibo1a et а1. не наблюдали ассоциации С1420Т БИМТ1 с развитием НХЗЛ [19]. Подобные результаты получены S. №с^ et а1. на выборке пациентов с фолликулярной лимфомой и М. Berg1und et а1. у больных фолликулярной и диффузной В-крупноклеточной лимфомами в когорте шведских пациентов [8, 14]. Вместе с тем в исследовании, в которое были включены пациенты с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), лица, несущие 1420Т аллель гена БИМТ1, характеризовались снижением риска развития ОЛЛ [20].
Анализ остальных исследуемых локусов системы фолатного цикла ассоциации с агрессивными и индолентными НХЗЛ в выборке жителей г. Новосибирска не выявил.
Анализ частот генотипов генов второй фазы системы биотрансформации ксенобиотиков ОБТМ1 и ОБТТ1 показал, что распределение нормальных и делеционных генотипов ОБТМ1 и ОБТТ1 в группах больных агрессивными лим-фомами не отличалось и совпадало с популяци-онным. У пациентов с фолликулярными лимфо-мами 1-го и 2-го цитологического типов частота делеционного генотипа ОБТМ1 составила 10/15 (67 %), что почти в 2 раза больше, чем в группах больных агрессивными вариантами заболевания и контроле (табл. 3). Мутантный (делеционный)
Таблица 3
Распределение генотипов полиморфных локусов GSTM1 и GSTT1 в подгруппах агрессивных и индолентных неходжкинских злокачественных лимфом
Генотип Контроль (n = 177), n (%) ДВККЛ (n = 56), n (%) ККЛ (n = 28), n (%) ДВМКЛ (n = 17), n (%) ФЛ (n = 15), n (%) OR [95% C. I.]
GSTMlnull 70 (40) 18 (32) 9 (32) 9 (53) 10 (67) *,#,л 3,06 [1,01-9,32]
GSTM1 + 107 (60) 38 (68) 19 (68) 8 (47) 5 (33) *,#,л 0,33 [0,11-1,01]
GSTTlnull 48 (27) 18 (32) 4 (14) 3 (18) 4 (27) -
GSTT1+ 129 (73) 38 (68) 25 (86) 14 (82) 11 (73) -
GSTM1null/GSTTnull 22 (12,5) 8 (14) 0 (0) 0 (0) 4 (27) -
GSTM1+/GSTT1+ 73 (41,5) 28 (50) 14 (50) 3 (18) 5 (33) -
GSTM1null/GSTT1+ и GSTM1+/GSTT1null 82 (46) 20 (36) 14 (50) 14 (82) 6 (40) -
Примечание. ДВМКЛ - диффузные В-мелкоклеточнаые лимфомы, ФЛ - фолликулярные лимфомы; обозначены статистически значимые отличия от величины соответствующего показателя: * - группы контроля (р < 0,04), # - пациентов с ДВККЛ (р < 0,02), л - пациентов с ККЛ (р < 0,04).
генотип GSTM1 обусловливает повышение риска развития фолликулярной лимфомы в 3 раза ДО = 3,06, С. I. [1,01-9,32],р < 0,039), тогда как нормальный генотип GSTM1 обладает протек-тивным эффектом. Подобные результаты получены S. Hohaus еt а1., 2007, которые показали, помимо увеличения риска развития фолликулярных лимфом, что делеционный генотип ОБТМ1 может модифицировать факторы, входящие в прогностические индекс FLIPI, приводя к более плохим результатам лечения у пациентов именно низкой группы риска [10]. Для ряда опухолей установлено увеличение частоты мутаций в гене апоп-тоза р53 у носителей делеции в генах глутатион-S-трансфераз [6, 7, 22]. Поскольку путем апопто-за элиминируются потенциально злокачественные клетки, результатом модификации гена р53 является значительное повышение вероятности развития злокачественных опухолей. Нарушение функции р53 в результате точечных мутаций, делеций, образования комплекса с другим клеточным регулятором или изменение внутриклеточной локализации приводит к утрате супрессивных свойств и стимулирует опухолевый процесс. Нарушения процессов апоптоза являются ключевыми в патогенезе развития индолент-ных лимфом в целом и фолликулярной лимфомы в частности [2]. Показано, что частота мутаций в гене р53 у пациентов с лимфомами меньше, чем у больных с солидными неоплазиями, но в то же время при фолликулярных лимфомах - несколько больше, чем при других вариантах НХЗЛ, в частности ДВККЛ, и достигает 16 % [5]. Вышесказанное может объяснять большую частоту деле-ционного генотипа GSTM1 именно у пациентов с фолликулярной лимфомой.
