CC BY
151
ЛАБОРАТОРНАЯ И ИНСТРУМЕНТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИК
Laboratory and instrumental diagnostics
КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ НАСЛЕДСТВЕННОГО И ПРИОБРЕТЕННОГО ДЕФИЦИТА АЛ ЬФА-1 -АНТИТРИПСИНА У БОЛЬНЫХ ЦИРРОЗОМ ПЕЧЕНИ И БОЛЕЗНЬЮ ВИЛЬСОНА — КОНОВАЛОВА
Шапошникова Н. А., Шулятьев И. С., Варванина Г. Г., Дроздов В. Н.
ГУ Центральный научно-исследовательский институт гастроэнтерологии ДЗ г. Москвы
Шапошникова Наталья Александровна Москва, шоссе Энтузиастов, д. 86 Тел.: 8 (495) 304 3025 E-mail: natalka1212@rambler.ru
Альфа-1-антитрипсин (А1А), естественный ингибитор протеаз в плазме крови, впервые был открыт в 1963 году. А1А играет важную роль в активации нейтрофильной эластазы и других протеаз, обеспечивая баланс протеаз/антипротеаз. Он связывает такие протеазы, как эластаза, трипсин, хемотрипсин, тромбин, бактериальные протеазы. Самый важный физиологический эффект — это ингибирование лейкоцитарной эластазы [8].
Альфа-1-антитрипсин (А1А) повышается в острую фазу воспаления, следовательно, его концентрация может повышаться при гепатитах (острых и / или хронических), циррозах печени, панкреатитах и т. д. Уровень альфа-1-антитрипсина может снижаться первично — при наследственном дефиците, а также вторично — при потере общего белка организмом (нефротический синдром, тяжелая печеночно-клеточная недостаточность. Также местное снижение уровня альфа-1-антитрипсина в легких встречается у курильщиков и описано у больных с воспалительными заболеваниями кишечника.
Человеческий А1А — белок массой 52 кДа, гликопротеид, состоящий из 394 аминокислот. Ген, кодирующий альфа-1-антитрипсин, расположен на 14-й хромосоме (14^32.1) и состоит из 5 экзонов.
В результате дефицита А1А развивается вариабельное заболевание, которое, как правило, манифестирует сразу после рождения ребенка и проявляется увеличением печени, развитием желтухи, обесцвечиванием кала, потемнением мочи вследствие холестаза. Лабораторные исследования указывают на наличие гипербилирубинемии конъюгированного типа, гиперхолестеринемии, увеличение щелочной фосфатазы, гамма-глютамилтранспептидазы [2], умеренный подъем активности трансаминаз крови.
Такая картина обычно наблюдается до 10-й недели жизни, далее эти дети или погибают, или клинические проявления спонтанно исчезают в конце первого полугодия. В дальнейшем у этих больных нередко диагностируется хронический гепатит [6], могут развиться цирроз печени с типичными его проявлениями (гепатоспленомегалия, портальная гипертензия и др. [3]) или часто рецидивирующие желтухи с зудом и выраженной гиперхолестери-немией.
Примерно у 10% детей, гомозиготных по аллелю Z, отмечается тяжелое поражение печени, включая гепатит у новорожденных и прогрессирующий цирроз печени. Полагают, что 15 - 20% хронических гепатитов у грудных детей обусловлены недостаточностью А1А. При легочной форме чаще всего имеет место картина прогрессирующей эмфиземы, однако могут наблюдаться рецидивирующий обструктивный синдром, рецидивирующий бронхит, повторные пневмонии. У взрослых гомозиготных больных с недостаточностью А1А часто развивается эмфизема легких. У взрослых недостаточность А1А чаще всего приводит к мелкоузловому циррозу печени, который со временем может перейти в крупноузловой цирроз печени, протекает бессимптомно и иногда приводит к развитию печеночноклеточного рака. Концентрация альвеолярного А1А существенно снижена не только у гомозигот, но и у гетерозигот, что существенно ухудшает прогноз и повышает летальность у данной группы больных [1]. Особенно ухудшает прогноз заболевания сочетание наследственного дефицита А1А с другими наследственными или приобретенными поражениями печени, такими как наследственный гемохроматоз [4], вирусный гепатит В и С [5], хронический алкоголизм.
