CC BY
56
генетика популяций и эволюция
© Е. м. Чекунова, Н. В. Савельева
Кафедра генетики и селекции биолого-почвенного факультета СПбГУ, Санкт-Петербург
Ш Генетический контроль светонезависимых процессов формирования пигментов в растительной клетке изучали на модели мутантов по гену LTS3 одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii, у которых темновой биосинтез хлорофилла нарушен на этапе, предшествующем конверсии протохлорофиллида в хлорофиллид. В условиях гетеротрофного роста эти мутанты не синтезируют хлорофилл и накапливают протопорфирины, а при переносе на свет — зеленеют. Фенотипическое проявление мутаций в гене LTS3 изучено на уровне пигментного состава, активности ферментов биосинтеза хлорофилла и экспрессии генов, кодирующих эти ферменты. Осуществлено позиционное клонирование гена LTS3, и установлено, что он кодирует фактор транскрипции семейства GATA, который в темноте активирует экспрессию генов, кодирующих ферменты биосинтеза хлорофилла: магний-хелатазу и глутамат 1-полуальдегид аминотрансферазу, и, по-видимому, необходим для адаптации фотосинтезирующей клетки к фототрофным условиям.
Ш Ключевые слова: генетический контроль; темновой биосинтез хлорофилла.
Поступила в редакцию 20.11.2009 Принята к публикации 31.03.2010
УДК 575.2:581.132.1
ГЕН LTS3 КОНТРОЛИРУЕТ СВЕТОНЕЗАВИСИМЫЙ БИОСИНТЕЗ ХЛОРОФИЛЛА У ЗЕЛЕНОЙ ВОДОРОСЛИ CHLAMYDOMONAS ЯЕШНАЯйТИ
ВВЕДЕНИЕ
Растения и фототрофные микроорганизмы могут синтезировать хлорофилл двумя путями — на свету и в темноте (рис. 1). Известно, что эту способность определяют две ферментные системы, катализирующие превращение протохлорофиллида (ПХЛД) в хлорофиллид (ХЛД) в процессе биосинтеза пигмента (Reinbothe, Reinbothe, 1996; Forreiter, Apel, 1993). На свету редукцию ПХЛД обеспечивает фотофермент НАДФ: протохлорофиллид-оксидоре-дуктаза (сПОР), контролируемый ядерным геномом (Беляева, 2009). Темновой синтез ХЛД из ПХЛД осуществляет ферментный комплекс тПОР, — он состоит из трех полипептидов, кодируемых хлоропластными генами: chlB, chlN и chlL. Светозависимый и светонезависимый биосинтез хлорофилла сосуществуют у многих организмов, включая цианобактерии, водоросли и голосеменные (Armstrong, 1998). Покрытосеменные растения не способны зеленеть в темноте в результате утраты тПОР, тогда как большинство групп эубактерий (Eubacteriophyta) — древних фотосинтезирующих организмов, образуют хлорофилл исключительно светонезависимым путем.
Одноклеточная зелёная водоросль Chlamydomonas reinhardtii — уникальный модельный объект генетики фотосинтеза (Rochaix, 1995). Её клетки синтезируют хлорофилл на свету и в гетеротрофных условиях, используя в качестве источника углерода ацетат натрия. Такая способность позволяет получать мутанты по обоим путям биосинтеза: темновому и индуцируемому светом (Ford et al., 1981; Choquet et al., 1992). В течение последних 50 лет у зеленых водорослей: Chlamydomonas, Chlorella и Scenedesmus были изолированы и изучены десятки мутантов с нарушенным светонезависимым синтезом хлорофилла — неспособные зеленеть в темноте (Александрова и др., 1979; Квитко и др., 1983; Timko, 1998). Все они могут быть отнесены к одному фенотипическому классу, называемому «yellow». В темноте их клетки не синтезируют хлорофилл, накапливают ПХЛД, и, благодаря присутствию каротиноидов, формируют колонии желтого цвета; на свету они зеленеют. У хламидомонады известно 3 хлороплас-тных и 7 ядерных генов, нарушения в которых приводят к подобному фенотипу (Timko, 1998). Хлоропластные гены: chlB, chlN и chlL кодируют субъединицы фермента тПОР (Choquet et al, 1992), роль же ядерных генов yellow до сих пор остается предметом дискуссий. Полагают, что они кодируют белки, регулирующие темновую редукцию ПХЛД (Cahoon, Timko, 2000).
