CC BY
33
генетический маркер тренированности атлетов: экспрессия гена триптофанил-трнк-синтетазы
М.К. Нурбеков 1, А.А. Елов 1, А.Б. Ильин1, М.Я. Ибрагимова 2, Р.И. Жданов 12
1 Московский государственный гуманитарный университет им. М.А. Шолохова, Институт перспективных исследований и технологий, Москва, Россия
2 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
Tryptophanyl-tRNA synthase gene expression as genetic marker of the athletes' overtraining
M.K. Nurbekov1, A.A. Elov1, A.B. Il'in 1, M.Y. Ibragimova 2, R.I. Zhdanov12
1 М.А. Sholokhov Moscow State University for the Humanities, Russian Institute for Advanced Study, Moscow, Russia
2 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia
В связи с необходимостью разработки эффективных биомаркеров физического состояния и состояния перетренированности (дистресс) особый интерес представляет исследование роли триптофанил-тРНК-синтетазы и соответствующего гена в этом процессе . Предварительную оценку специфичности и уровня экспрессии мРНК триптофанил-тРНКсинтазы, ТРСазы, определяли по методу 1, заключающемуся в сканировании гелей с картиной разделения продуктов полимеразной цепной реакции, ПЦР, кДНК на содержание копий мРНК ТРСазы, параллельно с маркерами количеств ДНК для построения калибровочной кривой Окончательное измерение уровня экспрессии гена ТРСазы проводили уже методами RT-PCR (метод 2) по построенной калибровочной кривой (методика 1) с использованием методики относительной количественной оценки мРНК с использованием референсного гена (методика 2) . Уровень экспрессии гена ТРСазы является критерием силы ответа организма, строго адекватным силе стрессового воздействия (перетренированность) Предложен способ определения у спортсмена состояния утомления и состояния дистресса перетренированности регистрацией повышенной экспрессии гена триптофанил-тРНК-синтетазы Состояние дистресса перетренированности определяют в пилотном проекте по увеличению уровня экспрессии гена ТРСазы в опытном образце по сравнению с контрольным более, чем в 1,45 раза . При сравнении экспрессии до и после интенсивных тренировок достоверно повышается в 1,2—1,6 раза экспрессия мРНК ТРСазы
Ключевые слова: перетренированность спортсменов, эустресс, дистресс, ген триптофанил-тРНК-синтазы, повышение экспрессии гена ТРСазы как биомаркер переутомления
In connection with a necessity the development of effective biomarkers of sportsman physical and overtraining (distress) states, the study of a role of triptophanyl-tRNA synthase, TRSase, and corresponding gene in process is of special interest . Preliminary estimate of specificity and level of mRNA expression of TRSase gene is carried out using method 1: scanning of gels with an image of separation of polymerase chain reaction PCR products to detect quantitatively the content of the mRNA and/or cDNA copies compare, in parallel, to DNA quantity markers to compose a calibrating curve . Final estimation of TRSase gene expression is carries out by real time PCR (method 2) using calibrating curve (technique 1) and relative quantitative estimation of a number of specific mRNA copies with reference gene involved (technique 2). The level of TRSase gene expression represents a criterium of organism response, which is adequate to a stress strength (overtraining) It is proposed to detect the overtraining state at sportsmen using registrating an increased TRSase gene expression . In our pilot project, the distress overtraining state is determined as increased level of specific TRSase gene expression in 1,45 fold higher at the samples under the study compare to control samples . The TRSase mRNA expression before training is increased by 1. 2-1. 6 fold compare to one after training
Keywords: sportsman overtraining, eustress, distress, triptophanyl-tRNA synthase gene, an increase in TRSase gene expression as overtraining biomarker
Введение
