CC BY
16УДК 574.3:575.24/.25]:616.151.5
И.Б. Моссэ
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА - НЕОТЪЕМЛЕМАЯ ЧАСТЬ ПЕРСОНАЛЬНОЙ И ПРЕВЕНТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ
Обзорная статья
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Все заболевания человека генетически обусловлены, но в разной степени. Наследственные болезни зависят от генотипа на 100% - с ними ребёнок рождается, или они неминуемо проявляются в пожилом возрасте (болезни Паркинсона, Альцгеймера и др.). Большинство же заболеваний человека (в том числе простудные, инфекционные и травмы) являются многофакторными - к ним есть генетическая предрасположенность, но проявляются они при воздействии провоцирующих факторов. Генетические механизмы этих заболеваний менее изучены и сейчас привлекают внимание исследователей всего мира.
Новым направлением, объединившим усилия медиков и генетиков, стала так называемая медицина 4П, основными особенностями которой являются следующие:
1. Персонализированная медицина - выбор лечебных воздействий с учетом индивидуальных (генетических) особенностей конкретного человека.
2. Предиктивная (предсказательная) медицина - предсказание особенностей здоровья (заболевания, возможные в будущем, особенности реагирования и др.) конкретного человека, до появления первых симптомов.
3. Превентивная (предупредительная) медицина - проведение профилактических мероприятий в отношении возможных, предсказанных заболеваний до появления первых симптомов.
4. Партисипативная медицина - активное участие пациента в профилактике возможных заболеваний и их лечении.
Смысл персонализированной медицины состоит в лечении не болезни, а пациента. Лекарства должны назначаться согласно особенностям генотипа - уже существует 29 лекарственных средств, использование которых
требует проведения предварительного гено-типирования. Так например, при лечении вирусного гепатита С необходимо тестирование пациента на носительство полиморфных вариантов гена интерлейкина 28Ь (С/Т, ге12979860), которые влияют на эффективность противовирусной терапии хронического гепатита С. Успех применения ПЭГ-интерферона в сочетании с рибавирином достигается у 80% больных с генотипом С/С, у 40% с генотипом С/Т и у 35% с генотипом Т/Т.
Генотипирование является также необходимым этапом предиктивной и превентивной медицины. Результаты исследования генетической предрасположенности к опасным многофакторным заболеваниям позволяют определять уровень риска той или иной патологии (предиктивные мероприятия), на основании этих данных формировать группы риска среди населения, осуществлять профилактику до появления первых симптомов (превентивные мероприятия).
При появлении первых симптомов заболевания генотипирование помогает корректно осуществлять раннюю диагностику патологий, определять тактику лечения, а также предотвращать тяжёлые осложнения и повторные случаи заболеваний. Всё это имеет большое социально-экономическое значение.
ДНК-диагностика предрасположенности к заболеваниям необходима как для лечащих врачей, так и для самого человека. Уже при рождении ребёнка можно составить его «генетический паспорт», в котором будет отражена его предрасположенность к заболеваниям. Зная о генетическом риске того или иного заболевания, человек может скорректировать свой образ жизни так, чтобы избежать влияния средовых факторов риска и тем самым предотвратить болезнь. В этом и заключается смысл партисипативной медицины.
Таким образом, медицина будущего 4П невозможна без использования генетических методов выявления предрасположенности к заболеваниям и травмам.
Лаборатория генетики человека Института генетики и цитологии НАН Беларуси, аккредитованная в области определения индивидуальных генетических особенностей человека, выполняет научные задания по исследованию генетических механизмов многофакторных болезней, а также оказывает услуги населению по выявлению генетической предрасположенности к социально-значимым (опасным и в то же время распространённым) заболеваниям, таким как сердечно-сосудистые заболевания, диабет, остеопороз, а также по определению риска невынашивания беременности.
Выполнение научных заданий осуществляется совместно с учреждениями Министерства здравоохранения РБ - ГУ «РНПЦ «Кардиология», ГУ «РНПЦ «Мать и дитя», УО «БГМУ», БелМАПО и др.
Методы молекулярно-генетического анализа
В качестве биологического материала для исследования используется ДНК, выделенная из буккального эпителия (соскоба с внутренней поверхности щеки).
Экстракцию ДНК из образцов биологического материала осуществляют стандартным методом с использованием коммерческого набора для выделения ДНК в соответствии с инструкцией производителя. Выделенные образцы ДНК хранят при -20 °С.
Для идентификации полиморфизмов используется амплификация специфических последовательностей ДНК методом полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) с последующим разделением продуктов в полиакриламидном геле или с помощью системы детекции продуктов ПЦР в реальном времени.