Различий в подгруппах как агрессивных, так и индолентных лимфом между собой и в сравнении с контрольной группой по полиморфному локусу GSTT1 не выявлено. Для всех групп неходжкин-ских злокачественных лимфом не обнаружено влияния сочетания нормальных и делеционных генотипов на риск развития, что может быть связано с нивелированием эффектов отдельных ло-кусов в комбинации.
Одной из проблем широкого внедрения достижений предиктивной медицины является доказательство достоверности ассоциации определенного гена или полиморфизма с развитием заболевания, что нередко обусловлено небольшой выборкой пациентов и контроля. В связи с этим важным является проведение метаанализа, позволяющего увеличить статистическую мощность исследования и выявить дополнительные ассоциации. Нами выполнен метаанализ данных по генам фолатного цикла (для полиморфных локусов в генах MTHFD1 и CBS метаанализ не проводился в связи с недостаточным количеством публикаций). С целью снижения вероятности учета исследований с возможными ошибками ге-нотипирования в метаанализ включались только работы с выполнением закона Харди - Вайнбер-га в контрольной группе. Размеры объединенной выборки больных НХЗЛ колебались от 896 человек для полиморфного локуса A66G гена MTRR до 4176 пациентов для однонуклеотидной замены C677T в гене MTHFR. В большинстве исследований, включая настоящее, отмечена ассоциация мутантного 2756G-аллеля MTR со сниженным риском развития НХЗЛ, и при расчете объединенного отношения шансов она оказалась статистически значимой (OR = 0,902; C. I. [0,821-0,991],
Корея (Kim et at., 2008) Австралия (Lee et al., 2007) Австралия** (Lincz et al., 2002) Италия (Gemmaty et al., 2004) Англия (Lightfoot et al., 2005) Франция (Niclot et al., 2006) Швеция (Berglund et al., 2009) Германия (Linnebank et al., 2004) ■ Россия*** (Наше исследование)
Summary
i-1-1-1-1-1-1-1
0,06 0,16 0,40 1,00 OR
Рис. Форест-график для полиморфного локуса A2756G гена MTR. Размер объединенной выборки: больные - 2602 человека, контроль - 4756 человек
р = 0,03), что подтвердило вклад данной замены в предрасположенность к НХЗЛ (см. рисунок).
Ассоциация 27560-аллеля со сниженным количеством гиперметилированных CpG-островков в составе генов-супрессоров опухоли была показана в работе M.F. Paz et al. [15]. Вероятно, мутантный аллель способствует активации генов-супрессоров опухоли, что обусловливает полученную ассоциацию, однако детальный механизм такого влияния данного аллеля в настоящее время остается неизученным.