Известно, что интенсивные физические нагрузки при тренировках в спорте (дистресс) существенно снижают функции иммунной системы и повышают риск инфекций [1, 2], причем умеренные упражнения (эустресс) наоборот стимулируют иммунную систему [3]. Синдром дистресса перетренированности [4] вызывает существенную потерю физической формы спортсменов и снижение уровня тренированности . На фоне сложности идентификации конкретных причин явления, связанного с чрезмерной интенсивностью тренировочного процесса, резко увеличивается подверженность, в частности, респираторным вирусным инфекциям [1]. Параллельно наблюдаются симптомы диарей, повышенная восприимчивость к аллергенам в окружающей среде и в пище [5]. Дистресс, вызванный интенсивной физической нагрузкой, когда организм уже не может адаптироваться к ней, индуцируя субклиническое нарушение тканей, приводит также к
e-mail: mlkn47@mail . ru; zrenad@gmail . ru
снижению иммунитета, стимуляции экспрессии воспалительных и противовоспалительных цито-кинов, включая, фактор некроза опухоли (TNFa), интерлейкин-1 бета (IL-ip), интерферон гамма (IFNy), интерлейкины 6, 10 (IL-6,IL-10) [1]. Кроме того, синдром перетренированности сопровождается сильным дисбалансом в продукции активных радикалов кислорода (ROS) с последующим оксида-тивным стрессом [6]. Вместе с тем, накапливаются данные о том, что физическая тренированность атлетов, или физический стресс, может, в отличие от дистресса перетренированности, модифицировать генетическую предрасположенность у атлетов [7]. Как было недавно показано в пилотном исследовании на примере генов, вовлеченных в систему гемостаза, регулярные физические упражнения могут опосредованно модифицировать (через объем тромбоцитов) генетически обусловленные эффекты некоторых гемостатических маркёров — PAI-1 и MTHFR — на тон и реактивность вагуса [7].
В связи с необходимостью разработки эффективных биомаркеров физического состояния и синдрома перетренированности особый интерес представляет исследование роли триптофанил-тРНК-синтетазы и соответствующего гена в этом процессе [8—10]. Данный фермент, мощно индуцирующийся противовоспалительным цитокином интерфероном у, участвует в подавлении роста бактериальных и вирусных патогенов, обеспечивая стимуляцию синтеза антител — иммуноглобулинов . Фермент при модификации под действием матриксных металлопротеиназ приобретает сильно выраженную антиангиогенную функцию, подавляя процессы развития метастази-рования опухолей, участвует в синтезе диаденозин-полифосфатов Ар3А, а также обладает в комплексе с рядом факторов антионкогенным действием [11—13]. Столь большой набор дополнительных ре-гуляторных функций фермента делает его важным инструментом для использования в качестве диагностического маркера и как объекта, корректирующего ход терапии В ходе наших пилотных исследований применимости ТРСазы в качестве биомаркера состояния перетренированности и перехода организма за рамки возможностей восстановления и «супервосстановления», установлено, что уровень экспрессии данного гена является критерием силы ответа, строго адекватным силе стрессового воздействия. Превышение определенного «порогового» значения стресса от физической активности в ходе тренировок (дистресс) и запускает комплекс «адаптивных» реакций организма, выражающийся в синдроме «перетренированности» В данной работе проведен цикл скрининговых исследований повышенной экспрессии гена триптофанил-тРНК-синтетазы в состоянии утомления у спортсмена и при дистрессе перетренированности . У спортсменов были взяты контрольные образцы до интенсивной тренировки и опытные образцы биологической пробы после интенсивной тренировки В качестве биообразца используется кровь, соскоб или смыв с ротовой полости, далее следуют отбор и промывка полученных клеток, выделение из них тотальной РНК, проведение обратной транскрипции, амплификация полученных кДНК и оценка экспрессии гена ТРСазы в опытном и контрольном образцах Состояние утомления и синдром дистресса «перетренированности» определяют по увеличению уровня экспрессии гена ТРСазы в опытном образце по сравнению с контрольным образцом более, чем в 1,45 раза .
