CC BY
147
„ к М.К. Нурбеков, А.Б. Ильин
з г
I | Молекулярно-генетические маркеры
! § утомления биологических систем
I (на примере физических нагрузок
I человека)
о и
В статье представлено исследование, задачами которого являлась оценка мо-лекулярно-генетических маркеров утомления биологических систем, в частности, исследовались 14 спортсменов высокой квалификации, у которых имелись результаты углубленного медицинского обследования в Федеральном медико-биологическом агентстве. В результате проведенного цикла исследований установлено достоверное увеличение экспрессии мРНК ТРСазы, превышающее уровень, принятый за базовый, что свидетельствует об активизации восстановительных процессов, наступающих в ответ на физические нагрузки и требующих их коррекции, а также применения индивидуальных восстановительных программ. Это подтверждает важность применения данного показателя в качестве биомаркера состояний спортсмена, в частности, состояния переутомления.
Ключевые слова: состояния утомления и переутомления в спорте, природный иммунитет, противовоспалительные реакции, триптофанил-тРНК-синтета-за, экспрессия гена, биомаркеры состояния перетренированности.
Каждый физиологический процесс требует определенных затрат энергии, любое измерение физиологического состояния связано с энергетическим обменом.
Биоэнергетические показатели живых систем позволяют выявлять последствия стрессового воздействия среды до наступления необратимых изменений. Количество энергии, необходимое организму в единицу времени для обеспечения всех физиологических процессов, характеризует интенсивность энергетического обмена. На реализацию одного и того же физиологического процесса в неблагоприятных условиях организму требуется больше энергии, чем в оптимальных, из-за необходимости компенсации неблагоприятных воздействий среды [2].
В биологической системе, представляющей собой организм человек, таким стрессовым фактором является утомление после физических нагрузок. В качестве теоретические оснований исследования были приняты следующие положения.
1. В результате выполнения физических нагрузок у человека наступает обратимое нарушение физиологических и биохимических реакций организма - утомление, компенсирующееся во время полноценного отдыха. Утомление - естественный физиологический процесс, нормальное сос-
тояние любой биологической системы, в том числе организма человека. „ ^
2. После компенсации утомления в организме наступает фаза супер- б о компенсации, в которой организм способен выполнить больший объем ра- | -с боты в ту же единицу времени, чем раньше. На данном эффекте суперком- § " пенсации базируется теория спортивной тренировки. Суперкомпенсация £ является ответной реакцией организма на утомление. Повышение работо- | способности невозможно без предшествующего нормального физиологи- | ческого утомления. и
3. Планомерному повышению физической работоспособности препятствуют чрезмерные нагрузки и недостаточное время и комплекс мер по восстановлению организма. Суперкомпенсация в этом случае не наступает и работоспособность не повышается. Более того, наступает сильное истощение резервов организма, и он не может самостоятельно восстановиться, что требует медицинского вмешательства.
Для достижения эффекта суммирования долговременной адаптации необходимо осуществлять дозирование физических нагрузок с целью недопущения перетренированности и особенно - переутомления, приводящих к срыву адаптации к физическим нагрузкам (на языке тренеров это называется «попасть в нагрузку»), что в тяжелых случаях может приводить к различным патологиям [1].
Срыв адаптации связан с существенными нарушениями обменных процессов, в первую очередь, затрагивающих иммунную систему спортсмена, в частности, выражающихся в снижении уровня В- и Т-лимфоцитов. Причем наиболее ярко этот эффект проявляется именно у хорошо тренированных спортсменов. Механизм подобного угнетения иммунной системы заключается в нарушении баланса про- и антивоспалительных цитокинов и подъеме уровня гормонов стресса. Интенсивные тренировки приводят к временному увеличению апоптоза лимфоцитов. Другие клетки иммунной системы, нейтрофилы и моноциты, обеспечивая функцию природного иммунитета, действуют «на переднем крае обороны» и удаляют инфекционные агенты, что очень важно в свете общего снижения функциональности иммунной системы и повышения риска респираторных заболеваний именно в случае частых интенсивных тренировок спортсменов.
