CC BY
29
УДК 616
ПОИСК МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРЕДИКТОРОВ РАЗВИТИЯ
АГРЕССИВНЫХ ЛИМФОМ
О.В. Березина1, Т.И. Поспелова1, МЛ. Филипенко2, Е.Н. Воропаева3, В.С. Овчинников1
1 ФГБОУ ВО "Новосибирский государственный медицинский университет" Минздрава России
2 ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск
3ФГБНУ "НИИ терапии и профилактической медицины", Новосибирск E-mail: [email protected]
SEARCHING FOR MOLECULAR-GENETIC PREDICTORS OF AGGRESSIVE LYMPHOMAS
O.V. Berezina1, T.I. Pospelova1, M.L. Filipenko2, E.N. Voropaeva3, V.S. Ovchinnikov1
1 Novosibirsk State Medical University 2 Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of SB RAS, Novosibirsk institute of Internal and Preventive Medicine, Novosibirsk
Изучены полиморфные локусы генов фолатного обмена: C677T и A1298C MTHFR, A2756G MTR, A66G MTRR, G1958A MTHFD1 и 844ins68 CBS у больных агрессивными неходжкинскими злокачественными лимфомами. Обнаружена ассоциация редкого аллеля 1958A гена MTHFD1 со снижением риска развития диффузной В-крупноклеточной лимфомы (OR=0,429; C.I. [0.279-0.659], p<0,0008). Влияния других полиморфных локусов на предрасположенность к развитию лимфом не обнаружено.
Ключевые слова: генетический полиморфизм, SNP, фолаты, лимфома, предрасположенность.
Polymorphic loci of genes of folate metabolism C677T and A1298CMTHFR, A2756GMTR, A66GMTRR, G1958AMTHFD1 and 844ins68 CBS have been studied in patients with aggressive malignant Non Hodgkin lymphomas. The association of a rare allele 1958A MTHFD1 with a reduced risk of enlargement of diffuse large B-cell lymphoma (0R=0.429; C.I. [0.279-0.659], p<0.0008) is found. Impact of other polymorphic loci on susceptibility to enlargement of lymphomas has not been detected yet.
Key words: genetic polymorphism, the SNP, folates, lymphoma, susceptibility.
Введение
Выявление молекулярно-генетических маркеров развития и прогноза для опухолевых заболеваний крови составляет суть предиктивной онкогематологии, основной задачей которой является поиск доказательств диагностической ценности тех или иных генных полиморфизмов [3]. В качестве потенциальных маркеров исследуются гены различных систем клетки: метаболизма ксенобиотиков, апоптоза, цитокинов и др. Среди них большой интерес представляют гены фолатного обмена - важной биохимической системы клетки, влияющей на регуляцию экспрессии генов путем эпигенетической модификации ДНК (рис. 1). Метилирование СрО-островков в промоторе гена является нормальным процессом регуляции степени экспрессии генов в клетках. Гиперметилирование промоторов генов, которое связано с подавлением транскрипции, так же как и мутации, является механизмом инактивации классических генов-супрессоров опухолевого роста [12]. Аномальное метилирование генов-супрес-соров опухолей встречается на ранних стадиях онкоге-неза и прогрессивно увеличивается, что в конечном итоге приводит к злокачественной трансформации. Аберрантное метилирование ДНК и, как следствие, измененная экспрессия генов описаны при В-клеточных неходжкин-ских злокачественных лимфомах (НХЗЛ) [10]. Полимор-
фные варианты генов фолатного цикла, которые влияют на метилирование ДНК, могут способствовать возникновению неходжкинских злокачественных лимфом, вызывая гипо- или гиперметилирование протоонкогенов и генов супрессоров опухолевого роста соответственно [11].
В связи с тем, что отмечается увеличение частоты агрессивных НХЗЛ в г. Новосибирске [5] актуально исследование однонуклеотидных замен (SNPs) в генах фолат-ного цикла как потенциальных молекулярно-генетичес-ких маркеров развития лимфоидных неоплазий.
