CC BY
101
УДК 634.8 + 631.52 + 581.167
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ СОРТОВ ВИНОГРАДА ПО МОЛЕКУЛЯРНЫМ МАРКЁРАМ
Милованов Александр Валериевич аспирант, учебный мастер
Трошин Леонид Петрович д.б.н., профессор
Кубанский государственный аграрный университет, Краснодар, Россия
В статье представлены результаты работы по генотипированию новых перспективных столовых и технических сортов и протоклонов винограда. Установлено, что сорта Цитрин, Гелиос, Аркадия розовая и Преображение выделились генетическим разнообразием по четырем локусам
Ключевые слова: ВИНОГРАД, СОРТ, ЛИСТ, ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК, SSR-МАРКЁР, ПЦР, ЭЛЕКТРОФОРЕЗ, КЛОНОВАЯ СЕЛЕКЦИЯ, ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ, ФОРЕГРАММА
UDC 634.8 + 631.52 + 581.167
GENOTYPING OF GRAPE VARIETIES WITH USING MICROSATELLITE SSr MARKERS
Milovanov Alexander Valerievich postgraduate student, training master
Troshin Leonid Petrovich Dr.Sci.Biol., professor
Kuban State Agrarian University, Krasnodar, Russia
This article presents the results of genotyping of new perspective table and technical varieties and grapes protoclones. It was established that varieties of Citrine, Helios, Arcadia pink and Preobragenie show differ genetic diversity in four loci
Keywords: GRAPE, VARIETY, LEAF, EXTRACTION OF DNA, SSR, PCR, ELECTROPHORESYS, CLONAL SELECTION, GENETIC DIVERSITY, PHOREGRAM
ВВЕДЕНИЕ
Сортовой состав Краснодарского края отличается большим разнообразием. Конечно же, время не стоит на месте, и селекция движется вперед, появляется большее количество сортов. Распространение в практике клоновой селекции молекулярно-генетических методов анализа ускорило эти процессы в разы, особенно после открытия наличия микросателлитных аллелей, набор которых специфичен для каждого сорта винограда. Идентифицировать их уникальность позволяет использование ПЦР-анализа вкупе с ДНК-маркёрами.
ДНК-маркеры являются характеристикой генотипа и не зависят от фенотипа, они обеспечивают богатство полиморфизмов, позволяющих идентифицировать сорта и строить точные генетические карты во многих высших растениях. Высокий уровень генетического разнообразия у винограда, который распространен по всему миру, вызывает интерес к оценке генетического родства внутри подвида рода Vitis vinifera sativa L., а
также необходимость разработки распознающих систем, пригодных для идентификации виноградных сортов [11].
Генетический резерв винограда в настоящее время представляет собой смесь древних и совсем недавно выведенных сортов. Перед тем как новые сорта заменят старые, кажется разумным сделать усилие, дабы идентифицировать ценные древние генотипы и редкие сорта, которые могли бы сделать производство вина более ареально-типичным. В настоящее время сорта идентифицируются различными молекулярными маркерами. Среди них - микросателлиты или SSRs. Они представляют собой короткие последовательности ДНК, 1-6 нуклеотидов длиной, повторяемых несколько раз при каждом локусе. В связи с ошибками полимеразы во время репликации ДНК, локусы породили множество аллелей, которые отличаются по длине из-за различного количества повторов последовательности. В растениях микросателлиты, по оценкам, встречаются часто, на один из каждых 1-2 400 тысяч нуклеотидов в наборе видов растений, включая арабидопсис, рис, сою, кукурузу и пшеницу. Множество микросателлитных аллелей уже обнаружено в винограде и выявлен высокий уровень гетерозиготности вида, приводящей к повышению полиморфизма SSR маркеров и к решению многих проблем, связанных с сортовой идентификацией и анализом родословной [10].
Молекулярные маркеры имеют огромный потенциал для поиска генетических различий между генотипами на уровне ДНК и, следовательно, определения уровня разнообразия среди генотипов. Среди молекулярных маркеров, SSR-маркеры являются наиболее подходящими из-за их кодоминантности, очень большого числа повторов, высокой частоты и обилия в селективно нейтральной области. Высоко насыщенные карты сцепления на основе одних только микросателлитных маркеров или их интеграция с другим типом маркеров доступны в винограде.
Микросателлитные маркеры оказались полезными для установления «личности» генотипов, фингерпринтинга и анализа разнообразия, подвоев и сортов и межвидовых гибридов [6].