Некоторые ученые фиксируют увеличение риска гепатоцеллюлярной карциномы у больных с PiZ-мутацией [12].
В настоящее время известно более 100 аллей мутации А1А. Ген имеет четыре кодирующих эк-зона — 2, 3, 4, 5 и три некодирующих — 1а, 1Ь, 1с. Аллели А1А делят на четыре класса: I — нормальный, II — дефицитный, III — нулевой и IV — с нарушением функции. Типичная нормальная аллель — PiM. А наиболее значимые дефицитные аллели — PiZ, PiP, PiS. Наиболее низкое снижение уровня А1А в сыворотке крови выявляется при PiZ-мутации. У гомозигот (PiZZ) активность составляет 12 - 15% от нормальных значений, у гетерозигот (PiZМ) — 64% от нормальных значений. У гетерозигот PiSМ активность альфа-1-антитрипсина составляет 86% от нормы.
Ген А1А экспрессируется в печеночном гепатоци-те. Оттуда белок через комплекс Гольджи выводится из клетки. Z-мутация приводит к накоплению синтезированного альфа-1-антитрипсина в гепатоците при очень низкой его секреции в плазму. Следствием S-мутации, как правило, является ранняя деградация. В мировой популяции распространенность гетерозиготного носительства PiZ- и PiS-мутаций различна и в зависимости от региона составляет 2 - 4% [9; 11].
Дефицит А1А обычно диагностируют при снижении его уровня в сыворотке крови ниже 90 - 180 мг/дл. При морфологическом исследовании с помощью иммуногистохи-мических методов выявляются глобулярные включения в эндоплазматическом ретику-луме гепатоцитов. Данные включения выявляются у всех носителей патологического гена даже без клинической картины гепатита или цирроза печени. В настоящий момент доступно исследование генотипа у данной группы больных, целесообразно определять PiZ-, PiS-мутации методом SNP ПЦР [7].
Заместительной терапии в настоящее время не разработано, препаратом, который может улучшить состояние печени у больных с поражением печени, имеющим А1А-недостаточность, является урсодезок-сихолевая кислота (УДХК). Однако при выраженном холестазе УДХК не способна разрешить ситуацию, так как этот препарат не является патогенетическим и у данной группы больных (уровень ГГТП более 30 норм) все равно формируется цирроз печени, требующий трансплантации [10].
Цель исследования — изучить клиническое значение снижения уровня альфа-1-антитрипсина
га ^
ІГ
Е°
и 5
О ^
Е 1
§1
Б -с 5 С!
10 т
х
Л£
Л
І-
ш
2
>
а
н
и
X
Б
га
х
а
о
I-
га
а
ш
г
Таблица 1
КЛИНИКО-ДЕМОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ
Показатели Больные с болезнью Вильсона — Коновалова, 1-я группа (п = 22) Больные с хроническими заболеваниями печени, 2-я группа (п = 39)
Средний возраст, лет, М (а) 34,5 (15,2) 48,8 (12,2)
Пол м /ж 18 (82 %) /4(18 %) 29 (66 %) /10 (34 %)
Алкогольный цирроз 32 (81%)
Цирроз вирусной этиологии — 4 (10%)
ПБЦ — 1 (3%)
ПСХ 1 (3%)
Стеатогепатит — 1 (3%)
Класс цирроза по Чайлд-Пью:
А 18 (82%) 24 (62%)
В 2 (9%) 8 (20%)
С 2 (9%) 6 (15%)
Варикозно расширенные вены пищевода:
0 10 (46%) 18 (46%)
1 8 (36%%) 12 (31%)
2 4 (18%) 6 (15%)
3 — 3 (8%)
Асцит:
есть — 7 (19%)
нет 22 (100%) 32 (81%)
Примечание: Концентрация А1А у больных с хроническими заболеваниями печени. Фактор дисперсии 14,7 прир < 0,001
№10/2010 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ
у больных с хроническими заболеваниями печени, а также определить прогностическое значения уровня А1А у больных гепатолентикулярной дегенерацией.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Уровень А1А был изучен в двух группах больных: первая группа включала 22 больных с болезнью Вильсона — Коновалова (БВК) и вторая группа — 39 больных с поражением печени различной этиологии, преимущественно алиментарной 32 (84%), клинико-демографическая характеристика больных представлена в табл. 1.