Для идентификации ряда мутаций и полиморфных вариантов генов разработаны методики на основе tetra-primer ARMS PCR с использованием специально подобранных праймеров и реагентов, что позволяет оптимизировать временные и материальные затраты на проведение анализа. Генотипирование по полиморфизмам генов осуществлялось методом количественной ПЦР в реальном времени
с использованием праймеров, TaqMan-зондов и набора реагентов (Синтол, Россия). Детекция флюоресценции, а также первичная обработка результатов осуществлялись программным обеспечением прибора CFX96 (BIO-RAD, США) в автоматическом режиме. Для выявления однонуклеотидных замен некоторых генов проводился анализ длин амплификационных продуктов электрофоретическим разделением в 8%-ном полиакриламидном геле с последующей окраской бромистым этидием и визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета анализа данных Microsoft Excel и программы Statistica 7.0. Для оценки влияния полиморфизмов на риск развития заболевания применяли коэффициент соотношения шансов (OR). Распределение соответствующих генотипов в исследуемых группах для всех проанализированных полиморфизмов проверяли на соответствие ожидаемому распределению Харди-Вайнберга.
ДНК-диагностика предрасположенности к острому инфаркту миокарда
По данным Всемирной организации здравоохранения, одной из главных причин инвали-дизации и смертности во всем мире являются сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ). Они представляют собой группу болезней сердца и кровеносных сосудов, в которую входят инфаркт миокарда, ишемическая болезнь сердца, болезнь сосудов головного мозга, легочная тромбоэмболия и др. В крупных городах ежегодно регистрируется более 300 случаев инфаркта на каждые 100 тысяч жителей. Инфаркт миокарда недавно считался болезнью пожилых, но за последние годы наметилась тревожная тенденция - инфаркт «молодеет».
Вклад генетического компонента в риск инфаркта миокарда составляет более 50%. Одним из наиболее плодотворных подходов к изучению генетических механизмов развития инфаркта миокарда является выявление генетических маркеров, ассоциированных с развитием заболевания, с помощью молекулярно-генетических методов. Данного рода исследования дают возможность выделить группы генов, нарушение структуры и функционирования которых вносит наибольший вклад в развитие кардиоваскулярной пато-
логии, и на этой основе вымвить группы лиц с более высоким генетическим риском развития заболевания.
Особую опасность представляют мутации факторов свёртываемости крови - мутация гена протромбина и Лейденская мутация, которые увеличивают риск артериальных и венозный тромбозов в 3-8 раз. Своевременное выявление этих мутаций позволяет проводить профилактику тромбофилий с помощью про-тивосвёртывающих средств (антиагрегантов).
Сравнительный анализ популяционных частот мутации Factor V Leiden в разнык странах позволяет сделать вывод, что она значительно чаще встречается у белокожего населения планеты по сравнению с людьми с темным цветом кожи, а также имеет место градиент уменьшения распространения мутации в странах Европы с севера на юг (рис. 1).
Для жителей Восточной Азии (Япония, Тайвань, Китай, Монголия, Гонконг), аборигенов Австралии характерно отсутствие данной мутации [1, 2]. В Южно-африканских странах среди всех проведенных исследований не зарегистрировано ни одного носителя мутации [1].
Полученная нами частота встречаемости мутации Factor V Leiden в белорусской популяции (3,0 %) совпадает с популяционной частотой (2,9%), установленной ранее для Беларуси [3]. Эти величины наиболее близки к результатам, полученным в Италии (3,0%) [4] и России (2,6%) [2].
В нашей лаборатории совместно с РНПЦ «Кардиология» и РНПЦ «Мать и дитя» исследованы генетические механизмы предрасположенности к острому инфаркту мио-
Доля носителей мутации на континентах
Африка Австралия
0% - 5%
У^Ш N. Азия
Ш \ 11%
Южная Америка 16%
Рис. 1. Сравнение частот распространения мутации Factor V Leiden на разных континентах земного шара
карда (ИМ). Исследования проведены по полиморфным вариантам генов, влияющих на активность и структуру фибриногена и плазминогена - белков, участвующих в процессе тромбообразования на конечных стадиях коагуляционного каскада: a-Fibrinogen Thr312Ala, Factor XIII Val34Leu, PAI-1 4/5G, Factor V Leiden, а также по гену LDLR (дину-клеотидные повторы).
Образцы крови больнык, перенесших острый инфаркт миокарда (180 чел.), были предоставлены Республиканским научно-практическим центром «Кардиология» МЗ Беларуси. Контрольная группа (278 чел.) состояла из лиц старше 50 лет, без явной сердечно-сосудистой патологии. В группе пациентов, перенесших инфаркт миокарда (ИМ), женщины составили 15,5% от выборки, а мужчины, соответственно, 84,5%. Такое распределение пациентов по полу в случайной выборке пациентов, перенесших ИМ, подтверждает тезис о том, что ИМ гораздо чаще бывает у мужчин [5].
У пациентов с ИМ обнаружено увеличение частоты гетерозигот Thr312Ala 1-го фактора свёртываемости крови (OR = 1,4), частоты встречаемости мутации Factor Veiden (V-ый фактор свёртываемости крови) (OR=2,3), частоты генотипа Leu /Leu Factor XIII (OR = 2,5), а также генотипа 4G/4G гена PAI-1 (OR = 1,4). В группе пациентов с ИМ отмечено также значимое увеличение частот генотипов 7/8 ТА (11,3%) и 8/10ТА (8%) гена LDLR по сравнению с контролем (6% и 4% соответственно), Кроме того, у пациентов с инфарктом миокарда вымвлены1 аллели гена LDLR с 11-ю дину-клеотидными повторами, которые не встречаются в контрольной популяции, что позволяет сделать вывод о высокой информативности данного гена для оценки риска ИМ [6].