Первые результаты по дифференциации клонов генетическими маркерами показывают, что эта тема ограничивается не инструментами, а количеством использованных локусов. Если используется большое количество маркёров, вероятность найти различные аллели увеличивается. RAPD (случайная амплификация полиморфной ДНК), Интер SSR, AFLP (амплификация полиморфного фрагмента) и даже SSR маркеры могут применяться для нахождения полиморфизма локусов среди популяций. например Траминера белого и других культурных сортов. Для идентификации клонов только маркеры, характеризующие аллели, будут воспроизводимыми и стабильными в анализе [9].
В 2013 году нами продолжалась работа по генотипированию новых перспективных сортов и клонов винограда по шести нейтральным микросателлитным маркерам [5]. Образцы при этом по морфологической схожести поделены на соответствующие группы молекулярного анализа. Результаты работы приведены ниже, в том числе и в виде фото фореграмм (рис. 1-4).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для анализа были отобраны листья сортов и протоклонов винограда, их названия приведены в таблицах 1-3. Для удобства генотипы были поделены на группы по 19, 18 и 56 штук. Сбор образцов для молекулярно-генетического анализа производился в учхозе «Кубань» КубГАУ, ОАО АФ «Южная» и ООО «Фанагория-Агро» Темрюкского
района Краснодарского края. Для сохранения листья нижеперечисленных генотипов были помещены в морозильную камеру при - 200С. Таблица 1. - Список листьев сортов и протоклонов винограда (№№ 1-19),
взятыми для молекулярно-генетического анализа
1 Хризолит (Монарх) 3-2
2 Богатяновский 2-2
3 Аркадия розовая 1-2
4 Низина 3-2
5 Низина 3-2
6 Цитрин (Супер-экстра) 3-1
7 Юбилей Новочеркасска 3-7
8 Первозванный 3-10
9 Пино серый 46 куст 1
10 Пино серый 46 куст 2
11 Пино серый 46 куст 3
12 Преображение 3-2
13 Гелиос 3-50
14 Гурман ранний 3-31
15 Анюта 3-5
16 Виктор 3-29
17 Долгожданный 3-6
18 Кишмиш венгерский (342) 3-6
19 Ливия 3-14
Таблица 2. - Список листьев сортов и протоклонов винограда (№№ 1-18)
1 Цитрин (Супер-экстра) 21 куст
2 Цитрин (Супер-экстра) 9 куст
3 Гелиос 9 куст
4 Гелиос 16 куст
5 Богатяновский 6 куст
6 Богатяновский 9 куст
7 Аркадия розовая 4 куст
8 Аркадия розовая 10 куст
9 Анюта 5 куст
10 Анюта 19 куст
11 Виктор 7 куст
12 Виктор 5 куст
13 Преображение 15 куст
14 Преображение 5 куст
15 Первозванный 4 куст
16 Первозванный 6 куст
17 Монарх 13 куст
18 Монарх 1 куст
Таблица 3. - Список листьев сортов и протоклонов (№№ 1-56)
1 24-15 29 5-42
2 8-10 30 2-4-13
3 24-53 31 7-1
4 24-52 32 Рошфор-Ф
5 24-49 33 Цитрин (Супер-экстра)- Ф
6 24-47! 34 Алиготе 7-10
7 24-43 35 Ливия-Ф
8 24-31! 36 Мерло 10-8
9 24-42 37 Солярис 70-16
10 24-29! 38 Вердо черный 7-6
11 24-27 39 Каберне-Совиньон 210-8
12 24-38 40 Рислинг 245-7
13 8-19 41 Иоханитер 80-6
14 2-4-11 42 Иоханитер 79-4
15 6-83 43 Каберне Карбон 525-4
16 24-25 44 Каберне-Совиньон 210-4
17 24-23 45 Совиньон белый 23-11
18 7-9 46 Совиньон белый 23-8
19 24-21 47 Мерло 10-9
20 24-19 48 Каберне Карбон 525-6
21 7-16 49 Рислинг 245-5
22 7-11 50 Вердо черный 7-2
23 7-3 51 Солярис 70-21
24 24-17 52 Каберне Кортис 271-7
25 4-17 (9-12) 53 Алиготе 7-7К
26 24-33! 54 Пино черный 50-11
27 6-80 55 Каберне Кортис 271-2
28 5-40 56 Пино черный 50-8
Выделение ДНК из свежих листьев осуществляли модифицированным СТАБ-методом [1].
ПЦР проводилась по параметрам, описанным в публикациях А.С.Звягина. Для анализа генетического разнообразия были использованы
6 нейтральных микросателлитных маркеров (праймеров): VrZag62, VrZag79, VVMD5, VVMD7, VVMD27 и VVS2 [7, 8, 12, 13, 14].