Материал и методы
Комплекс методик выявления состояния утомления по определению уровня активности гена, кодирующего ТРСазу, по синтезируемой с гена специфической мРНК. Сбор и анализ биологических образцов. Meтод 1. Сбор соскобов с ротовой полости, отбор и промывку полученных клеток осуществляли как в работе [14]. Образцы крови отбирали стандартным прибором фирмы «OneTouch Select» для определения уровня глюкозы Для предохранения РНК образцы смешивали в соотношении 1/3 с фирменным предохраняющим раствором EverFresh («Sileks») . Экспрессия гена ТРСазы количественно оценивалась по уровню специфической мРНК При этом критерием уровня мРНК служил количественный анализ суммарной кДНК определенный методом полимеразной цепной реакции, ПЦР . При проведе-
нии ПЦР, использовались наборы реактивов фирмы «Силекс-М» (http://sileks . com/ru/), специфические затравки синтезировались на фирме «Синтол». Затравки конструировали по программе рекомендуемой фирмой производителем. Выделение препаратов РНК и ДНК осуществляли с помощью набора наночастиц фирмы Силекс [15]. РНК также выделяли с помощью набора «Yellow Solve» фирмы Силекс [16]. Особенностью метода является обязательное требование высокого качества и целостности препаратов РНК . Препараты РНК хранили при -20°С или ниже, либо в виде спиртового осадка при -20°С . РНК переводили в форму комплементарной ДНК с помощью обратной РНК-зависимой ДНК полимеразы (MMoLV) с применением вырожденных гексанукле-отидных затравок Образованную специфическую кДНК ТРСазы выявляли с помощью специфической ПЦР и специально подобранными затравками, которые размножали именно нужные виды кДНК . Гели прокрашивали бромистым этидием или красителем «Сибр-грин» . Полученная кДНК может быть непосредственно сразу же использована для ПЦР или синтеза второй цепи и последующего клонирования Синтезированную кДНК хранили при -20°С или при -70°С для долгосрочного хранения .
Количественный анализ содержания мРНК триптофанил-тРНК-синтетазы в образцах. Метод 2. Количественный анализ экспрессии гена ТРСазы проводили через оценку уровня специфической мРНК Реакцию RT-PCR проводили с использованием наборов реактивов фирмы «Синтол» Количественное определение уровня специфических кДНК для ТРСазы проводили на РТ-ПЦР приборе с использованием TaqMan зондов, приведенных ниже . Условия амплификации: денатурация при 95°С в течение 15 с . , отжиг при 60°С — 15 с . , и полимеризация при 72°С в течение 15 с . (сбор данных осуществляли на стадии полимеризации) Каждую реакцию проводили в трех повторах . Затравки конструировали по программе «Праймер Экспресс Версия 3 . 0» и сайта «Primer-BLAST» .
Ген ß-актина, «ген домашнего хозяйства», использовали в качестве референсного гена для выравнивания вносимых в разные пробы количеств транскриптов Температуру отжига праймеров и количество циклов, при котором происходила амплификация каждого из фрагментов, подбирали экспериментально Для анализа экспрессии гена ТРСазы использовались затравки, расположенные на краях соседних экзонов, ограничивающих интрон c целью устранения ПЦР на примесях геномной ДНК в полученных препаратах суммарной РНК. Сконструированный TaqMan флуоресцентный зонд был комплементарен внутренней области амплифицируемого участка гена В работе использовались следующие праймеры для ß-актина и ТРСазы:
A) В случае применения системы с интеркалиру-ющим красителем Sybr-green:
- прямая = 5'- CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3'
- обратная = 5'-CGGCCACATTGTGAACTTTG-3'
Б) В случае применения TaqMan зонда:
прямая - 5'-AAG CAG AAA GCA ATT GAA GA-3';
обратная - 5'-GAA ACC ATA GCT GTC TCC ATC-3' .
Зонд - (5'R6G) CCT GAC ACA ACG CGG ACA GAA
CTG A(3'BHQ2).
B) для кДНК копии мРНК ТРСазы:
- прямая = 5'-GCATGTAGGTCACCTCATTCCATTT-3'
- обратная = 5'-GACCAAGGGCACGTTAAATACATC-3'.
- зонд (5'R6G) CTGGAGCCACTTTGTG (3'BHQ2) .
При использовании системы с интеркалирующим красителем Sybr-green, стандарты получали путем амплификации с теми же затравками контрольных образцов в ПЦР реакции в условиях, оптимизированных для RT-PCR . Измерения осуществляли относительно стандартных значений, проводя 4-кратные последовательные разбавления для получения стандартной кривой из 8 точек .