Цель работы: изучить роль полиморфных локусов C677T и A1298C гена метилентетрагидрофолатредукта-зы (MTHFR), A2756G гена метионинсинтазы (MTR), A66G гена метионинсинтазыредуктазы (MTRR), G1958A гена ме-тилентетрагидрофолатдегидрогеназы (MTHFD1) и 844ins68 гена цистатион-р-синтазы (CBS) в формировании предрасположенности к развитию агрессивных НХЗЛ.
Материал и методы
Выборки. Группу обследованных составили 89 пациентов (46 мужчин и 43 женщины; средний возраст 49,4±14,2 года) Городского гематологического центра города Новосибирска с диагнозом агрессивной неходж-кинской лимфомы. Диагностика и лечение НХЗЛ прово-
О.В. Березина и соавт.
ПОИСК МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРЕДИКТОРОВ РАЗВИТИЯ.,
Рис. 1. (адаптировано из [15]) Фолатный цикл: dTMP - тимидин; dUMP - уридин; THF - тетрагидрофолат; 5,10-methyleneTHF -5,10-метилентетрагидрофолат; 5-methylTHF - 5-метилтетрагидрофолат; 10-formylTHF - 10-формилтетрагидрофолат; Met - ме-тионин; Hcy - гомоцистеин; SAM - S-аденозилметионин; MTHFR - метилентетрагидрофолатредуктаза; SHMT - серилгидрокси-метилтрансфераза; MTHFD - метилентетрагидрофолатдегидрогеназа; MTR - метионинсинтаза; MTRR - редуктаза метионинсин-тазы; SHMT - серингидроксиметилтрансфераза; CBS - цистатионин-р-синтаза; Cystathionine - цистатионин
дилось согласно Российским клиническим рекомендациям по диагностике и лечению лимфопролиферативных заболеваний [1]. Вариант НХЗЛ оценивался согласно классификации лимфоидных неоплазий ВОЗ 2008 года. В-клеточные лимфомы имели 79 (88,8%) человек. Диффузная В-крупноклеточная лимфома диагностирована у 56 (71%) пациентов, анапластическая и мантийноклеточ-ная - у 8 (10,1%) человек каждая, лимфобластная и фолликулярная 3-го цитологического типа - у 3 (3,8%) человек каждая, беркиттоподобная у 1 (1,2%) пациента. Т-кле-точные лимфомы диагностированы у 10 (11,2%) больных.
Контрольную группу составили 549 доноров Новосибирского центра крови, средний возраст обследованных 33,0 ± 11,01 лет.
Все пациенты подписывали информированное согласие на участие в исследовании в соответствии с требованиями этического комитета.
Генотипирование. ДНК выделяли из венозной крови с использованием стандартной процедуры, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз белков проте-иназой К, очистку ДНК экстракцией примесей фенол-хлороформом и осаждение ДНК этанолом; а также из бук-кального эпителия с использованием стандартной методики выделения ДНК на силике.
Определение генотипов полиморфных локусов G1958A гена MTHFD1 и 844ins68 гена CBS проводилось методом ПЦР-ПДРФ анализа. Определение полиморфных вариантов генов MTHFR, MTR, MTRR и SHMT1 проводилось методом ПЦР в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов, комплементар-
ных полиморфной последовательности ДНК. Генотипирование осуществлялось по методике, описанной в [16].
Статистическая обработка данных. Частоты встречаемости аллелей и генотипов однонуклеотидных замен в генах фолатного цикла в выборке больных НХЗЛ сравнивали с таковыми в контрольной группе. Значимость различий оценивалась с помощью критерия х2, статистически значимыми считались различия при р<0,05. Соответствие контрольной выборки равновесию Харди-Вай-нберга также проверяли с помощью критерия х2. Для оценки величины относительного риска использовали отношение шансов (OR) с его доверительным интервалом (C.I.) при уровне доверия 95%. Вычисления производились с помощью программы DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия, http:// www.helmholtz-muenchen.de/ihg/index.html). При оценке количественных признаков использовали вычисление средней арифметической (М) и ее ошибки (m).