Среди штаммов, зеленеющих на свету, но неспособных синтезировать хлорофилл в темноте, у хламидомонады наряду с «yellow» были описаны мутанты, клетки которых в темноте накапливают более ранние, чем ПХЛД, красные предшественники хлорофилла — протопорфирины (ПП) и на твердой среде формируют колонии оранжевого цвета. Сравнительно-генетический анализ трех таких фенотипически сходных мутантов (бесхлорофильные, накапливаю-
щие ПП в темноте, зеленеющие на свету) из Петергофской генетической коллекции (Столбова, 1971; Квитко и др., 1983) показал, что у них мутации затрагивают один ядерный ген, названный LTS3 (Чекунова, Квитко, 1986). Подобные мутанты: brc-1 и brc-2 были описаны в США Энди Вангом (Wang et al., 1974) как штаммы, несущие рецессивные, аллельные мутации, которые генетически и функционально отличаются от мутации y-1, блокирующей темновое превращение ПХЛД. Поскольку двойной мутант генотипа: brc-1, y-1 имел фенотип штамма brc-1, автор предположил, что локус «Brc» контролирует более ранний, чем конверсия ПХЛД, шаг биосинтетического пути. Сходные данные были получены и в России при анализе взаимодействия мутаций: lts3 и y-1, а в результате функционального и рекомбинационного тестов была установлена аллельность мутаций lts3 и brc-1 (Шалыго и др., 1990). Таким образом, генетический анализ позволил обнаружить у хламидомонады ген LTS3, контролирующий темновой биосинтез хлорофилла на этапе, предшествующем конверсии протохлорофиллида в хлорофиллид. Существование накапливающих протопорфирины мутантов, способных зеленеть в условиях фотоавтотрофного роста, свидетельствует, что редукция ПХЛД — не единственный шаг в цепи биосинтеза хлорофилла, реализация которого зависит от света. Ген LTS3 уникален, и изучение мутантов по этому гену, его идентификация и клонирование открывают возможность понять неизвестные к настоящему времени генетические механизмы наиболее древнего в эволюционном отношении темнового синтеза хлорофилла. Настоящая работа посвящена комплексному молеку-лярно-генетическому анализу штаммов Chlamydomonas reinhardtii, мутантных по гену LTS3.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клетки штамма дикого типа (СС124) и мутантов хламидомонады (Chlamydomonas reinhardtii) из Петергофской генетической коллекции и из коллекции генетического центра хламидомонады (Chlamydomonas Genetic Collection — CGC) выращивали на среде ТАР в жидкой культуре или на чашках Петри (1,5 % агара) при температуре 24 °С на белом свету интенсивностью 60 mmol m2 sec-1 (флуоресцентные лампы Osram L36W/25) или в темноте (Квитко и др., 1983; Harris, 1989). Скрещивания и тетрадный анализ потомства зигот проводили по методу, описанному А. В. Столбовой (Столбова, 1971). Хлорофиллы из клеток хламидомонады извлекали 80%-м ацетоном, и их содержание в растворе определяли по оптической плотности при длинах волн: 646 и 664 нм (Шалыго и др., 1990). Для флуоресцентной детекции протопорфирина IX (ПП), магний-протопорфирина IX (М§ПП) и его монометилового эфира (М§ППМЭ) в отмытых гексаном водно-ацетоновых экстрактах использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию (Chekounova et al., 2001). Измерения содержания гема и 5-аминолевулиновой кислоты в клет-
ках хламидомонады проводили ранее описанным методом (Чекунова и др., 1993). Определение активности ферментов, методы экстракции РНК и Нозерн-блот анализа, также как и методика экстракции белков и Вестерн-блот анализа, подробно описаны ранее (Chekounova et al., 2001). Эксперименты по определению количественных величин (уровня содержания пигментов и активности ферментов) проводились в 3-5 повторностях, полученные данные обрабатывались статистически (Терентьев и Ростова, 1977). Время генерации культур (ВГ) рассчитывали по формуле: ВГ (час.) = 11 + 0,75 ВД, где ВД — время удвоения численности клеток в культуре (Harris, 1989). Клоны геномной библиотеки BAC-клонов Chlamydomonas reinhardtii получены из ресурсного центра Института генетики Университета г. Клемсон (CUGI, USA) http://www.genome. clemson.edu. ДНК BAC-клонов, содержащая маркерный ген устойчивости к хлорамфениколу, была использована для трансформации мутантных клеток методом «стеклянных шариков» (Rymarquis et al., 2005). Трансформированные клетки высевали на среду ТАР и выращивали в темноте при 24 °С. Зеленые в темноте трансформанты проверялись на устойчивость к хлорамфениколу. Нуклео-тидные последовательности гена LTS3 были найдены в базе данных геномного проекта (Merchant et al., 2007), а их анализ проводили с помощью программного обеспечения, доступного на сайтах: NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih. gov), ExPAZy (http://www.expasy.ch/tools) и CGC (http:// www.chlamy.org/index.html).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Содержание пигментов