Электрофорез продуктов специфической амплификации кДНК копии мРНК гена ТРСазы. Электрофорез проводили в 7% полиакриламидном геле в трис-боратном буфере рН 8,3 (89 мМ трис, 8,9 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА) . В карманы геля наносили аликвоты из реакционной смеси в объеме 7—10 мкл . Электрофорез проводили при напряжении 10 в/см в течение 1,5—2,0 ч . Гель окрашивали раствором бромистого этидия 1 мкг/мл в течение 15 мин Изображения гель-электрофореза были сфотографированы с использованием комплекта оборудования, включающего трансиллюминатор УВТ-1, цифровой камеры Kodak DC120, систему для наблюдения гелей и регистрации гелей «ViTran Photo» и систему обработки изображений «ViTran Photo» . Цифровые копии гелей анализировали с использованием пакета программ EDAS 120 (Electrophoresis Documentation and Analysis System 120) фирмы Eastman Kodak Программа Kodak Digital Science 1D версии 2 0 3 использовалась для измерения интенсивности полос . Количественная оценка содержания специфических видов кДНК (и соответствующего содержания видов мРНК ТРСазы) в нанесенных на гель образцах проведена по интенсивности полос ДНК маркера молекулярной массы, точно известной концентрации, соответствующей подвижности в геле .
Относительный количественный метод оценки уровня экспрессии гена ТРСазы. Метод 2. Метод основывается на использовании «референсного» гена, чья экспрессия постоянна в испытуемых пробах. Основным преимуществом используемого в данном примере метода является возможность нивелировать ошибки в нанесении реагентов в реакционные смеси (в основном РНК/ДНК матриц) Для определения относительной экспрессии изучаемого гена в пробе с использованием гена нормализатора, требуется установить уровень экспрессии обоих генов с использованием РТ-ПЦР . Например, следует установить четыре значения CT как указано ниже . CT значения необходимые для относительной количественной оценки с использованием референсного гена как нормализатора
Тест Калибраторный (кал)
Исследуемый ген СТ(иссл, тест) СТ(иссл, кал)
Референсный ген C C Т(реф, тест) Т(реф, кал)
Затем мы воспользовались широко известным методом 2-ддСт .
2-ддСт метод . Метод предполагает, что оба гена (опытный и референсный) имеют эффективность амплификации равной около 100% [17]. Затем проводят следующие манипуляции:
1. Нормализуют значения Ст исследуемого гена со значениями референсного (геО гена, как для изучаемой пробы так и для калибровочной:
ЛС Т(тест) СТ(иссл, тест) СТ(реф, тест)'
ЛС = с — с
Т(кал) Т(иссл, кал) Т(реф, кал)'
2 . Нормализуют ЛСТ исследуемого образца с ЛСТ калибратора:
ЛЛСТ = ЛС т. , - ЛС т. , .
Т Т(тест) Т(кал)
3 . Оценивают уровень экспрессии по формуле:
2-ддСт = Нормализованная степень экспрессии .