Результаты
Исследованные SNPs имеют доказанное функциональное значение, т.е. изменяют активность, стабильность или количество соответствующих ферментов, что может привести к нарушению баланса между важнейшими метаболическими путями цикла фолиевой кислоты - синтезом dTMP и пуриновых нуклеотидов и метилированием ДНК, приводить к повреждению ДНК и, как следствие, инициировать онкогенез и обусловливать опухолевую прогрессию.
Таблица 1
Распределение аллелей и генотипов полиморфного локуса G1958A гена MTHFD1в группе пациентов с агрессивными лимфомами
Аллели Контроль БольныеДВККЛ OR Больные ККЛ
Генотипы 1 2 C.I. 3
Абс. % Абс. % P Абс. %
n=539 n=54 ДВККЛ n=27
G 544 50,5 76 70 2,331 24 44
Р,- < 0,0008 1,517-3,584 Р1-3 > 0,05
Р2- < 0,001 0,0008
A 534 49,5 32 30 0,429 30 56
Р1- < 0,0008 0,279-0,659 Р1-3 > 0,05
Р2- < 0,001 0,0008
G/G 141 26 27 50 5,209 3 11
Pi- < 0,003 1,949-13,918 Р1-3 > 0,05
Р2- < 0,002 0,003
G/A 262 49 22 41 0,439 18 67
Р1- < 0,006 0,241-0,798 Р1-3 > 0,05
0,006
A/A 136 25 5 9 0,192 6 22
Р1- < 0,003 0,072-0,513 Р1-3 > 0,05
Р2- < 0,002 0,003
При анализе частот аллелей исследуемых полиморфных локусов в общей группе агрессивных лимфом отмечено увеличение частоты дикого 19580-аллеля гена МТИРБ1 (64%) по сравнению с контролем (50,5%, р < 0,001), тогда как редкий 1958А-аллель в группе агрессивных НХЗЛ встречался реже: 36% против 49,5% (р < 0,001).
Из группы агрессивных НХЗЛ, с учетом наибольшей представленности, были выделены пациенты с диффузной В-крупноклеточной лимфомой (ДВККЛ, п=5б). Отдельному анализу также подверглись больные с другими вариантами агрессивных лимфом (Т- и В-анапластичес-кой, Т и В-лимфобластной, беркиттоподобной, мантий-ноклеточной, фолликулярной 3-го цитологического типа, плеоморфной, п=33), преимущественно крупноклеточными (ККЛ).
Дикий 19580-аллель МТИРБ1 в группе больных ДВККЛ встречался чаще как по сравнению с группой контроля: 70% против 50,5% (р < 0,0008), так и с группой больных ККЛ, в которой частота 19580-аллеля составила 44% (р < 0,001). В свою очередь, частота редкого 1958А-аллеля МТШВ1 в группе больных ДВККЛ составила лишь 30%, тогда как в группе пациентов с ККЛ - 56%, а в популяции г. Новосибирска - 49,5% (табл. 1).
Учитывая различия в распределении аллелей и генотипов в группе ДВККЛ, была проведена оценка риска развития данной группы неоплазий.
Для полиморфного локуса С1958А гена МТИРБ1 выявлена сильная ассоциация редкого 1958А-аллеля со сниженным риском развития ДВККЛ ^=0,429 С.1. [0,2790,659], р<0,0008, табл. 1), в то время как связи данной од-нонуклеотидной замены с другими вариантами агрессивных лимфом не обнаружено.