Ни для одного из остальных полиморфных локусов не было выявлено ассоциации с НХЗЛ в объединенной выборке при выполнении мета-анализа. Стоит отметить, что для большинства полиморфных замен наблюдался большой разброс значений отношения шансов и 95%-го доверительного интервала между исследованиями, включенными в метаанализ. Вероятно, такие различия в результатах связаны с влиянием этнических особенностей выборок.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенное исследование выявило ассоциацию полиморфного локуса G1958A гена MTHFD1 со снижением риска и C1420T гена SHMT1, напротив, с увеличением риска развития агрессивных НХЗЛ, в то время как подобной связи с риском развития индолентных лимфом не обнаружено. Носители делеции в гене GSTM1 имеют риск развития фолликулярной лимфомы. Полученные данные могут свидетельствовать о разном вкладе мутантных генотипов данных полиморфных ло-кусов в образование агрессивных и индолентных лимфом. Таким образом, полиморфные локусы G1958A MTHFD1, C1420T SHMT1, ген GSTM1
могут рассматриваться как дополнительные молекулярные маркеры развития НХЗЛ. В то же время их разнонаправленное действие на возникновение лимфом может подтверждать сложное действие однонуклеотидных замен на лимфомо-генез, и в дальнейших исследованиях предстоит определить, имеют ли данные замены самостоятельные функциональные последствия или находятся в неравновесии по сцеплению с другими, еще не известными вариантами, которые ответственны за наблюдаемые ассоциации.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Баранов В.С. Генетический паспорт - основа индивидуальной и предиктивной медицины. СПб., 2009. 528 с.
2. Волкова М.А. Клиническая онкогематология. М.: Медицина, 2007. 1120 с.
3. ВоропаеваЕ.Н., СкворцоваН.В., ВоеводаМ.И., Тарновский Р.В. Клиническое значение делеции гена CCR5 у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами // Бюл. СО РАМН. 2011. 31. (2). 26-30.
4. Имянитов Е.Н., Хансон К.П. Молекулярная генетика в клинической онкологии // Сиб. онкол. журн. 2004. 2-3 (10-11). 40-47.
5. Поспелова Т.И., Воропаева Е.Н., Воевода М.И., Березина О.В. Полиморфизм генар53 как потенциальный маркер предрасположенности к развитию неходжкинских злокачественных лимфом // Гема-тол. трансфузиол. 2010. 55. (1). 11-17.
6. Agodi A., Barchitta M., Cipresso R. et al. Distribution of p53, GST, and MTHFR polymorphisms and risk of cervical intraepithelial lesions in Sicily // Int. J. Gynecol. Cancer. 2010. 20. (1). 141-146.
7. Avti P.K., Vaiphei K., Pathak C.M., Khan-duja K.L. Involvement of various molecular events in cellular injury induced by smokeless tobacco // Chem. Res. Toxicol. 2010. 2. (7). 1163-1174.
8. BerglundM., Enblad G., Turesson I. et al. Folate-metabolizing genes in lymphoma patients from Sweden // Scand. J. Immunol. 2009. 70 (4). 408-410.
9. Christensen K.E., Rohlicek C.V., Andelfinger G.U. et al. The MTHFD1 p.Arg653Gln variant alters enzyme function and increases risk for congenital heart defects // Hum. Mutat. 2009. 30. (2). 212-220.
10. Hohaus S., Mansueto G., Massini G. et al. Glu-tathione-S-transferase genotypes influence prognosis in follicular non-Hodgkin's Lymphoma // Leuk. Lymphoma. 2007. 48. (3). 564-569.
11. Koutros S., Zhang Y., Zhu Y. et al. Nutrients contributing to one-carbon metabolism and risk of non-Hodgkin lymphoma subtypes // Am. J. Epidemiol. 2008. 167 (3). 287-294.
12. Lim U., SchenkM., Kelemen L.E. et al. Dietary determinants of one-carbon metabolism and the risk of
non-Hodgkin's lymphoma: NCI-SEER case-control study, 1998-2000 // Am. J. Epidemiol. 2005. 162 (10). 953-964.
13. Linet M.S., Pottern L.M. Familial aggregation of hematopoietic malignancies and risk of non-Hodgkin's lymphoma // Cancer Res. 1992. 52 (19). 5468-5473.
14. Niclot S., Pruvot Q., Besson C. et al. Implication of the folate-methionine metabolism pathways in susceptibility to follicular lymphomas // Blood. 2006. 108 (1). 278-85.
15. Paz M.F., Avila S., Fraga M.F. et al. Germline variants in methyl-group metabolism genes and susceptibility to DNA methylation in normal tissues and human primary tumors // Cancer Res. 2002. 62. (15). 4519-4524.