Результатом является соотношения исследуемого гена в пробе со значением в образце калибратора, нормализованного по экспрессии референсного гена . Процесс нормализации экспрессии исследуемого гена с референсным геном компенсирует любые различия в количествах, взятых на анализ образцов биологического материала
Результаты и обсуждение
В пилотных исследованиях нами было установлено, что определение уровня экспрессии мРНК ТРСазы может применяться как для контроля за физическим состоянием спортсмена на различных этапах тренировочного процесса, так и для контроля достижения опасного состояния перетренированности с целью корректировки процесса и повышения эффективности адаптационных процессов и улучшения физической формы спортсмена . Проведенные скрининговые исследования популяций спортсменов показали, что уровень экспрессии мРНК гена ТРСа-зы является высокоэффективным критерием общего состояния различных систем органов спортсмена и позволяет выработать оптимальную тактику тренировок В данной работе нами разработан комплекс методик выявления состояния утомления организма спортсмена по определению уровня активности биомаркерного гена, кодирующего ТРСазу, по синтезируемой с гена специфической мРНК . Предварительную оценку специфичности и уровня экспрессии мРНК ТРСазы проводили методом 1. Этот метод заключается в сканировании гелей с картиной разделения продуктов специфической ПЦР кДНК на содержание копий мРНК ТРСазы, параллельно с маркерами количеств ДНК для построения калибровочной кривой Окончательное измерение уровня экспрессии гена ТРСазы как генетического маркера тренированности в отобранных Методом 1 образцах, проводили уже методами ПЦР в реальном времени RТ-PCR (метод 2) по построенной калибровочной кривой (метод 1) с использованием методики относительной количественной оценки мРНК с использованием референсного гена (метод 2) Таким образом, существует два подхода к количественной оценке экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени: относительная и абсолютная количественная оценка экспрессии генов Относительный метод количественного сравнения экспрессии генов основывается на сравнении уровня экспрессии гена в одном образце с экспрессией другого референсного гена, используемого для нормировки данных . Абсолютная количественная оценка основана на применении стандартной калибровочной кривой, которая получается из образцов матриц с точно известной концентрацией Концентрация любого неизвестного
препарата ДНК или РНК может быть определена путем простого сравнения значений его ПЦР сигнала с данными стандартной кривой [17]. Приведенные методы и методики (см . раздел Материалы и методы) точны, воспроизводимы и взаимодополняемы и отражают существующие в настоящее время стратегии количественной оценки образовавшихся специфических видов кДНК, и позволяют количественно определить число копий мРНК ТРСазы в препаратах РНК и кДНК . Состояние дистресса «перетренированности» [18] диагностируют в случае значительного (более, чем в 1,45 раза) увеличения уровня экспрессии ТРСазы в опытном образце по сравнению с контрольным
Нами проведен скрининг отобранной популяции спортсменов высшего звена с использованием адаптированного и оптимизированного метода количественной оценки специфических видов кДНК (видов мРНК ТРСазы) методом гель-электрофореза Проведенная экспериментальная проверка преимуществ и недостатков данного подхода в «иерархии» разработанных и реализованных в ходе исследований методик позволяет позиционировать метод 1 в качестве предварительной оценки, позволяющей вычленить группу испытуемых с высоким риском «перетренированности» . При использовании метода 1 полученные образцы кДНК подвергали реакции амплификации со специфическими для кДНК ТРСазы затравками . Количественная оценка содержания специфических видов кДНК (и соответствующего содержания видов мРНК ТРСазы) в нанесенных на гель образцах рассчитывали по интенсивности полос ДНК маркера молекулярной массы, точно известной концентрации, соответствующей подвижности в геле
На рис 1 приведены результаты исследований относительной экспрессии гена ТРСазы спортсменов мужской сборной России по водному поло на основе информированного согласия . Значения относительной экспрессии оценивались путем денситоме-трического анализа картины электрофоретического разделения продуктов ПЦР амплификации образцов суммарных препаратов РНК, после их перевода в кДНК и амплификации с применением специфических затравок. В качестве контрольных значений, взятых за 100%, служили образцы биологического
материала до начала тренировок Приведенные данные представляют собой усредненные данные двух параллельных серий экспериментов В следующих примерах отдельные образцы данной панели исследовали с помощью альтернативных подходов, включая РТ-ПЦР, и абсолютными и относительными методиками оценки количества специфических мРНК гена ТРСазы в биологических образцах. Из данных рис . 1 следует, что в образцах № 2, 9, 12, 13 идет интенсификация экспрессии, существенно превышающая базовый уровень . Это свидетельствует об активизации восстановительных процессов, наступающих в ответ на чрезмерные нагрузки и требующих применения индивидуальных восстановительных программ . Преимуществом метода является его относительная простота, менее строгие требования к специфичности ПЦР затравок, относительная дешевизна . Недостатком является невысокая точность методики, сложность осуществления массовых анализов в связи с процедурами электрофореза и сканирования гелей. Однако, данный метод позволяет вычленить «группу риска» спортсменов для дальнейшего более точного анализа
На рис 2 приведен результат конечной серии экспериментов (с использованием параллельно взятых биологических образцов в экспериментах, описанных на рис . 1) на основе абсолютного количественного подхода к определению числа экспрессирующихся мРНК ТРСазы, путем построения калибровочной кривой
Данные рис 3 представляют собой сравнительный анализ образцов, полученных до тренировок и после них . Данные для сравнения представляли собой соотношения между изучаемым геном — мишенью ТРСазы и мРНК р-актина . Рисунок свидетельствует, что при сравнении экспрессии до и после интенсивных тренировок, в ряде случаев достоверно повышается экспрессия мРНК ТРСазы — в 1,2—1,6 раза . Также как и при использовании альтернативных методических подходов, в образцах № 2, 9, 12, 13 идет интенсификация экспрессии, существенно превышающая базовый уровень Это свидетельствует об активизации восстановительных процессов, наступающих в ответ на чрезмерные нагрузки и требующие применения индивидуальных восстановительных программ .