Объяснением полученным данным может служить то,
что однонуклеотидная замена G1958A приводит к замене Arg653Gln в формилтетрагидрафолатсинтетазном домене фермента MTHFD и уменьшает его термостабильность и метаболическую активность [7]. Поскольку субстратом данного фермента является тетрагидрофолат, потенциально его накопление способствует повышению концентрации 5,10-метилентетрагидрофолата, что, в свою очередь, может увеличивать эффективность синтеза тимидилата и метилирования ДНК, тем самым препятствуя злокачественной трансформации (рис. 1). Подтверждением этому служит ряд исследований, указывающих на протективный эффект фолата (предшественника тет-рагидрофолата) в отношении НХЗЛ [6, 9].
Подобная ассоциация была отмечена при раке легкого в китайской популяции [8]. В то время как в работе Wang et al. была обнаружена ассоциация генотипа 1958A/ A с увеличением риска возникновения рака желудка [14]. В целом исследований, посвященных роли полиморфного локуса G1958A MTHFD1 в развитии онкологической патологии, очень мало, что свидетельствует о необходимости изучения данного полиморфного локуса и его влияния на биохимические процессы в клетке.
Анализ остальных исследуемых локусов системы фо-латного цикла ассоциации с агрессивными НХЗЛ в выборке жителей г. Новосибирска не выявил.
Заключение
Проведенное исследование выявило ассоциацию полиморфного локуса G1958A гена MTHFD1 с предрасположенностью к развитию диффузной-В-крупноклеточ-ной лимфомы, что позволяет рассматривать данный ло-кус как потенциальный маркер для включения в панель
О.В. Березина и соавт.
ПОИСК МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРЕДИКТОРОВ РАЗВИТИЯ..,
SNPs, вклад которых в развитие и прогноз неходжкинс-ких злокачественных лимфом у жителей Западно-Сибирского региона был показан ранее [2, 4, 13]. Рискометрия НХЗЛ - это первый этап работы, направленный на выявление молекулярно-генетических предикторов, которые могут использоваться в рутинной диагностике лимфоид-ных неоплазий. В дальнейшем необходимо продолжить исследование на большем объеме выборки с изучением биохимических механизмов, определяющих действие полиморфных локусов генов фолатного обмена на лимфо-могенез.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта
интересов.
Литература
1. Аль-Ради Л.С., Барях Е.А., Белоусова И.Э. и др. Российские клинические рекомендации по диагностике и лечению лим-фопролиферативных заболеваний // Современная онкология. - 2014. - №S. - С. 6-126.
2. Березина О.В., Поспелова Т.И., Овчинников В.С. и др. Полиморфизм глутатион^-трансфераз m1 и т1 (GSTM1 и GSTT1) у больных неходжкинскими злокачественными лимфома-ми // Сибирский научный медицинский журнал. - 2013. -Т. 33. - №1. - С. 40-46.
3. Воропаева Е.Н., Березина О.В., Овчинников В.С. и др. Пре-диктивное значение тестирования полиморфного локуса Arg72Pro 4 экзона антионкогена TP53 у пациентов с неход-жкинскими лимфомами // Сибирский научный медицинский журнал. - 2013. - Т. 33, № 1. - С. 28-33.
4. Воропаева Е.Н., Поспелова Т.И., Воевода М.И. Ассоциация полиморфизма Arg399Gln гена репарации ДНК XRCC1 с риском развития неходжкинских лимфом высокой степени злокачественности // Гематология и трансфузиология.
- 2013. - Т. 58, № 1. - С. 10-14.
5. Ковынев И.Б., Поспелова Т.И., Агеева Т.А. и др. Частота и структура неходжкинских злокачественных лимфом в Новосибирске, НСО и городах Сибирского федерального округа // Сибирский научный медицинский журнал. - 2006.
- Т. 26, № 4. - С. 175-181.
6. Christensen K.E., Rohlicek C.V., Andelfinger G.U. et al. The MTHFD1 p.Arg653Gln variant alters enzyme function and increases risk for congenital heart defects // Human Mutation.
- 2009. - Vol. 30, No. 2. - P. 212-220.
7. Koutros S., Zhang Y., Zhu Y. et al. Nutrients contributing to one-carbon metabolism and risk of non-Hodgkin lymphoma subtypes // American Journal of Epidemiology. - 2008. -Vol. 167, No. 3. - P. 287-294.