На рис. 2 представлен сравнительный анализ частот генотипов риска ИМ с уровнями этого заболевания в ряде стран Европы [7, 8]. Выявлена достоверная положительная корреляция между частотой заболеваемости ИМ и частотой генотипа 4G/4G гена PAI (r = 0,8871, p < 0,0447), что свидетельствует о том, что данный генотип вносит существенный вклад в развитие заболевания. В то же время для других факторов риска ИМ достоверной корреляции с частотой возникновения инфаркта миокарда не наблюдалось.
Рис. 2. Сравнение частот генотипов риска ИМ с уровнями этого заболевания в разных странах, % [7]
Известно, что в возникновении инфаркта миокарда большое значение имеют средовые факторы риска, такие как гиподинамия, стрессы, курение, диабет, гипертония и другие. Большинство перечисленных факторов связаны с уровнем социального и экономического развития страны, поэтому частота заболеваний во многом зависит от образа жизни людей в разных странах и может не совпадать с частотой генетических факторов риска.
Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что генотип 4G/4G гена РА1—1 является наиболее информативным среди
рассматриваемых полиморфных вариантов для определения генетической предрасположенности к ИМ. Понятно, что к серьезному увеличению риска инфаркта миокарда приводят не отдельные аллели, а их сочетание в генотипе индивидуума, а также взаимодействие со средовыми факторами.
Сравнительный анализ полученных данных показал, что большее значение имеют не единичные факторы риска, а их сочетания. Так, наибольшим вкладом в предрасположенность к ИМ обладают аллельные варианты ТЪг\А1а_ Leu\Leu_5G\5G; Ala\Ala_Val\Leu_4G\4G и ТМ Ala_Leu\Leu_4G\4G (табл. 1).
Таблица 1
Отношение частот сочетаний генотипов риска ИМ в исследованных группах
Комбинация генотипов Отношение частоты встречаемости сочетаний генотипов в группе с ИМ к частоте встречаемости в контрольной группе
№\А1а Val\Leu 40\5в 1,2
№\А1а Val\Leu 4в\40 1,2
ТЫ-\А1а_УаГ^а1_50\50 1,4
ТЫ-\А1а_УаГ^а1_40\50 1,6
ТЬ-\А1а_Уа1УУа1_40\40 1,8
ТЬ-\ТЪг^еи^еи_40\40 1,8
ТЫ-\А1а^еи^еи_50\50 2,7
А1а\А1а_УаГ^еи_40\40 2,9
ТЫ-\А1а^еи^еи_40\40 4,0
Судя по данной таблице, явно прослеживается тенденция, что чем больше аллельных вариантов риска ИМ в комбинации, тем чаще встречается данная комбинация в группе пациентов с ИМ. Так, при наличии в комбинации одновременно вариантов Thr\Ala и Leu\ Leu частота её встречаемости у пациентов в 2,7 раза выше, чем в контроле. Частоты сочетаний Thr\Ala+Leu\Leu+4G\4G и Ala\Ala+Val\ Leu+4G\4G в контрольной группе и в группе пациентов, перенесших ИМ, различаются в 2,9-4 раза. Очевидно, эти комбинации аллель-ных вариантов вносят наибольший вклад в предрасположенность к сердечно-сосудистым заболеваниям.
Показано также, что наследственная предрасположенность к ИМ чаще реализуется в более раннем возрасте, причем, чем больше у человека факторов риска ИМ, тем раньше реализуется эта предрасположенность, а с увеличением возраста увеличивается вклад средовых факторов.
Нами разработаны и утверждены Министерством здравоохранения РБ методические рекомендации по ДНК-диагностике генетической предрасположенности к тромбофили-ям различного происхождения. Рекомендации внедрены в РНПЦ «Кардиология», в Городской кардиологический центр при 9-й клинической больнице и в РНПЦ «Гематология и трансфу-зиология» (ныне РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий) МЗ РБ.
Потребность в ДНК-диагностике генетической предрасположенности к тромбофилиям в Беларуси составляет не менее 1 млн. человек. Лечение одного больного в кардиохирургии обходится государству порядка 100 долларов США в день. Снижение числа опасных патологий с помощью генетического тестирования составит существенную экономию средств, а также будет иметь огромное социальное значение.
Кардиометаболический синдром -новая пандемия XXI века
Вопросы профилактики, диагностики и лечения кардио-метаболических нарушений (КМН) представляют собой острейшую медико-социальную проблему современности. Некоторые эксперты ВОЗ считают КМН новой пандемией XXI века, охватывающей индустриально развитые страны. Это может оказаться демогра-
фической катастрофой для развивающихся стран. Распространённость метаболического синдрома в два раза превышает распространённость сахарного диабета, и в ближайшие 25 лет ожидается увеличение темпов его роста на 50%. [9]
Согласно современным концепциям, кардио-метаболические нарушения - это кластер гормональных и метаболических нарушений, взаимосвязанных факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и сахарного диабета. Развитие КМН обусловлено сложным взаимодействием наследственных и средо-вых факторов. Наиболее важными факторами внешней среды, способствующими развитию КМН, являются избыточное употребление пищи, содержащей жиры и сахара, и низкая физическая активность, приводящие к избыточному весу и ожирению.