180
160
ё 140 о
| 120
О ^О
5 100
л
80 60
40
20
Рис. 1.
Относительная экспрессия гена ТРСазы у спортсменов с использованием протокола количественной оценки методом гель-электрофореза: 1—14 — образцы
2 3 4
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
0
1
Рис. 2.
Относительная экспрессия гена ТРСазы спортсменов, полученная методикой абсолютной количественной оценки экспрессии мРНК ТРСазы с использованием РТ-ПЦР, красителя «Сибр-грин» и построения калибровочной кривой
Рис. 3.
Относительная экспрессия гена ТРСазы спортсменов с использованием методики относительной количественной оценки экспрессии мРНК ТРСазы с использованием РТ-ПЦР, методики 2-ллст и «референсного» гена р-актина
Таким образом, нами разработан и применен оригинальный комплекс методик для анализа уровня перетренированности в спорте . Он включает этап определения у спортсмена состояния утомления и синдрома дистресса перетренированности по повышенной экспрессии гена триптофанил-тРНК-синтетазы (ТРСазы) . На последнем этапе осуществляется наиболее точное определение состояния перетренированности в соответствии с независимым признаком, где уровень специфической экспрессии мРНК ТРСазы, превышающий показатель в 1,45 раза, оценивали методом относительной количественной оценки мРНК по данным РТ-ПЦР анализа с использованием методики определения значений 2-ллст и на применении «референсного» гена р-актина .
Актуальность данного исследования по разработке эффективного генетического маркера уровня тре-
нированности и перетренированности в спорте, связана с практическим отсутствием в настоящее время надежного метода диагностики состояния перетренированности у спортсменов [18]. Важность результатов работы определяется также большим потенциалом совершенствования методики, как с точки зрения точной диагностики состояния перетренированности, так и возможности коррекции состояния организма и здоровьесбережения, как в случае здоровых индивидов, так и возможных патологий [19, 20]. Существенным преимуществом использования экспрессии гена ТРСазы в качестве генетического маркера дистресса перетренированности, является не только доказанная ключевая роль продукта гена в важнейших процессах каскада реакций противовоспалительного ответа тканей, но и ролью фермента ТРСазы в реакциях контроля ангиогенеза и онкосу-прессии [21].
Благодарности
Работа выполнена за счет средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности Минобрнауки РФ-КФУ 2014-2016 гг.: № 6.1139.2014/К, проект 14-80 и общая часть госзадания № 3796. Р.И.Ж. — реципиент Фонда им. А. фон Гумбольдта, Бонн, Германия.
Работа финансировалась из средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности, а также поддержана грантом 2013 года Института перспективных гуманитарных исследований и технологий МГГУ имени М.А. Шолохова (М.К.Н. и Р.И.Ж.).
ЛИТЕРАТУРА:
1. Paracosta E ., Gleeson M . Effects of intensity of training and taper on immune function . Rev . Bras . Educ . Fis . Esporte [Sao Paulo) 2013; 27(1): 159-76 .
2 . Ahmetov I . I ., Fedotovskaya O . N . Current progress in sports genomics . Advances in Clinical Chemistry 2015; http://dx . doi . org/10 . 1016/bs . acc . 2015 . 03 . 003 .