8. Liu H., Jin G., Wang H. et al. Association of polymorphisms in one-carbon metabolizing genes and lung cancer risk: a case-control study in Chinese population // Lung Cancer. - 2008. -Vol. 61, No. 1. - P. 21-29
9. Polesel J., Dal Maso L., La Vecchia C. et al. Dietary folate, alcohol consumption and risk of non-Hodgkin lymphoma // Nutrition and Cancer. - 2007. - Vol. 57, No. 2. - P. 146-150.
10. Shaknovich R., Melnick A. Epigenetics and B-cell lymphoma // Curr. Opin. Hematol. - 2011. - Vol. 18, No. 4. - P. 293-299.
11. Skibola C.F., Curry J.D., Nieters A. Genetic susceptibility to lymphoma // Haematologica. - 2007. - Vol. 92, No. 7. - P. 960969.
12. Tsou J.A., Hagen J.A. et al. DNA methylation analysis: a powerful new tool for lung cancer diagnosis // Oncogene. - 2002. -Vol. 21, No. 35. - P. 5450-5461.
13. Voropaeva E.N., Voevoda M.I., Maksimov V.N. et al. Prognostic impact of the tp53 rsl625895 polymorphism in dlbcl patients // British Journal of Haematology. - 2015. - Vol. 169, No. 1. -P. 32-35.
14. Wang L., Ke Q., Chen W. et al. Polymorphisms of MTHFD, plasma homocysteine levels, and risk of gastric cancer in a high-risk Chinese population // Clin. Cancer Res. - 2007. - Vol. 13, No. 8. - P. 2526-2532.
15. Weiner A.S., Gordeeva L.A., Voronina E.N. et al. Polymorphisms in folate-metabolizing genes and risk of having an offspring with congenital anomalies in the West Siberian region of Russia: a case-control study // Prenat. Diagn. - 2012. - Vol. 32, No. 11. - P. 1041-1048
16. Weiner A.S., Voronina E.N., Boyarskih U.A. et al. Polymorphisms in folate-metabolizing genes and risk of non-hodgkin's lymphoma // Leukemia Research. - 2011. - Vol. 35, No. 4. -P. 508-515.
Поступила 17.10.2016
Сведения об авторах
Березина Ольга Валерьевна, канд. мед. наук, ассистент кафедры терапии, гематологии и трансфузиологии ФПК и ППВ ФГБОУ ВО "Новосибирский государственный медицинский университет" Минздрава России. Адрес: 630091, г. Новосибирск, ул. Красный проспект, 52.
E-mail: [email protected]. Поспелова Татьяна Ивановна, докт. мед. наук, проректор по научной работе, заведующая кафедрой терапии, гематологии и трансфузиологии ФПК и ППВ ФГБОУ ВО "Новосибирский государственный медицинский университет" Минздрава России, заслуженный врач РФ.
Адрес: 630091, г. Новосибирск, ул. Красный проспект, 52.
E-mail: [email protected]. Филипенко Максим Леонидович, канд. биол. наук, заведующий лабораторией фармакогеномики ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.
Адрес: 630090, г. Новосибирск, пр. Ак Лаврентьева, 8. E-mail: [email protected]. Воропаева Елена Николаевна, докт. мед. наук, научный сотрудник лаборатории молекулярно-генетических методов исследования терапевтических заболеваний ФГБНУ НИИ терапии и профилактической медицины, Новосибирск
Адрес: 630089, г. Новосибирск, ул. Б. Богаткова, 175/1. E-mail: [email protected]. Овчинников Виктор Сергеевич, аспирант кафедры терапии, гематологии и трансфузиологии ФПК и ППВ ФГБОУ ВО "Новосибирский государственный медицинский университет" Минздрава России. Адрес: 630091, г. Новосибирск, ул. Красный проспект, 52.
E-mail: black [email protected].