Больным проводилось стандартное лабораторное обследование, включавшее общий анализ крови, биохимический анализ крови (АЛТ, АСТ, ЩФ, ГГТП, альбумин, билирубин), протромбиновый индекс (ПТИ). У больных с болезнью Вильсона — Коновалова дополнительно определялся уровень церрулоплазмина в сыворотке крови, исследовались уровень общей и прямой меди, суточная экскреция меди с мочой. Всем больным был определен уровень А1А в крови, (a1-Antitripsin ELISA Kit. Immunodiagnostik AG) и изучены мутации в гене А1А, определялся полиморфизм по аллелям PiMM, PiMS, PiSS, PiMZ, PiZZ методом аллельспецифичной ПЦР.
Статистическая обработка результатов исследования проводилась при помощи пакета программ Statistika 6,0 и Biostat, рассчитывались средние значения (М) и стандартное отклонение средней (с) для количественных признаков и доли (р) и стандартная ошибка доли (S) для качественных признаков. Также для количественных и качественных признаков рассчитывался 95%-ный доверительный интервал. Достоверность разницы полученных значений принимали как р < 0,05. Для оценки разности количественных значений использовали критерий
Стьюдента и его модификации: парный критерий Стьюдента для изучения динамики исследования в одной группе, критерий Ньюмена — Кейлса для оценки разницы значений при множественных сравнениях. Для оценки разницы непараметрических критериев применяли критерий Манна — Уитни для сравнения групп и критерий Уилкоксона, для оценки динамики в одной группе, критерий Крускала — Уоллиса при множественных сравнениях. Для анализа разницы качественных признаков рассчитывали достоверность разницы долей (г) или использовали критерии сопряженности — критерий х2 или критерий Фишера. Для статистического установления зависимостей проводили корреляционные исследования по Пирсону для количественных критериев и по Спирмену — для качественных критериев.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
По результатам генетического исследования в обследованной группе больных был обнаружен 1 больной с полиморфизмом гена А1А по типу Р1Ы8, у остальных отмечался Р1ЫЫ-тип. Больной генотипом Р1Ы8 — мужчина 29 лет, ранее наблюдался с диагнозом стеатогепатит. Из сопутствующих заболеваний в анамнезе — бронхиальная астма. У данного больного отмечался самый низкий уровень А1А — 50 мг/дл. Течение заболевания характеризовалось гепатомегалией (увеличением печени), ци-толитическим синдромом (АСТ, АЛТ более 5 норм) и повышением уровня ГГТ до 4 норм. Больному назначена терапия препаратами УДХК, и он взят под наблюдение.
При анализе полученных результатов больные с БВК были выделены в отдельную группу, так как применяемый для лечения основного
700
600 -
555(336,2)
_L_
s 500 m О о.
* 400 ш
<
<
300 -
Ї 200 -<о *
I 100
о
и
172,2(27,1) ______і_____
67(8,5)
Больные с низким уровнем А1А (п=5)
Больные с нормальным уровнем А1А (п=19)
Больные с повышенным уровнем А1А (п=15)
Концентрация А1А у больных с хроническими заболеваниями печени. Фактор дисперсии 14,7 при р < 0,001
заболевания Д-пеницилламин непосредственно влияет на синтез А1А и его положительный эффект ряд исследователей связывают со снижением уровня А1А, ингибирующего нейтрофильную эластазу и протеазы. Все больные БВК, включенные в исследование, получали Д-пеницилламин в дозе от 750 до 1000 мг в сутки. У 6 (26%) больных отмечалось снижение уровня А1А 57 (56,7-60) мг/дл, у 8 (36%) больных колебался в пределах нормы 173,5 (95-195) мг/дл и у 8 (36%) больных был повышен — 278 (222-560) мг/дл, критерий Крускала — Уоллиса р < 0,001. Показатели функционального состояния печени уровень альбумина, билирубина, ПТИ, АЛТ, АСТ, ЩФ, ГГТП достоверно не отличались независимо от уровня А1А.