Необходимо подчеркнуть, что большинство пациентов с КМН - это люди активного трудоспособного возраста, наиболее продуктивная и значимая доля общества. Кроме того, за последние два десятилетия изучаемый синдром демонстрирует устойчивый рост среди молодёжи и детей. Стремительное увеличение распространенности КМН в различных возрастных группах обусловливает необходимость определения их генетических механизмов с целью поиска эффективных современных подходов к профилактике и лечению как самих нарушений в комплексе, так и отдельных компонентов.
Нами проанализировано более 400 образцов ДНК пациентов с кардиометаболически-ми нарушениями и 350 человек контрольной группы. Полученные данные о распределении частот генотипов и аллелей полиморфизмов 10 генов - кандидатов риска КМН - позволили выявить полиморфизмы и мутации, которые вносят существенный вклад в генетическую предрасположенность к КМН.
По результатам генотипирования выявлено статистически достоверное различие в распределении частот генотипов и аллелей полиморфизма I/D гена АСЕ среди пациентов с КМН и в контрольной группе (с2 = 4,49 и с2 = 4,36, соответственно, p < 0,05). При этом наличие генотипа D/D способствует увеличению риска заболевания в 1,33 раза, а частота аллеля риска D достоверно выше среди пациентов с КМН по сравнению с контролем (OR = 1,36 95% CI 1,02-1,82) [10].
Наиболее выраженные различия между частотами генотипов и аллелей в исследованных выборках наблюдались для полиморфизма С/Т гена TCF7L2 (с2 = 8,10 и с2 = 8,76, соответственно, p <0,01). В связи с низкой частотой гомозигот Т/Т в популяции, генотипом риска для этого полиморфизма является гетерозигота Т/C: среди пациентов с КМН частота этого генотипа значительно выше, чем в контрольной группе (44,4% и 27,9% соответственно). В то же время генотип C/C является протекторным (OR = 0,49 95% CI 0,32-0,74). Полученные данные свидетельствуют о значительном вкладе полиморфизма C/Т гена TCF7L2 в патогенез развития КМН (рис. 3).
При анализе результатов генотипирования группы лиц с сахарным диабетом 2 типа (СД 2) по полиморфизму Pro/Ala гена PPARG нами наблюдалось статистически достоверное снижение частоты аллеля Ala (OR = 0,57 95% CI 0,33-0,99) среди пациентов с СД 2 по сравнению с контролем (рис. 4). В то же время аллель Pro является аллелем «дикого типа», его частота в белорусской популяции составляет более 80%.
Таким образом, по результатам проведенного исследования, наибольшим вкладом в генетическую предрасположенность к КМН из проанализированных генов обладают TCF7L2, ACE, UCP2 и PPARG. Генетическое
тестирование по этим генам можно проводить с целью формирования групп повышенного риска развития данного заболевания. Выявление аллельных вариантов генов, обусловливающих повышенный в 1,5-2 раза риск развития кардио-метаболических нарушений, позволяет создать базу для разработки диагностических методов прогнозирования течения заболевания и разработать мероприятия по профилактике кардиометаболических нарушений.
ДНК-диагностика для корректировки персональной фармакологической поддержки
Коррекция метаболических нарушений часто проводится с помощью специфических противогипоксических средств (антигипок-сантов). Опыт использования этих препаратов показал, что эффективность их применения варьирует в широких пределах и в значительной степени зависит от индивидуальной устойчивости организма к гипоксии. Лица с различной устойчивостью к гипоксическому воздействию имеют ряд различий (биохимических, физиологических, психологических), влияющих как на характер адаптации к гипоксии, так и на эффективность применения антигипоксантов. Показано, что большинство этих различий являются генетически обусловленными.
80 70 60 50 40 30 20 10
OR 0,49
(0,32-0,74)
p<0,05
OR 0,61
(0,44-0,85)
p<0,05
~l-1-1-г
Т/Т Т/С С/С Т С
Метаболический синдром
Контроль
Рис. 3. Частоты генотипов и аллелей гена TCF7L2 С/Т в исследованных группах
0
0s
ta
о а 100
s
н
о
X
«
U
S
35 50
V
п
«
п
п
«
Л
н о 0
н
W
«
V
OR 1,76
(1,01-3,06)
p<0,05
Ala/Ala Pro/Ala Pro/Pro
Сахарный диабет
Ala
Pro
Контроль
Рис. 4. Частоты генотипов и аллелей полиморфизма Pro/Ala гена PPARG в исследованных группах
Соответственно, подход к выбору фармакологического обеспечения должен быть строго индивидуальным. В связи с этим, исследование полиморфизма генов, контролирующих процессы, способные влиять на устойчивость организма к гипоксии, представляет значительный интерес с точки зрения организации медико-биологического и фармакологического обеспечения профессиональной деятельности лиц экстремальных профессий.