Праймер (англ. primer) — это короткий фрагмент нуклеиновой кислоты (олигонуклеотид), комплементарный ДНК или РНК мишени, служит затравкой для синтеза комплементарной цепи с помощью ДНК-полимеразы, а также при репликации ДНК. Затравка необходима ДНК-полимеразам для инициации синтеза новой цепи, с 3'-конца гидроксильной группы праймера. ДНК-полимераза последовательно добавляет к 3'-концу праймера нуклеотиды, комплементарные матричной цепи. В большинстве случаев естественной репликации ДНК праймером для синтеза ДНК является короткий фрагмент РНК, создаваемый заново. Такой рибонуклеотидный праймер создается ферментом праймазой, и впоследствии заменяется дезоксирибонуклеотидами полимеразой, выполняющей в норме функции репарации. Многие лабораторные методы в биохимии и молекулярной биологии, которые предполагают использование ДНК-полимеразы, такие
как секвенирование или полимеразная цепная реакция, требуют наличия коротких олигонуклеотидов (праймеров). Такие праймеры обычно длиной от 6 до 50 оснований - химически синтезированные олигонуклеотиды.
Разделение продуктов амплификации проводили методом электрофореза в 6% акриламидном геле. Далее пластины вымачивались в течение 10-15 минут в бромистом этидии и фотографировались в ультрафиолетовом свете. Анализ полученных фотоснимков проводили в программе Gel-Pro Analyser.
Задача исследований - поиск сходств и различий среди представленных 93 образцов по 4-6 аллелям.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Результаты исследований представлены в виде фотографий фореграмм и таблиц с данными, полученными после их анализа.
Ниже приводятся фото фореграмм трех локусов (рис. 1-4). Первой была генотипирована группа с образцами, обозначенными номерами от 1 до 19. Фотографии фореграмм их приводятся далее.
УУМБ5. Группа 1-19
mw 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 К
mw
*- где К - контроль и mw - маркер молекулярного веса, номера соответствуют образцам в таблицах выше (данная ремарка относится и ко всем остальным фореграммам).
Таблица 4. - Результаты моланализа 19 сортов на наличие 6 микросателлитных аллелей
1 2; 3 4 5 6 7 8 9 10 111 12 13 14 15 16 17 18 19
214 206 221 223 224 211 211 221 224 212 214
208 206 212 208 212 211 211 214 212 212 214
\ZrZag79 233 265 259 258 258 247 263 236 238 238 236 263 247 258 258 259 265 238
VrZag79 238 236 259 234 259 270 270 258 247 270 242 270 236 238 238 236 270 270 268 265 242 267 247 260 258 234 259 236 260 259 261 243 238 249
УУМ05 245 263 263 261 265 264 261 259 259 259 249 243 239 247 243 229
221 216 220 213 226 221 218 216 213 214 217 213 217
\ZVMD7 211 212 211 213 213 216 214 213 213 214 212 213 217
\ZVMD21 224 221 216 214 224 220 220 221 219 220 220 224 218
УШ027 219 218 216 214 215 214 215 216 216 216 216 219 212
\ZVS2 149 138 157 155 158 157 151 151 158 154 154
УУ52 140 138 138 146 147 148 144 143 147 144 146
Второй изучалась группа с номерами от 1 до 56.
УУМБ7. Группа 1-56 (1)
Ш^' 30 29 28 27 26 25 ш^' 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 К ш^'
УУМБ7. Группа 1-56 (2)
Ш^' 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 ш^' 50 51 52 53 54 55 56 ш^'
Таблица 5. - Результаты анализа 56 сортов на наличие 6 микросателлитных аллелей
Третьей изучалась группа образцов под номерами от 1 до 18.
УУМБ 27. Группа 1-18
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
mw
— ^млЫ-
щ
Таблица 6. - Результаты анализа контрастирующих фенотипов 4 столовых сортов по 4 микросателлитным аллелям
Название УУМБ5 УУМБ5 УУМБ7 УУМБ7 УУМБ27 УУМБ27 УУБ2 УУБ2
Цитрин-21 242 242 231 231 238 221 142 142
Цитрин-9 225 215 189 189 238 211 143 143
Гелиос-9 226 226 247 247 228 206 149 142
Гелиос-16 257 257 252 252 228 206 149 139
Аркадия розовая-4 230 230 189 189 230 211 146 139
Аркадия розовая-10 245 245 242 242 216 199 139 139
Преображение-15 236 236 196 185 168 168 121 121
Преображение-5 230 222 224 224 186 186 143 143
Как видим, молекулярно-генетическими методами были прогенотипированы 93 образца.