Отмечалось изменение показателей обмена меди в зависимости от содержания А1А в крови. У больных с низким содержанием А1А составлял 23,9 ± 9,3 мкг/дл, при нормальном содержании — 17,9 ± 1,6 мкг/дл, при повышенном значении А1А — 32,95 ± 9,0 мкг/дл, достоверность разницы по критерию Крускала — Уоллиса р < 0,001. Уровень церулоплазмина в этих подгруппах достоверно не отличался и составил 13,8 ± 3,5; 9,65 ± 7,64 и 14,8 ± 38,6 мг/дл соответственно. Прямая фракция меди у больных с низкими значениями альфа-1-антитрипсина не обнаруживалась ни у одного больного, у больных с нормальным содержанием А1А прямая фракция меди отмечалась у 4 (50%) больных, от 2 до 4 мкг/дл, и у 5 (63%) больных с высокими значениями А1А прямая фракция меди составляла от 2 до 7 мкг/дл, X2 = 6,01; р = 0,05.
Таким образом, снижение уровня А1А было связано со снижением фракции прямой меди и увеличением выведения меди из организма больного.
В группе больных с хроническими заболеваниями печени уровень А1А колебался от 67,5 до 1875 мг/дл. Снижение уровня А1А отмечалось у 5 (13%) больных, нормальный уровень А1А отмечался у 19 (49%) больных, у 15 (38%) отмечалось повышение уровня А1А (см. рис.). Учитывая биологическое значение А1А, можно было предполагать, что его повышение является ответной реакцией
на воспалительную активность и препятствует повреждению печени цитолитическо-го или холестатического характера. Вместе с тем развивающаяся при циррозе печени белково-синтетическая недостаточность может приводить к дефициту синтеза А1А и тем самым усугублять цитолитический и холестатический синдромы. Была установлена отрицательная корреляция между уровнем А1А и биохимическими показателями цитолитического и холестатического синдрома: А1А У8 АСТ — г = -0,4, р = 0,01;
А1А У8 АЛТ — г = -0,32, р = 0,047; А1А У8 ГГТП — г = -0,35, р = 0,028; А1А У8 ЩФ — г = -0,38, р = 0,017. Достоверность корреляционных взаимоотношений подтверждалась и достоверной разницей в активности ферментов, характеризующих цитолитический и холестатический синдром (табл. 2).
Цитолитический синдром в группе больных с повышенным А1А был менее выражен. Активность АЛТ (Е/л) в данной подгруппе была достоверна ниже (Г = 3,26, р = 0,05). Достоверно выше в крови больных с нормальным и низким содержанием А1А были маркеры холестаза.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Определение уровня альфа-1-антитрипсина и изучение генетического полиморфизма позволяет выделить из группы больных хроническими заболеваниями печени генетические формы поражения печени, обусловленные наследственным дефицитом альфа-1 антитрипсина.
Определение уровня альфа-1-антитрипсина у больных с болезнью Вильсона — Коновалова является дополнительным критерием оценки эффективности терапии Б-пеницилламином.
Снижение уровня альфа-1-антитрипсина у больных с циррозом печени является неблагоприятным прогностическим критерием, так как способствует усилению холестатического и цитолитического синдрома.
л у
1Г
и 5
о ^
Е 1
§1 < £ Б -с 5 С!
10 т
х >
Л£
¡5!
Е-
Ш
2
>
а
н
и
X
Б
га
х
а
о
I-
га
а
ш
¡3
Таблица 2
БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЦИТОЛИТИЧЕСКОГО И ХОЛЕСТАТИЧЕСКОГО СИНДРОМОВ У БОЛЬНЫХ С РАЗЛИЧНОЙ КОНЦЕНТРАЦИЕЙ АЛЬФА-1-АНТИТРИПСИНА В КРОВИ
Показатели Больные со сниженным уровнем А1А (п = 5) Больные с нормальным уровнем А1А (п = 19) Больные с повышенным уровнем А1А (п = 15)
Альфа-1-антитрипсин (мкг / дЛ) 67 (8,5) 172 (27,1) 555 (336,2) *
АЛТ (МЕ/Л) 51,7 (31,3) 97,9 (66,5) 102,2 (70,1) *
АСТ (МЕ/Л) 102,2 (70,1) 88,1 (97,9) 51,8 (31,3)
ЩФ (МЕ/Л) 131,4 (46,7) 147,5 (48,1) 108,8 (36,5) *
ГГТП (МЕ/Л) 304 (137,6) 278 (136) 175,9 (112,5) *
Примечание: * — р < 0,05 по критерию Крускала — Уоллиса.