3 . Kupriyanov R .V ., Zhdanov R . I . Eustress concept: problems and outlooks . World J . Med . Sci . 2014; 11(2): 179-85 .
4 . Куприянов Р . В ., Жданов Р . И . Стресс и аллостаз: проблемы, перспективы и взаимосвязь . Журн . высшей нервн . деятел . им . И . П . Павлова . 2014; 64(1): 21-31.
5 Finsterer J Biomarkers of peripheral muscle fatigue during exercise . BMC Musculoskeletal Disorders 2012; 13: 218-31.
6 Ceci R , Valls M R , Duranti G et al Oxidative stress responses to a graded maximal exercise test in older adults following explosivetype resistance training . Redox Biol . 2014; 2: 65-72 .
7 . Davydov D . M ., Zhdanov R . I . , Dvoenosov V . G . et al . Resilence to orthostasis and haemorrhage: A pilot study of common genetic and conditioning factors . Sci . Rep . Nature PG 2015;5: 10703 .
8 . Nurbekov M . K ., Kisselev L . L., Favorova O . O . et al . Bovine tryptophanyl-tRNA synthetase — a zinc metalloenzyme . Eur. J . Biochem . 1981; 120 (3): 511-17 .
9 . Favorova O . O ., Zargarova T . A. , Rukosuyev V . S . et al . Molecular and cellular studies of tryptophanyl-tRNA synthetases using monoclonal antibodies Remarkable variations in the content of tryptophanyl-tRNA synthetase in the pancreas of different mammals Eur J Biochem , 1989; 184: 583-88 .
10 . Nurbekov M . K ., Rasulov M . M ., Voronkov M . G . et . al . The complex of zinc bis-(2-methylphenoxyacetate) with tris-2(hydroxyethyl) amine as an activator of synthesis of total tryptophanyl-tRNA synthetase . Doklady . Biochemistry and biophysics . 2012; 444: 147-8 .
11. Guo M ., Schimmel P . , Xiang-Lei Yang X-L . Functional expansion of human tRNA synthetases achieved by structural inventions . FEBS Lett . 2010; 584 (2): 434-42 .
12 . Merkulova T . , Kovaleva G ., Kisselev L . P1,p3-bis(5'-adenosyl) triphosphate (Ap3A) as a substrate and a product of mammalian tryptophanyl-tRNA synthetase . FEBS Lett . 1994; 350: 287-90 .
13 . Нурбеков М . К . , Елов А .А ., Жданов Р . И . Регулируемый эндогенный протеолиз как важный фактор переключения триптофанил-т-РНК-синтетазы от канонической аминоацилирующей активности к неканоническим регулируемым функциям . Гены и клетки 2014; IX: 223-9 .
14 Ghatak G , Muthukumaran R B , Nachimuthu S K A Simple method of genomic DNA extraction from human samples for PCR-RFLP analysis . J . Biomol . Tech . 2013; 24(4): 224-31.
15 . Протокол выделения препаратов РНК и ДНК с помощью набора наночастиц фирмы Силекс
http://www . sileks . com/ru/download/DNA_Isolation_with_MP_ from_Swabs . pdf .
16 . Протокол выделения РНК с помощью набора «Yellow Solve» фирмы Силекс: http://sileks . com/ru/production . php?folder=86 .
17 . Протокол ПЦР определения: Hallmarks of an Optimized qPCR Assay
18 Gleeson M Biochemical and immunological markers of overtraining . J . Sports Sci . Med . 2002; 2: 31-41.
19 . Park S . G ., Schimmel P ., Kim S . Aminoacyl tRNA synthetases and their connections to disease . PNAS USA 2008; 105(32): 11043-9 .
20 . Sajish M . , Schimmel P . A human tRNA synthetase is a potent PARP1-activating effector target for resveratrol . Natiure 2015; 519: 370-3
21. Yao P ., Fox P . L . Aminoacyl-tRNA synthetases in medicine and disease . EMBO Mol Med . 2013; 5(3): 332-43 .
Поступила: 09.09.2015
