CC BY
16
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Генетическая гетерогенность альфа-1 -антитрипсина
А. Б. Исмайлова
Бакинский Государственный Университет, г. Баку
Альфа-1-антитрипсин (а1А)- низкомолекулярный протеазный ингибитор синтезируется клетками печени и разрушает эластазу нейтро-филов альвеолярных клеток легких. Выявлены нормальные варианты, не приводящие к клиничеким проявленям заболевания. Установлены их фено-типические частоты встречаемости: РМ1-68-76%, РМ2-14-20% и РМ3-10-12%. В настоящее время идентифицировано свыше 90 мутантных аллелей а1А. Известно, что в основе легочных и печеночных заболеваний в большинстве случаев (95%) имеет место два мутантных аллеля, приводящих к дефициту а1А: PiZ и PiS аллели. Недостаточность фермента имеет аутосомно-рецессив-ный тип наследования и встречается с частотой 1:1600-1:1800 [1, 2, 5].
Учитывая вышеизложенное, мы решили изучить встречаемость мутантных и нормальных вариантов а1А у сельского населения Сиязаньс-кого и Казахского районов Республики, а также у лиц из этих районов с заболеваниями печени и легких.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Капиллярная кровь для исследований собрана в экспедиционных условиях в ЦРБ у больных с заболеваниями печени и легких, а также в селах Еникенд, Тугай, Бешдам и Гыл-Гыл чай Сиязаньского и в селах Салахлы, Шы1хлы1, Аскипара и Асланбейли Казахского районов Азербайджанской Республики в 2004-2005 гг. По двум районам обследовано 857 человек (521 - мужчин и 336 - женщин).
Также исследована сыворотка крови от 50-ти доноров. Аля 9-ти обнаруженных нами пробандов с аномальными аллелями дополнительно проведен анализ 97 членов семей. Забор капиллярной или же венозной крови производили в микропробирки "эп-пендорф" без антикоагулянта. Сыворотку получали путем центрифугирования крови в центрифуге "Эппендорф" (при 12000 об/мин) в течение 10-15 секунд. Использовали ПААГ следующего состава: 2,7 мл акриламид/бисакриламид, 0,5 мл HCL/трис буфер (3,03 г трисрастворяли в 80 мл дистиллированной воды и с помощью соляной кислоты доводили рН до 8,4; количество буфера доводили до 100 мл с помощью дистиллированной воды), 1 мл глице-рол, 100 мкл амфолина рН 4-6, 100 мкл амфолина рН 3,5-9,5, 10 мкл ТЕМЕД, 20 мкл аммониум персульфат (400 мг аммониум персульфат + 1 мл дистиллированной воды). Рабочий раствор в вышеперечисленном порядке добавляли в химический стакан, перемешивали, а затем, для полимеризации раствор наливали между двумя стеклами размером 110x260 мм. Полимеризация происходила в течение 2-3-х часов. После образования геля одно из стекол удаляли, и гель клали на охлаждаемую поверхность аппарата "Multiphore" фирмы Амершам (США). Систему охлаждали до 10°С с использованием термостата Multi Temp III. Время анализа длится 1,5-2 часа. Напряжение 1500 вольт получали с помощью источника питания - Electrophoresis Power Supply - EPS 3501 XL. Для фиксации сывороточных белков после ИЭФ ПААГ помещали в 40%-й раствор этилового спирта на 10-15 минут, затем для удаления амфолитов гель несколько раз промывали 7%-
Таблица 1. Фенотипические и генные частоты нормальных Pi аллелей альфа 1 -антитрипсина в сыворотке крови доноров
Фенотипы Число Генотипы Число Фенотипическая частота (в %) Генная частота (в долях ед.)
М1М1 8 16 М1 38
М2М2 6 12 М2 38
МЗМЗ 4 8 МЗ 24
М1М2 16 32
М2МЗ 10 20
М1МЗ 6 12
М1М2 16 (32%)
М2МЗ 10 (20%)
М1МЗ 6 (12%)
Таблица 2. Фенотипические и генные частоты PiZ и PiS аллелей среди населения Сиязаньского и
Казахского районов Республики
Контингент Фенотипическая частота Частота гена
гомозигота гетерозигота компаунд
PiZ/PiZ PiS/PiS PiZM PiSM PiZ/PiS PiZ PiS
Больные 1,13 0,38 0,76 0,76 0,38 0,0169 0,0094
Здоровые 0.51 0,34 1,35 1,01 - 0,0118 0,0084
ым водным раствором уксусной кислоты. После этого сывороточные белки окрашивали 2%-м раствором Кумасси G в течение 10 минут и остаток красителя удаляли 7%-ным раствором уксусной кислоты.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. В сыворотке донорской крови наблюдали все три фенотипа всех трех нормальных Pi аллелей а1А: М1, М2 и М3, в гомозиготном: М1М1, М2М2 и М3М3 и в двойном гетерозиготном - компаундном состояниях: М1М2, М1М3 и М2М3.