Исследование переносимости гипоксии позволяет выявлять группы лиц с различной фенотипической устойчивостью к действию гипоксического стимула, однако показатели фенотипической устойчивости не стабильны. Они могут меняться даже в течение часа в зависимости от различных внутренних и внешних факторов. Единственной возможностью адекватного определения выносливости человека является выявление генетически детерминированной устойчивости к гипоксии, которая постоянна, не меняется в течение всей жизни и не зависит ни от внутренних, ни от внешних факторов.
Исходя из этого, нами выполнено исследование образцов геномной ДНК у тренированных лиц - спортсменов и сотрудников спецподразделений силовых ведомств - на наличие полиморфных вариантов в 13 генах,
способствующих быстрому и адекватному ответу на гипоксический стресс, формирующих общую устойчивость к гипоксии, а также регулирующих процессы энергетического метаболизма: АСШЗ, АСЕ, AMPD1, РА1-1, МВ, BDKRB2, НШ1А, ЕРО, NOS3, PPARG,
UCP2,VEGF.
При определении устойчивости каждого человека к гипоксии учитывали роль различных аллелей или генотипов в генетической предрасположенности к выносливости - чем больше в генотипе благоприятных аллельных вариантов (в том числе редких) и меньше отрицательных, тем больше выносливость человека. Обращает на себя внимание факт, что подавляющее большинство лиц экстремальных профессий имеет в генотипе от 1 до 3 редких благоприятных вариантов генов. Тем не менее, испытуемых можно разделить на группы (рис. 5):
• высокоустойчивые к гипоксии;
• среднеустойчивые к гипоксии;
• низкоустойчивые к гипоксии.
Эти данные хорошо коррелировали с результатами определения устойчивости к гипоксии, определённой по клинико-биохимическим тестам в РНПЦ «Кардиология» (рис. 5).
Следовательно, лица экстремальных профессий, которые априори должны отличаться
выносливостью, тем не менее различаются по своей генетически детерминированной устойчивости к гипоксии. Поэтому для разработки схем назначения фармакологических препаратов необходимо учитывать данные генетического анализа.
В качестве препарата, повышающего резистентность организма к воздействию различных повреждающих факторов, широко используется Мексибел. Он относится к группе субстратных антигипоксантов с антиоксидант-ными свойствами. Многочисленные клинико-физиологические эффекты Мексибела являются основанием для их широкого применения у лиц экстремальных профессий с целью улучшения функционального состояния и повышения физической работоспособности.
Нами установлено, что наиболее значительное влияние на уровень физической работоспособности и метаболические параметры ее обеспечения Мексибел оказывал у лиц с низкой и средней устойчивостью к гипоксии. У них применение препарата вызвало достоверное снижение времени выполнения нагрузочного теста (с 13,7 ± 0,02 с до 12,4 ± 0,1 с; X ± S.E.M.; р < 0,05; критерий знаков) и увеличение средней мощности выполненной работы (с 592 ± 20,8 Вт до 688 ± 21,6 Вт). Следовательно, курсовое применение Мексибела способно повышать у низкоустойчивых лиц
б
-
1111
Н-Н 3,6
1,2
Высокая Средняя Низкая
Ус 1ОПЧИНОСI ь к гипоксии
Рис. 5. Время восстановления процентного содержания кислорода в периферической крови после прекращения дыхания гипоксической смесью у лиц экстремальных профессий с разной устойчивостью к гипоксии (время дыхания ГГС = 5 мин)
переносимость высоких физических нагрузок, ускорять постнагрузочное восстановление, препятствуя таким образом развитию синдрома перетренированности.
Однако применение Мексибела малоэффективно (а иногда даже не целесообразно) для лиц, высокоустойчивых к гипоксии.
Таким образом, предварительное генетическое тестирование позволяет улучшить качество фармакологической поддержки и, в частности, антигипоксантной терапии с применением мексибела у спортсменов и лиц экстремальных профессий.
Роль молекулярно-генетических
факторов в развитии остеопороза
Исследование генетических механизмов остеопороза проведено по договору о научном сотрудничестве между Государственным научным учреждением «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» и Государственным научно-исследовательским институтом «Центр инновационной медицины» (Литовская Республика) в рамках программы двустороннего сотрудничества между Беларусью и Литвой в области науки и технологий на 2011-2012 гг.
Остеопороз (ОП) - системное заболевание скелета, характеризующееся снижением прочности костной массы, изменением её структуры и повышенным риском переломов. По данным Всемирной организации здравоохранения, у 15-20% людей старше 50 лет выявляются остеопоротические изменения, причем у 30% из них это может привести к опасным инвалидизирующим переломам.
Костная ткань является важнейшим источником кальция для поддержания его нормального физиологического уровня в организме. При нарушении «баланса» под влиянием ряда факторов, к которым относятся особенности питания, курение, прием лекарственных средств, гормональные нарушения и т.д., количество резорбируемой (отдающей кальций) костной ткани превышает количество формируемой, и плотность костной ткани снижается, что ведет к развитию остеопороза. Исследования показали, что минеральная плотность кости на 60-85% зависит от генотипа человека, и природа этой наследственности закодирована во многих генах.