№10/2010 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ
ЛИТЕРАТУРА
1. Tanash H. A., Nilsson P. M., Nilsson J. A. et al. Survival in severe alpha-1-antitrypsin deficiency (PiZZ) // Respir. Res. — 2010. — Vol.
11. — P. 44. PMID: 20420704.
2. Holme J., Dawkins P. A., Stockley E. K. et al. Studies of gamma-glutamyl transferase in alpha-1 antitrypsin deficiency // COPD. — 2010. — Vol. 7,
№ 2. — P. 126 - 132. PMID: 20397813.
3. Voide N., Ardigo S., Morris M. et al. Alpha-1-antitrypsin deficiency in a 78-year-old woman with isolated liver cirrhosis // J. Am. Geriatr. Soc. — 2010. — Vol. 58, № 2. — P. 415 - 416. PMID: 20370885.
4. Lam M., Torbenson M., Yeh M.M. et al. HFE mutations in alpha-1-antitrypsin deficiency: an examination of cirrhotic explants // Mod. Pathol. — 2010. — Vol. 23, № 5. — P. 637 - 643. Epub 2010 Mar 5. PMID: 20208481.
5. Nair V., Fischer S. E., Adeyi O.A. Non-viral-related pathologic findings in liver needle biopsy specimens from patients with chronic viral hepatitis // Am. J. Clin. Pathol. — 2010. — Vol. 133, № 1. — P. 127 - 132. PMID: 20023268.
6. Topic A., Alempijevic T., Milutinovic A. S. et al. Alpha-1-antitrypsin phenotypes in adult liver disease patients // Ups. J. Med. Sci. — 2009. — Vol. 114, № 4. — P. 228 - 234. PMID: 19961268.
7. Marchetti A. L., Highsmith E. d W., Tsongalis G. J. et al. Real time PCR detection of the PI*Z and PI*S mutations associated with alpha-1 antitrypsin deficiency // Am. J. Transl. Res. — 2009. — Vol. 1, № 4. — P. 406 - 411. PMID: 19956452.
8. Gooptu B., Ekeowa U. I., Lomas D. A. Mechanisms of emphysema in alpha1-antitrypsin deficiency: molecular and cellular insights // Eur. Respir. J. — 2009. — Vol. 34, № 2. — P. 475 - 488. Review. PMID: 19648523.
9. Spinola C., Bruges-Armas J., Pereira C. et al. Alpha-1-antitrypsin deficiency in Madeira (Portugal): the highest prevalence in the world // Respir. Med. — 2009. — Vol. 103, № 10. — P. 1498 - 1502. Epub 2009 May 17. PMID: 19450958.
10. Lykavieris P., Ducot B., Lachaux A. et al. Liver disease associated with ZZ alpha1-antitrypsin deficiency and ursodeoxycholic acid therapy in children // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. — 2008. — Vol. 47, № 5. — P. 623 - 629. PMID: 18955864.
11. de Serres F. J., Blanco I., Fernandez-BustUlo E. PI S and PI Z alpha-1 antitrypsin deficiency worldwide. A review of existing genetic epidemiological data // Monaldi Arch. Chest. Dis. — 2007. — Vol. 67, № 4. — P. 184 - 208. Review. PMID: 18309698.
12. Zhou H., Ortis-Pallardo M. E., Ko Y. et al. Is heterozygous alpha-1-antitrysin deficiency type PiZ a risk factor for primary liver carcinoma? // Cancer. — 2000. — Vol. 88. — P. 2668 - 2676.