16. Polesel J., Dal Maso L., La Vecchia C. et al. Dietary folate, alcohol consumption, and risk of non-Hodgkin lymphoma // Nutr. Cancer. 2007. 57. (2). 146-150.
17. Sabbatini E., Bacci F., Sagramoso C., Pileri S.A. WHO classification of tumours of haematopoietic and
lymphoid tissues in 2008: an overview // Pathologica. 2010. 102. (3). 83-87.
18. Segel G.B., Lichtman M.A. Familial (inherited) leukemia, lymphoma, and myeloma: an overview // Blood Cells Mol. Dis. 2004. 32. (1). 246-261.
19. Skibola C.F., Forrest M.S., Coppede F. et al. Polymorphisms and haplotypes in folate-metabolizing genes and risk of non-Hodgkin lymphoma // Blood. 2004.104. 2155-2162.
20. Skibola C.F., Smith M.T., Hubbard A. et al. Polymorphisms in the thymidylate synthase and serine hydroxymethyltransferase genes and risk of adult acute lymphocytic leukemia // Blood. 2002. 99. 3786-3791.
21. Wang L., Ke Q., Chen W. et al. Polymorphisms of MTHFD, plasma homocysteine levels, and risk of gastric cancer in a high-risk Chinese population // Clin. Cancer Res. 2007. 13. (8). 2526-2532.
22. Zhang Z., Deng X., Ren X., Zhang B. et al. Expression of mutant p53 and of the multidrug resistant proteins P-glycoprotein and glutathione S-transferase-pi correlated in colorectal adenocarcinoma // Scand. J. Gastroenterol. 2010. 45. (7-8). 925-934.
FOLATE CYCLE AND XENOBIOTIC BIOTRANSFORMATION SYSTEM GENES AS MARKERS OF DEVELOPMENT RISK OF NON-HODGKIN MALIGNANT LYMPHOMAS IN THE RESIDENTS OF NOVOSIBIRSK
Olga Valerievna BEREZINA1, Aleksandra Sergeevna SHADRINA2, Tatyana Ivanovna POSPELOVA1, Maksim Leonidovich FILIPENKO2
1 Novosibirsk State Medical University of Miszdrav of Russia 630091, Novosibirsk, Krasny av., 52
2 Institute for Chemical Biology and Fundamental Medicine of SB RAS 630090, Novosibirsk, Akademic Lavrentiev av., 8
Changes in folate cycle and xenobiotic biotransformation system genes may cause the different susceptibility to non-Hodgkin's lymphomas (NHL). In the present study the association between seven single nucleotide substitutions in the folate cycle genes and deletions in genes of glutathione-S-transferase M1 and T1 (GSTM1 and GSTT1) with genetic risk of NHL was investigated. Association of 1958A-mutant allele with decreased aggressive lymphoma risk was revealed for polymorphic locus G1258A MTHFD1 (OR = 0.578, CI [0.415-0.805], p < 0.001). The combination of mutant 1420T alleles in homozygous T/T-genotype of SHMT1 gene may cause an increased aggressive lymphoma risk in 2.2 times (p < 0.02). The carriers of the mutant GSTM1 genotype have increased follicular lymphoma risk (OR = 1.96, CI [1.072-3.581],p < 0.02). Thus, these polymorphic variants may play a role in the pathogenesis of NHL and be used in non-Hodgkin's lymphomas diagnosis.
Key words: non-Hodgkin's lymphoma, Diffuse B-cell lymphoma, follicular lymphoma, genes of biotransformation, folate cycle, polymorphism.
Berezina O.V. - candidate of medical sciences, assistant of the chair for therapy, hematology and blood transfusiology, e-mail: [email protected]
Shadrina A.S. - senior assistant of the pharmacogenomic laboratory, e-mail: [email protected] Pospelova T.I. - doctor of medical sciences, professor, the head of the chair for therapy, hematology and transfusiology, e-mail: [email protected].
Filipenko M.L. - candidate of biological sciences, head of the pharmacogenomic laboratory, e-mail: [email protected]