Нами проведено генотипирование пациенток с ОП и контрольной группы по полиморфизмам Ара1, BsmI, Cdx2 гена VDR, G2046T гена COL1A1 и Т-13910С гена LCT, участвующих в регуляции минеральной плотности костной ткани (МПК). Выявлены полиморфизмы, которые вносят наибольший вклад в развитие постмено-паузального остеопороза, установлены частоты их носительства в популяциях Беларуси и Литвы, а также их взаимосвязь с уровнем МПК. Наиболее выраженная ассоциация наблюдалась между уровнем МПК и полиморфизмами Ара1 и TaqI гена VDR [11-13].
Результаты работы свидетельствуют о том, что полиморфизмы Ара1, BsmI и Таф1 гена VDR и Т-13910С гена LCT повышают риск развития остео-пороза (рис. 6, 7). Для полиморфизмов Cdx2 гена VDR и G2046T гена COL1A1 также была обнаружена взаимосвязь с риском развития ОП, однако статистически недостоверная, что, возможно, является следствием недостаточной выборки.
Полученные результаты использованы для проведения скрининга генетических маркеров среди населения Беларуси для определения генетической предрасположенности к развитию остеопороза. Разработанная технология определения генетической предрасположенности к остеопорозу внедрена в Минский Городской центр профилактики остеопороза и в Литовский Национальный центр остеопороза (г. Вильнюс). Разработанная технология легла
в основу методических рекомендаций «Риск остеопоротических переломов и его ранняя оценка с помощью полиморфизмов генов VDR, COL1A1 и LCT», утвержденных и опубликованных в Литовской Республике.
Роль генетических факторов в предрасположенности к невынашиванию беременности
Проблема бесплодия и невынашивания беременности становится все более актуальной. В условиях неблагоприятной демографической ситуации, когда каждые пять лет на 20% уменьшается число женщин, способных родить ребенка, особенно важно сохранение и развитие беременности у супружеских пар, желающих иметь детей.
По данным Министерства здравоохранения, в Беларуси 10-25% беременностей оканчивается неудачно, причём этот показатель с 1998 года вырос на 8%.
В последнее время одной из главных причин выкидышей стали считать тромбофилию -патологическое состояние организма, характеризующееся повышенной склонностью к тромбообразованию. К тромбофилии могут приводить изменения генов, ответственных за систему гемостаза, поэтому большой интерес представляет изучение генетических полиморфизмов, при которых происходят те или иные изменения в процессах свёртывания крови.
Рис. 6. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма Ара1 гена VDR контрольной группы
и пациентов с ОП
Рис. 7. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма BsmI гена VDR контрольной группы
и пациентов с ОП
Исследования последних лет показали, что наличие генетической предрасположенности к тромбофилии сопряжено с повышенным риском развития осложнений во время беременности (привычное невынашивание, плацентарная недостаточность, задержка роста плода, поздний токсикоз и др.).
Генетический риск тромбофилии часто реализуется только при дополнительных условиях, одним из которых как раз и является беременность. При этом клинико-биохимические анализы в начале не выявляют отклонений от нормы, но при развитии беременности образуются микротромбы в плаценте, и происходит самопроизвольный выкидыш или замершая беременность.
Среди причин генетических тромбофилий в литературе широко обсуждается причинно-следственная связь между мутациями фактора V Leiden, мутации G20210-A в гене протромбина, С677-Т в гене метилентетрагидрофола-тредуктазы (MTHFR), полиморфизмами 4G/5G в гене ингибитора активатора плазминогена I (PAI-I), G/A 455 в гене фибриногена и развитием тяжелого гестоза, задержки внутриутробного развития плода, преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты и другими осложнениями [14-21].
Большое значение в формировании генетической предрасположенности к невынашива-
нию имеет не только носительство аллелей риска по отдельности, но и их комбинации.
В связи с этим, изучение причин генетической предрасположенности к невынашиванию беременности имеет важную и неоспоримую значимость, что и явилось целью нашей работы. ДНК-анализ аллелей генов риска позволяет выявлять причины нарушений беременности в каждом конкретном случае, что даёт возможность терапевтической коррекции эффектов этих неблагоприятных аллелей и обеспечивает нормальное протекание процесса беременности.
Проведена оценка информативности генов-кандидатов риска невынашивания беременности для белорусской популяции. Изучение и сопоставление частот встречаемости вариантов генов-кандидатов риска у пациенток с патологией беременности (500 человек) по сравнению с контрольной группой (350 чел.) позволило выявить аллельные варианты, обладающие наибольшей прогностической ценностью. По нашим данным, факторами риска патологии беременности для белорусской популяции можно считать наличие следующих аллельных вариантов генов: D\D гена АСЕ, 4G\5G и 4G\4G гена PAI-1; Ala/Ala гена F1, Val\Leu и Leu\Leu гена F13, кроме того в гене eNOS варианты Т/Т (G894Tj, 4а/4а и 4b/4a, а также в гене MTHFR варианты Т\Т (С677-Т), С/С(А1298С; и компаунд С/Т + А/С.