Сравнительный анализ пигментного состава клеток мутантов по темновому биосинтезу хлорофилла: lts3, brc-1, y-7 и штамма дикого типа СС124 (табл.1) позволил обнаружить существенные различия в содержании предшественников хлорофилла у мутанта yellow и штаммов, мутантных по гену LTS3. Клетки «желтого» мутанта y-7 при росте в темноте не содержат хлорофилла и накапливают только протохлоро-филлид, что указывает на блокирование процесса превращения ПХЛД в ХЛД. В условиях постоянного освещения, по пигментному составу они практически не отличаются от штамма дикого типа СС124. Мутанты по гену LTS3 : lts3 и brc-1 в темноте накапливают протопорфирин IX (ПП) и последующие в цепи биосинтеза хлорофилла пигменты: магний-протопорфирин IX (Mg-ПП), магний-протопорфи-рин IX монометиловый эфир (Mg-ППМЭ) и ПХЛД. При освещении, в их культурах появляется ХЛД, что указывает на дестабилизацию комплекса ферментов, осуществляющих превращение ПХЛД в хлорофилл, поскольку в норме этот промежуточный продукт не накапливается. Клетки световых культур мутантов: lts3 и brc-1 синтезируют хлорофилл на уровне штамма дикого типа, выращенного в темноте, и, примерно, на 40 % ниже, чем клетки световой культуры СС124. Содержание гема в гетеротрофных условиях
выращивания у мутантов оказалось вдвое выше, чем у дикого типа. По-видимому, в результате мутаций: lts3 и Ьгс-1 в темноте происходят нарушения в цепи биосинтетических реакций превращения ПП в хлорофилл (ХЛ), которые ведут к накоплению его промежуточных продуктов. Повышение уровня гема у мутантов может быть обусловлено наличием в их клетках свободных молекул ПП, которые, не будучи задействованы синтезе хлорофилла (рис. 1), участвуют в образовании гема.
Активность ферментов биосинтеза хлорофилла
Анализ эффективности работы трех ферментов биосинтеза хлорофилла: магний-хелатазы, магний-прото-порфирин 1Х-метилтрансферазы и АЛК-синтезирующего комплекса (табл. 2) позволил установить, что у мутанта
активности двух сопряженно функционирующих ферментов: магний-хелатазы и магний-протопорфирин IX-метил-трансферазы практически одинаковы на свету и в темноте и соответствуют нормальному уровню штамма дикого типа, выращенного в темноте. Магний-хелатаза в темноте у мутанта функционирует также как и у дикого типа, а на свету, — примерно на 40 % слабее. Активность метил-трансферазы в темновых культурах мутанта на 20 % выше, чем у штамма дикого типа, и не увеличивается при освещении, тогда как у дикого типа свет активирует этот фермент на 30 %. Таким образом, у мутанта по гену LTS3 отсутствует световая индукция Mg-хелатазы и Mg-ПП метил-трансферазы, типичная для клеток дикого типа. Относительная активность ферментов, синтезирующих 5-аминолевулиновую кислоту (АЛК) — общий
Таблица 1
содержание хлорофилла и его предшественников
Штамм Условия Генотип Содержание пигментов (пМо1/109 клеток)#
ПП Mgnn MgППМЭ ПХЛД ХЛД ХЛ Гем
CC124 свет wt 0,19 0,20 0,18 н н 3680 **
lts3 свет lts3 0,41 0,54 0,56 н 89-529* 2450 **
brc-1 свет brcl 0,37 0,67 0,39 н 54-385* 2100 **
У-7 свет У-7 0,2 н н н н 3280 -
CC124 темнота wt 0,3 0,20 0,08 0,8 н 2350 47
lts3 темнота lts3 12,0 0,77 0,62 - н 187 94
brc-1 темнота brcl 14,0 0,54 0,82 17,0 н 85 82
У-7 темнота У-7 0,43 н н 42,0 н н -
Примечания. # — в таблице представлены средние значения величин, полученных в 3—6 повторностях. Во всех случаях ошибки измерений не превышают 5 %. Условные обозначения: ПП — протопорфирин IX, М£ПП — магний-протопорфирин IX, М£-ППМЭ — магний-протопорфирин IX монометиловый эфир, ПХЛД — протохлорофиллид, ХЛД — хлорофиллид, ХЛ — хлорофиллы (а + Ь); н — наличие пигмента не регистрируется; « — » — измерения не проводились; * — содержание пигмента измеряли в условиях переноса культуры из темноты на свет, так как при постоянном освещении протохлорофиллид не накапливается; ** — содержание гема измеряли в культурах клеток, растущих в темноте, так как на свету он практически не накапливается.