Также важным физиологическим следствием интенсивных тренировок является возникновение микротравм мышечных волокон, что приводит к «высвобождению» содержимого мышечных волокон, в частности, фермента креатинкиназа во внеклеточные жидкости, кровь. В ответ в организме наблюдается сложный комплекс реакций, который при патологическом развитии приводит к хроническому воспалительному процессу с резким падением уровня тренированности.
Одним из важных признаков адаптивной реакции к резкому снижению I I функциональности клеток иммунной системы и возникновению так на-| о зываемого «окна иммуносупрессии» является резкая активация каскада ? 5 противовоспалительных реакций, связанных с увеличением уровня сиг-ii s нальных противовоспалительных цитокинов (интерферона гамма) с по-i следующей активацией ключевого фермента биосинтеза белка - трип-S тофанил-тРНК-синтетазы. Важным следствием этого является «отбор» £ из межклеточной среды триптофана - незаменимой аминокислоты для жизнедеятельности патогенных бактерий. Это существенно тормозит их размножение, особенно в ослабленных органах и тканях, подверженных инфекциям в силу специфики вида соревновательной деятельности.
Задачами исследования являлась оценка молекулярно-генетических маркеров утомления биологических систем. Исследовались спортсмены разного уровня. В отдельную группу выделены спортсмены высокой квалификации в количестве 14 человек, у которых имеются результаты углубленного медицинского обследования в Федеральном медико-биологическом агентстве [3].
Материалы и методы
Применялся комплекс методик выявления уровня активности гена, кодирующего фермент по синтезируемой с гена специфической мРНК. Последовательность операций включала отбор соскобов с ротовой полости, выделение препаратов РНК и ДНК с помощью наборов с наночасти-цами фирмы «Силекс». РНК переводили в форму комплементарной ДНК с помощью обратной РНК-зависимой ДНК полимеразы (M-MLV), c применением вырожденных гексануклеотидных затравок.
Образованную специфическую кДНК ТРСазы выявляли с помощью специфической ПЦР и специально подобранными затравками, которые размножали именно нужные виды кДНК, а не возможные примеси геномной ядерной ДНК. Интенсивность полос ПЦР определяли сканированием гелей, прокрашенных бромистым этидием или красителем «Сибр-грин».
Сбор и предобработка образцов биологического материала. В лаборатории биоэкомониторинга МГГУ им. М.А. Шолохова отлажена методика сбора материала неинвазивным методом, а последующие этапы анализа разработаны в соответствии со спецификой собираемых образцов. Основным биологическим материалом является смыв или соскоб с ротовой полости. Образцы при этом сразу замораживаются (для выделения ДНК) или, после центрифугирования, осадки клеток и образцы соскобов помещаются в раствор «Ever fresh» для РНК и хранятся несколько суток до процедуры выделения РНК.
Выделение ДНК и РНК. Для выделения ДНК осадок клеток суспенди- „ s ровали в 400 мкл буфера состава 10 мМ трис-HCl, рН 8,0; 1 мМ ЭДТА; 1% | Л додецилсульфат натрия и инкубировали с протеиназой К 10 мкг/мл в тече- | -с ние 2 ч. при 55 оС. Затем смесь обрабатывали последовательно фенолом, § " хлороформом. ДНК из раствора осаждали спиртом и растворяли в буфере £ ТЕ (10 мМ трис-HCl, рН 8,0; 1 мМ ЭДТА) и хранили замороженным при £ температуре - 20 оС. |
Экспресс-выделение суммарных препаратов РНК. Для выделения сум- и марных препаратов РНК из осадков клеток или соскобов использовали набор фирмы «Силекс-М» «Yellow Solve». Процедуру выделения осуществляли по протоколу фирмы с учетом специфики эксперимента. Препарат РНК хранили в спирте при - 20 °С.
Синтез на матрице РНК кДНК. Для получения четких результатов полученную суммарную РНК сразу переводили методом «обратного копирования» с помощью вирусных обратных транскриптаз в соответствующие ДНК-копии (кДНК). Для синтеза кДНК из полученных препаратов суммарной РНК использовались реактивы фирмы «Силекс-М» и прилагающиеся протоколы. Полученную кДНК использовали для проведения ПЦР сразу или хранили при температуре - 20 °С в течение нескольких суток.