ВЫВОДЫ
В результате анализа выявлены различия, позволяющие идентифицировать сорта как самостоятельные генотипы. Это позволило подтвердить предположение, что выбранные протоклоны винограда отличаются от контрольных сортов не только агробиологическими, но и генетическими характеристиками, и являются самостоятельными сортами. Это подтверждается патентами, оформленными на них, после прохождения ими госсортоиспытания.
По данным таблицы аллелей № 5 вытекают следующие выводы;
1. Протоклон Цитрин-21 отличается от протоклона Цитрина-9 на 20 и 30 нуклеотидов по локусу УУМБ5, на 50 нуклеотидов по локусу УУМ07, на 10 нуклеотидов по локусу УУМ027 и не отличается по локусу VVS2.
2. Протоклон Гелиос-9 отличается от протоклона Гелиос-16 на 30 нуклоетидов по локусу VVMD5, на 5 нуклеотидов по локусу VVMD7, не отличается по локусу VVMD27, а также не отличается по локусу VVS2.
3. Протоклон Аркадия розовая-4 отличается от протоклона Аркадия розовая-10 на 15 нуклеотидов по локусу VVMD5, на 53 нуклеотида по локусу VVMD7, на 14 и 12 нуклеотидов по локусу VVMD27 и на 7 нуклеотидов по локусу VVS2.
4. Протоклон Преображение-15 отличается на 6 и 14 нуклеотидов от протоклона Преображение-5 по локусу VVMD5, отличается на 28 и 39 нуклеотидов по локусу VVMD7, на 22 нуклеотида по локусу VVMD27 и 22 нуклеотида по локусу VVS2.
При анализе аллелей учитывалась погрешность акриламидного геля, что выражено в отсутствии отличий по некоторым результатам. Считается, что разница менее чем в 5 нуклеотидов не существенна и отсюда принимается гипотеза, что аллели не отличаются.
Наличие же пробелов, даже после трех- и четырехкратного повторения опыта, дает возможность предположить отсутствие аллелей в изучаемых генотипах, но их достаточно большое количество свидетельствует, что следует использовать самые современные методы изучения и говорит о том, что работа должна продолжаться.
Список использованной литературы
1. Звягин А.С. Выделение ДНК из гербарных листьев Vitis vinifera / Звягин А С. // Научный журнал КубГАУ. - 2010. - №58(04).
2. Кострикин И.А. Устойчивые новые и малораспространенные сорта и гибридные формы винограда (Часть 15) / И.А. Кострикин, С.И. Красохина, Е.А. Ключиков. — Ростов н/Д: Эверест, 2008. — 20 с.
3. Крайнов В.Н. Виноград и селекционная инициатива // Дом, сад, огород. — Киев, 2007. — 64 с.
4. Красохина С.И., Хисамутдинов А.Ф. Столовые сорта винограда (справочное пособие) / ГНУ ВНИИВиВ им. Я.И. Потапенко. — Ростов н/Д: Эверест, 2008. — 36 с.
5. Трошин Л.П. Совершенствование сортимента виноградных насаждений России // Научное обеспечение АПК Кубани. — Краснодар, 2002. — С. 109-116.
6. Ajitpal Singh, Krishan Kumar, Manav Indra Singh Gill 1, Parveen Chhuneja, Naresh Kumar Arora and Kuldeep Singh; "Genotype identification and inference of genetic relatedness among different purpose grape varieties and rootstocks using microsatellite markers", African Journal of Biotechnology 9 January, 2013. Vol. 12(2). - PP. 134-141.
7. Bowers J.E., Dangl G.S. and Meredith C.P. Development and characterization of additional microsatellite DNA markers for grape // Am. J. Enol. Vitic. - 1999. - V. 50, №30. -P. 243-246.
8. Bowers J.E., Dangl G.S., Vignani R. and Meredith C.P. Isolation and characterization of new polymorphic simple sequence repeat loci in grape (Vitis vinifera L.) // Genome.- 1996. - V. 39. - P. 628-633.
9. F. Regner, R. Hack and J. L. Santiago; "Highly variable Vitis microsatellite loci for the identification of Pinot Noir clones" HBLA u. BA für Wein und Obstbau, Klosterneuburg, Austria, Vitis 45 (2). - P. 85-91 (2006).
10. L. Zulini, M. Russo and E. Peterlunger; "Genotyping wine and table grape cultivars from Apulia (Southern Italy) using microsatellite markers" Dipartimento di Produzione Vegetale e Tecnologie Agrarie, Universita di Udine, Udine, Italia // Vitis 41 (4). -P. 183-187 (2002).