Таблица 2
Активность ферментов биосинтеза хлорофилла
Штамм, условия культивирования Генотип Активность ферментов:
Mg-хелатаза (fkat/g ) Mgnn-метил-трансфераза (mkat/g) АЛК *
СС124 (свет) wt 144 ± 4,8 3,5 ± 0,11 100 %
^3 (свет) lts3 107 ± 3,2 3,2 ± 0,06 91 %
СС124 (темнота) wt 90 ± 4,1 2,7 ± 0,08 60 %
^3 (темнота) lts3 90 ± 3,1 3,3 ± 0,07 7 %
*АЛК — относительная активность ферментов, синтезирующих 5-аминолевулиновую кислоту, определяется количеством АЛК, которое накапливают клетки при их обработке сублетальными (4 тМ) дозами ее конкурентного ингибитора — левулиновой кислоты.
38
генетика популяций и эволюция
предшественник биосинтезов хлорофилла и гема у этих мутантов в отсутствие света значительно снижена и составляет 4—7 % от нормы. Подобный эффект описан и для мутантов yellow (Wang et al., 1974). В обоих случаях, эти данные можно объяснить наличием в клетках мутантов протохлорофиллида — ретроингибитора синтеза АЛК (Timko, 1998; Armstrong, 1998).
Зеленение мутантов: y-7, brc-1 и lts3
Зеленение — индуцированный светом процесс биосинтеза хлорофилла, характерный для покрытосеменных растений, изучали у бесхлорофильных в темноте мутантов хламидомонады: lts3, brc-1 и y-7, измеряя содержание пигмента в их клетках каждые два часа после перенесения культур из темноты на свет (рис. 2а). В течение первых 8 часов после освещения выращенных в темноте штаммов, ресинтез хлорофилла наблюдался только у мутанта y-7. Хлорофилл появляется в его клетках после 4 часов пребывания на свету и его содержание быстро увеличивается, достигая за сутки 90 % от уровня, обычного для световой культуры. Динамика накопления пигмента у мутантов brc-1 и lts3 оказалась иной. Их клетки, выращенные в темноте, содержат около 8 % хлорофилла. После освещения этот уровень несколько снижается, вместе с уменьшением уровня ПП (Wang et al., 1974), а затем начинает медленно возрастать после 48 часов пребывания на свету в культурах штамма lts3 и 72 часов — у brc-1. Далее, кинетика синтеза хлорофилла становиться сходной с таковой у клеток y-7. Таким образом, для мутантов, накапливающих ПП в темноте, характерна задержка индуцированного светом синтеза хлорофилла. Учитывая, что в этих условиях время одной генерации для штаммов: y-7, lts3 и brc-1 составляет 20, 23 и 27 часов, соответственно, очевидно, что свет активирует синтез хлорофилла у мутантов по гену LTS3 только после первого деления — уже во вновь образованных в условиях освещения клетках (рис. 2а).
При перемещении в темноту световых культур, кинетика снижения содержания хлорофиллов у изучаемых штаммов схожа: в течение первых 12 часов темноты их уровень практически достигает значений, характерных для темно-вых культур (рис. 2б). По-видимому, прекращение свето-зависимого синтеза хлорофилла в гетеротрофных условиях происходит одинаково у мутантов и штамма дикого типа, и анализируемые мутации не влияют на этот процесс.