Количественный анализ специфической мРНК триптофанил-тРНК-синтетазы. Экспрессия гена ТРСазы количественно оценивалась по уровню специфической мРНК. При этом критерием уровня мРНК служил количественный анализ суммарной кДНК, определенный методом ПЦР с последующим анализом полученных электрофореграмм денситоме-трически по яркости свечения продуктов. При проведении реакции ПЦР использовались наборы реактивов фирмы «Силекс-М», специфические затравки синтезировались на аппарате фирмы «Синтол». Затравки конструировали по программе, рекомендуемой фирмой-производителем [4].
Для кДНК копии мРНК ТРСазы:
• прямая = TRS-F-1 (5'-AGCTCAACTGCCCAGCGTGACC-3');
• прямая = TRS-F-2 (5'- GGAGTAGGCAGTTTTGCTC-3');
• обратная = TRS-R-1 (5'-CAGTCAGCCTTGTAATCCTC-3');
• обратная = TRS-R-2 (5'-GAGGCTGAGATGCCAAAAG-3').
В сериях все реакции двухкратно повторялись. Стандартные образцы для сравнения получены амплификацией контрольных образцов биологического материала спортсменов до начала интенсивных тренировок.
Значения относительной экспрессии оценивались путем денситометри-ческого анализа продуктов ПЦР-анализа образцов РНК после их перевода в кДНК и амплификации с применением специфических затравок.
34
1
В качестве контрольных значений, взятых за 100%, служили образцы биологического материала до начала тренировок.
В образцах № 1, 3, 5, 12, 13 (рис. 1) идет интенсификации экспрессии, превышающая уровень, принятый за базовый, что свидетельствует об активизации восстановительных процессов, наступающих в ответ на физические нагрузки и требующие их коррекции, а также применения индивидуальных восстановительных программ.
о
Рч
н
¡5
о
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Анализируемые образцы
80
60
40
20
0
1
2
3
4
Рис. 1. Относительная экспрессия гена ТРСазы изученной группы
Выводы и заключения
Обработка результатов исследования продолжается, в настоящее время представляется возможным сделать некоторые предварительные выводы и заключения.
На основании проведенного исследования представляется возможным заключить, что относительная экспрессия гена ТРСазы более 130% свидетельствует о критических стадиях утомления и состоянии перетренированности.
Результаты исследования сопоставляются с результатами медосмотров и подтверждаются клиническими проявлениями, среди которых: нервно-психические сдвиги, ухудшение спортивных результатов, нарушение деятельности сердечно-сосудистой и нервной систем, апатия, отсутствие интереса к результату участия в соревнованиях, нарушения сна, расстройство пищеварения, половой функции, тремор пальцев рук.
Библиографический список | |
и о
1. Алексеев А.А., Ильин А.Б., Нурбеков М.К. Генотипический анализ как фак- ¥ § тор контроля тренировочных нагрузок // Актуальные проблемы биологии, ¡5 | нанотехнологий и медицины: Материалы 4-й Международной научно-пра- | ктической конференции: Ростов-на-Дону, 22-25 сентября 2011 г. Ростов-н/Д., £ 2011. С. 42-43. |
2. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биоте- | стирование: Учебное пособие для студентов высших учебных заведений / 5 О.П. Мелехова и др. М., 2007.
3. Биоэкомониторинг в спорте высших достижений / А.Б. Ильин и др. // Вестник Международной Академии наук (Русская секция). Спец. вып. Материалы международной конференции «Экология, технологии, культура в современном мире. Проблемы vs. решения». 2010. С. 161-164.
4. Нурбеков М.К., Ильин А.Б., Минькова Н.О. Генный скрининг в исследовании эндоэкологии человека // Вестник МГГУ им. М.А. Шолохова. Сер. «Социально-экологические технологии». 2011. № 1. С. 127-129.