Наиболее выраженные различия между частотами генотипов и аллелей в исследуемых выборках наблюдались для полиморфизмов 4G/5G гена РА1-1 (х2 = 58,37 и х2 = 67,59, соответственно, р < 10-10) и С/Т гена MTHFR (х2 = 43,44 и х2 = 47,75, соответственно, р < 10-10). При этом наличие генотипа 4G/4G гена РА1-1 увеличивает риск патологии беременности в 1,9 раза, наличие генотипа 4G/5G - в 1,7 раза, а частота аллеля риска 4G достоверно в 2,1 раза выше у пациенток с невынашиванием беременности по сравнению с контролем (OR = 2,10. 95% С1 1,76-2,51). Частота встречаемости полиморфных генотипов 4G/5G и 4G/4G у пациенток в сумме составляет 79%, что значительно выше, чем в контроле (54%). Полученные данные свидетельствуют о значительном вкладе полиморфизма 4G/5G гена РА1-1 в патогенез развития патологии беременности.
Наличие генотипа Т/Т гена MTHFR увеличивает риск патологии в 3,5 раза (OR = 3,50 95% С1 1,82-6,75), а генотип С/Т того же гена - в 2,1 раза ДО = 2,10 95% С1 1,51-2,90). Частота аллеля риска Т достоверно выше у женщин с невынашиванием беременности по сравнению с контролем ДО = 2,46 95% С1 1,90-3,18).
При сравнении генотипов пациенток и контрольной группы также выявлены достоверные различия в распределении аллельных вариантов полиморфизма А/С гена MTHFR (х2 =10,28 и х2 = 10,49, соответственно, р < 0,01). Так, наличие генотипов А/С и С/С увеличивает риск невынашивания беременности в 1,5 раза ДО = 1,48 95% С1 1,09-2,02 и OR = 1,51 95% С1 0,88-2,59, соответственно) и частота аллеля С также достоверно выше у пациенток ДО = 1,47 95% С1 1,17-1,87).
40 35 30 25 20 15 10 5 0
4,5
1,0 1
5 6 7 Количество факторов риска
0,0 8
0,0 9
0,0 10
Рис. 8. Распределение частот генотипов с разным количеством факторов риска невынашиваемости беременности, %
Понятно, что чем больше факторов риска в генотипе, тем риск невынашивания беременности выше. Анализ генотипов 500 пациенток с невынашиванием беременности показал, что у 90,7% женщин, обследованных по 10 генам, количество факторов риска составляло от 3 до 6 (рис. 8). Причём больше трети пациенток (35%) имеют в генотипе пять факторов риска. Ровно 1% женщин с патологией беременности имеет только 1 неблагоприятный вариант гена.
Поскольку в формировании генетической предрасположенности к невынашиванию беременности имеет значение не только но-сительство аллельных вариантов риска по отдельности, но и их комбинации, проанализирована частота ряда сочетаний факторов риска в группе пациенток. Результаты анализа той же выборки, состоящей из 500 пациенток, представлены на рис. 9.
По полученным результатам можно сделать вывод, что чаще всего встречаются комбинации связанных с невынашиванием вариантов следующих генов: РХШ + РА1 (41%), eNOS (4а/4Ь) + РА1 (30%), АСЕ + РА1 (26%) и АСЕ + ЕХШ (28%). Нередко встречается также комбинация из трёх факторов риска: FXIII + РА1+ eNOS (4а/4Ь) - 15%.
Выявление носительства комбинаций данных полиморфизмов важно для выбора терапии у женщин с невынашиванием, поскольку профилактика и своевременная коррекция эффектов неблагоприятных вариантов генов обеспечивает нормальное протекание беременности. Клиентки, обследованные нами год назад и ранее, успешно родили детей, у многих беременность на поздних сроках, что также позволяет надеяться на успешное рождение младенцев.
Заключение
Разработанные в лаборатории методы молекулярно-генетического анализа успешно используются в Республиканском центре ДНК-биотехнологий для оказания услуг населению. К нам обращаются за «генетическими паспортами» не только граждане Беларуси, но и жители России, Украины, Латвии, Германии, США. Чаще всего их интересуют риски развития описанных выше заболеваний. Кроме того, очень востребованной является ДНК-диагностика нарушений беременности.
%
2
IС уммд частот генов риска, встречающиеся совместно I Сумма частот генов риска, встречающихся порознь Рис. 9. Распределение частот встречаемости комбинаций генотипов, связанных с невынашиванием беременности
Полученные нами результаты ДНК-анализа используются в учреждениях Министерства здравоохранения Беларуси, поскольку они позволяют проводить не только раннюю диагностику заболеваний, но и профилактику осложнений и повторных случаев, а также корректно выбирать методы лечения.
Генетическая диагностика является необходимым этапом персональной и превентивной медицины. Именно генетика должна стать основой профилактики и лечения заболеваний. Преимущество генетической диагностики заключается в том, что она дает возможность выявить склонность к тому или иному заболеванию задолго до его клинических проявлений, вовремя принять профилактические меры, предотвратив развитие или облегчив течение заболевания, и применять терапию с учетом индивидуальных особенностей человека.
Таким образом, молекулярно-генетическое тестирование позволяет снизить инвалидиза-цию и смертность населения, в значительной мере повысить качество и продолжительность жизни пациентов, а также сократить расходы государства на их лечение.