11. Maria Stella Grando; Claudia Frisinghelli "Grape microsatellite markers: Sizing of DNA alleles and genotype analysis of some grapevine cultivars" Istituto Agrario di San Michele all'Adige, San Michele all'Adige, Italia // Vitis 37 (2). - P 79-82 (1998).
12. Sefc K.M., Regner F., Tureschek E., Glossl J. and Steinkellner. H. Identification of microsatellite sequences in Vitis riparia and their application for genotyping of different Vitis species // Genome. - 1999. - V. 42. - P. 367-373.
13. Thomas M.R. and Scott N.S. Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphism when analysed as sequence-tagged sites (STSs) // Theor. Appl. Genet. - 1993. - V. 86. - P. 985-990.
14. Thomas M.R., Matsumoto S., Cain P. and Scott N.S. Repetitive DNA of grapevine: classes present and sequences suitable for cultivar identification // Theor. Appl. Genet. - 1993. - V. 86. - P. 173-180.
References
1. Zvjagin A.S. Vydelenie DNK iz gerbarnyh list'ev Vitis vinifera / Zvjagin A.S. // Nauchnyj zhurnal KubGAU. - 2010. - №58(04).
2. Kostrikin I.A. Ustojchivye novye i malorasprostranennye sorta i gibridnye formy vinograda (Chast' 15) / I.A. Kostrikin, S.I. Krasohina, E.A. Kljuchikov. — Rostov n/D: Jeverest, 2008. — 20 s.
3. Krajnov V.N. Vinograd i selekcionnaja iniciativa // Dom, sad, ogorod. — Kiev, 2007. — 64 s.
4. Krasohina S.I., Hisamutdinov A.F. Stolovye sorta vinograda (spravochnoe posobie) / GNU VNIIViV im. Ja.I. Potapenko. — Rostov n/D: Jeverest, 2008. — 36 s.
5. Troshin L.P. Sovershenstvovanie sortimenta vinogradnyh nasazhdenij Rossii // Nauchnoe obespechenie APK Kubani. — Krasnodar, 2002. — S. 109-116.
6. Ajitpal Singh, Krishan Kumar, Manav Indra Singh Gill 1, Parveen Chhuneja, Naresh Kumar Arora and Kuldeep Singh; "Genotype identification and inference of genetic relatedness among different purpose grape varieties and rootstocks using microsatellite markers", African Journal of Biotechnology 9 January, 2013. Vol. 12(2). - PP. 134-141.
7. Bowers J.E., Dangl G.S. and Meredith C.P. Development and characterization of additional microsatellite DNA markers for grape // Am. J. Enol. Vitic. - 1999. - V. 50, №30. - P. 243-246.
8. Bowers J.E., Dangl G.S., Vignani R. and Meredith C.P. Isolation and characterization of new polymorphic simple sequence repeat loci in grape (Vitis vinifera L.) // Genome.-1996. - V. 39. - P. 628-633.
9. F. Regner, R. Hack and J. L. Santiago; "Highly variable Vitis microsatellite loci for the identification of Pinot Noir clones" HBLA u. BA für Wein und Obstbau, Klosterneuburg, Austria, Vitis 45 (2). - P. 85-91 (2006).
10. L. Zulini, M. Russo and E. Peterlunger; "Genotyping wine and table grape cultivars from Apulia (Southern Italy) using microsatellite markers" Dipartimento di Produzione Vegetale e Tecnologie Agrarie, Universita di Udine, Udine, Italia // Vitis 41 (4). - P. 183187 (2002).
11. Maria Stella Grando; Claudia Frisinghelli "Grape microsatellite markers: Sizing of DNA alleles and genotype analysis of some grapevine cultivars" Istituto Agrario di San Michele all'Adige, San Michele all'Adige, Italia // Vitis 37 (2). - P 79-82 (1998).
12. Sefc K.M., Regner F., Tureschek E., Glossl J. and Steinkellner. H. Identification of microsatellite sequences in Vitis riparia and their application for genotyping of different Vitis species // Genome. - 1999. - V. 42. - P. 367-373.
13. Thomas M.R. and Scott N.S. Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphism when analysed as sequence-tagged sites (STSs) // Theor. Appl. Genet. -1993.- V. 86. - P. 985-990.
14. Thomas M.R., Matsumoto S., Cain P. and Scott N.S. Repetitive DNA of grapevine: classes present and sequences suitable for cultivar identification // Theor. Appl. Genet. -1993.- V. 86.- P. 173-180.