В таблице 1 представлены полученные результаты анализов по определению нормальных фенотипов Pi аллелей альфа 1-антитрипсина в образцах сыворотки крови 50-ти доноров аналитическим методом изоэлектрофокусирования.
Как видно из таблицы 1, в сыворотке донорской крови наблюдали все три фенотипа всех трех нормальных Pi аллелей альфа-1-антитрипси-на: М1, М2 и М3, в гомозиготном (М1М1, М2М2 и М3М3) и в компаундном состояниях (М1М2, М1М3 и М2М3).
Частота М1 и М2 аллелей была одинаковой - 38%, тогда как для гена М3 составила - 24%. Следовательно, гомозиготные фенотипы, связанные с этими аллелями, преобладали: М1М1 - 16% и М2М2 - 12%. Среди компаундов преобладали фенотипы: М1М2 - 32%, М2М3 - 20%. Частота генотипов - М1М2, М2М3 и М1М3 составили - 32%, 20% и 12%, соответственно.
В 9-ти случаях из 265 у больных идентифицирован аномальный фенотип; в шести случаях аномальный PiZ (3 гомозиготы, 2 гетерозиготы и 1 компаунд) с генотипами: PiZ/PiZ, PiZ/PiМ1 и PiZ/PiS, и в трех случаях аномальный PiS аллель с генотипам: PiS/PiS (гомозигота), PiS/PiМ2 и PiS/PiМ1 (гетерозигота). Для пробандов с аномальными аллелями PiZ и PiS составлены большие родословные. При этом, для 9-ти пробандов дополнительно проведен анализ 97 членов семей и в 11-ти случаях выявлено гетерозиготное носи-тельство PiZ, а в 6-ти случаях гетерозиготное но-сительство PiS аллелей.
При популяционном обследовании 597 сельчан, в том числе, школьников средних сельских школ, у 13-ти обнаружены мутантные PiZ (8 чело-
век) и PiS (5 человек) аллели. фенотипические и генные частоты PiZ и PiS аллелей среди больных из ЦРБ и здорового сельского населения представлены в таблице 2.
Как видно из таблицы 2, частота аномальных генов PiZ и PiS среди больных и здоровых лиц составила: 0,0169, 0,0094 и 0,0118, 0,0084, соответственно. При подсчете фенотипических и генных частот аномальных генов PiZ и PiS среди больных мы не учитывали выявленные случаи аномальных генов PiZ и PiS среди родственников больных.
Таким образом, используя метод аналитического ИЭф проведено фенотипирование нормальных и мутантных аллелей а1А в Сиязаньском и Казахском районах Азербайджанской Республики с вычислением их фенотипических и генных частот.
ЛИТЕРАТУРА
1. Elzouki A.N et al. Severe alphal-antitrypsin deficiency with mem-branoproliferative glomerulonephritis syndrome, reversible after orthotopic liver transplantation. - J Hepatol., 1997, v.26 (6), p.1403-7; 2. Janciauskiene S.et al. Detection of calculating and endothelial cell polymers of Z and wild type alpha 1-antitrypsin by a monoclonal antibody. - J.Bio Chem., 2002, v.277 (29), p.26540-6; 3. McKusick V.A. Mendelian Inheritance in Man. - Tenth Edition, v.1,2; The Johns Hopkins University Press. Baltimore and London, 2002, p.2309; 4. Tebbutt S.J. Technology evaluation transgenic alpha-l-antitripsin (AAT), PPL therapeutics. - Curr. Opin. Mol. Ther., 2000, v.2, p.199-204; 5. Tyagi S.C. Reversible inhibition of neutrophil elastase by thiol-modifed alpha-l-antitrypsin deficiency. - J. Biol. Chem., 1991, v.266, p.5279-5285.
SUMMARY
Genetic heterogeneity of alpha-1-antitrypsin AIsmayilova
Genetic heterogeneity, diagnostic methods for alpha-1-antitrypsin and obtained personal results of populational researches, performed in Siyazan and Kazach area of Azerbaijan Republic, are being described. Using method of isoelectrofocusing of blood serum proteins from practically healthy persons and sick children and their parents, the phe-notyping of normal PiM alleles, abnormal PiZ and PiS allels has been carried out as well as identification of their phenotypic and gene frequencies.
Поступила 18.01.2006