Список использованных источников
1. Hong, S.H. Genotype Distribution of the Mutations in the Coagulation Factor V Gene in the Korean Population: Absence of Its Association with Coronary Artery Disease / S.H. Hong // Korean J Biol Sci. - 2003. - Vol. 7. - P. 255-259.
2. Гусина, A.A. Роль мутаций фактора II и фактора V свёртывания крови в развитии венозных тромбозов у жителей Республики Беларусь / A.A. Гусина // Медицинские новости. - 2007. - Т. 5. - С. 85-88.
3. The frequencies of mutations in Factor V (FV Leiden), Prothrombin (G20210A) and 5,10-methylentetrahydrofolate reductase (C677T) genes in Russian [In Russian] / E.A. Kalashnikova [et al.] // Medicinskaya Geneti-ka. - 2006. - Vol. 7. - P. 68-72.
4. Rodeghiero, F. Activated protein C resistance and factor V Leiden mutation are independent risk factors for venous thromboembolism / F. Rodeghiero, A. Tosetto // Ann Intern Med. -1999. - Vol. 130. - P. 643-650.
5. Гончар, А.Л. Роль генетических факторов в развитии инфаркта миокарда (гендерные и возрастные аспекты) / А.Л. Гончар, И.Б. Моссэ // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. - Минск, 2013. - Т. 15. - С. 7-15.
6. Вклад генов PAI-1 (ингибитора активатора плазминогена) и LDLR (гена рецептора липопротена низкой плотности) в комплекс экологических и генетических факторов, приводящих к инфаркту миокарда / И.Б. Моссэ [и др.] // Наугад пращ. - Т. 169. Вип. 157. - Техногенна безпека. - Миколшв: Вид-во ЧДУ iм. Петра Могили, 2011. -С. 49-55.
7. Сравнение популяционных частот генетических факторов риска инфаркта миокарда с уровнями этого заболевания в разных странах Европы / И.Б. Моссэ [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. - Минск, 2010. - Т. 11. - С. 45-54.
8. Molecular-genetic analysis of genetic predisposition to myocardial infarction and comparison of risk factor population rates in different countries / M. Gonchar // Radiobiology and Environmental Security. - Springer, 2011. - P. 111-126.
9. Zimmet, P. Preventing type 2 diabetes and the dysmetabolic syndrome in the real world: a realistic view / P. Zimmet // Diabetic. medicine. - 2003. - Vol. 20, № 9. - P. 693-702.
10. Генетические факторы риска развития метаболического синдрома / М.Д. Амельянович [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. - Минск, 2013. - Т. 16. - С. 24-31.
11. Association of VDR BsmI gene polymorphism, bone turnover markers and bone mineral density in severe postmenopausal osteoporosis / M. Tamulaitiene [et al.] // Gerontologija. -2012. - Vol. 13 (4). P. 206-213.
12. Association Between Polymorphisms of VDR, COL1A1, and LCT genes and bone mineral density in Belarusian women with severe postmenopausal osteoporosis / P. Marozik [et al.] // Medicina (Kaunas). - 2013. - Vol. 49 (4). - P. 177-184.
13. Correlation between genetic and biochemical markers in Belarussian women with osteoporosis / P. Marozik [et al.] // Osteoporos Int (2014) 24 (Suppl 1). - P. 176.
14. Alpha-fibrinogen Thr312Ala polymorphism and venous thromboembolism / A.M. Carter [et al.] // Blood. - 2000. - Vol. 96. -P. 1177-1179.
15. Ассоциация наследственный факторов тромбофилии с невынашиванием беременности у женщин в русской популяции: отчет о НИР / ГУ Медико-генетический научный центр РАМН; Е.А.Калашникова, С.Н Кокаровцева. - Москва, 2005. - 3 с. -№ ГР 115478.
16. P05121 (PAI1_HUMAN) [Electronic resource] // The Universal Protein Resource (Uni-Prot). - 2014. - Mode of access: http://www. uniprot.org/uniprot/P05121. - Date of access: 17.03.2014.
17. Endothelial nitric oxide synthase gene (NOS3) variant and hypertension in pregnancy [Electronic resource] // The National Center for Biotechnology Information. - 2001. -Mode of access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/?term=11745998. - Date of access: 18.03.2014.
18. NOS3 nitric oxide synthase 3 // The National Center for Biotechnology Information. [Electronic resource]. - 2014. - Mode of access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4846. - Date of access: 17.03.2014.
19. Метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR) [Электронный ресурс] // Helix. - 2014. - Режим доступа: http://www. helix.ru/kb/item/18-019. - Дата доступа: 18.03.2014.
20. Бескоровайная, Т.С. Влияние некоторых генетических факторов на нарушение репродукции у человека: дис. канд. мед. наук. - М., 2005. - 89 с.
21. Метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR) - (Glu429Ala) [Электронный ресурс] // Helix. - 2014. - Режим доступа: http://www.helix.ru/kb/item/18-008. - Дата доступа: 18.03.2014.
Дата поступления статьи 28 августа 2014 г.