Экспрессия генов, контролирующих биосинтез хлорофилла
Результаты изучения транскрипционной активности генов, кодирующих ферменты ранних этапов синтеза хлорофилла: глутамил-тРНК редуктазы (GTR ), глутамат 1-по-луальдегид аминотрансферазы (GSA), АЛК-дегидратазы (ALAD) и магний-хелатазы (CHLH, CHLD и CHLI) в культурах мутантов и штамма дикого типа, растущих в разных условиях освещения, представлены на рисунке 3a. В отли-
Рис. 1. Генетический контроль биосинтеза хлорофилла у хламидомонады.
На схеме строчными буквами указаны мутации, блокирующие отдельные этапы биосинтеза хлорофилла; курсивом обозначены гены. Хлоропластные гены: глу-таминовой тРНК — trnE и субъединиц темновой ПОР: chlB, chlL, chlN(в рамке); и ядерные гены, кодирующие ферменты биосинтеза: GluTR — Glu-тРНК-редуктазу; GSA — глутамат 1-полуальдегид аминотрансферазу, ALAD — АЛК-дегидратазу, CPOX — копропорфирино-ген III-оксидазу, PPOX — протопорфириноген IX-окси-дазу; субъединицы магний-хелатазы — CHLH, CHLD, CHLI (в рамке); POR — светозависимую НАДФ: про-тохлорофиллид-оксидоредуктазу; CAO — хлорофилл/ хлорофиллид-оксидоредуктазу.
чие от дикого типа, у выращенного гетеротрофно мутанта не удается обнаружить транскрипты генов: С5Л, СНЬИ, СИЬ1 и CHLD, а у штамма у-7 их уровень снижен. Перенос на свет темновых культур, в норме (штамм СС124) уже через 1,5—2 часа вызывает индукцию экспрессии этих генов, которая к четырем часам достигает максимума. Для мутантов же характерна временная задержка активации транскрипции (у штамма у-7 она составляет примерно 1—2 часа, тогда как у — более 2 часов). Уровень экспрессии анализируемых генов в световых культурах му-
ГЕНЕТИКА ПОПУЛяЦИЙИ ЭВОЛЮЦИИ
39
танта сходен с таковым у штамма дикого типа, а в случае генов: GTR, СНЬН и CHLD, — превышает его. Динамика синтеза белков большой (Н) и малой (I) субъединиц маг-ний-хелатазы у штамма дикого типа и мутанта (рис. 3б) соответствует динамике накопления мРНК этих генов, свидетельствуя, что регуляция их экспрессии происходит на уровне транскрипции. Таким образом, у неспособных синтезировать хлорофилл в темноте мутантов хламидомонады
(Из3 и у-7) транскрипция ядерных генов, кодирующих ферменты биосинтеза хлорофилла, в темноте репрессирована как у большинства покрытосеменных растений.
Картирование гена LTS3
Для локализации LTS3 на генетической карте СШа-mydomonas reinhardtii мы скрещивали мутанты по этому гену с маркерами различных групп сцепления (ГЦ) и
б
время (час)
120
Рис. 2. Динамика накопления хлорофиллов в культуре клеток мутантов и дикого типа при изменении условий освещенности.
Выращенные в темноте (ПТ) клетки были перемещены на свет (2а). Культуры, выращенные при постоянном освещении (ПС) перемещены в темноту (2б). Длительность освещения указана в часах. Содержание хлорофиллов дано в (рМ х 109 клеток).
а СС124
lts3
у-7
б
Свет (часы): Свет (часви: Свет (часы):
ПТ 1 2 4 6 ПС ПТ 1 2 4 6 ПС ПТ 1 2 4 6 ПС.
1 фф GTR [
GSA 1 • • -
_
ALAD •••• LX.a * 111
СНЬН 1 • тЩЩ т •
CHLI • • •
- О CHLD т •
Rbcs2
швшш
Рис. 3. Транскрипция генов, контролирующих биосинтез хлорофилла у мутантов с нарушениями темнового синтеза хлорофилла (3а). Аликвоты (10 мкг) тотальных РНК, выделенных из штамма дикого типа СС124 и мутантов: и у-7, были использованы для Нозерн-блот гибридизации, которую осуществляли с фрагментами кДНК анализируемых генов. Уровень транскрипции этих генов определяли в культурах, выращенных в темноте (ПТ), на свету (ПС) и в условиях освещения растущих в темноте культур. В качестве контроля использованы пробы к гену малой субъединицы рибулозо-бифосфат карбоксилазы — НЬс$2. Вестерн-блот анализ (3б).
Аликвоты белков (20 мкг), выделенных из клеток штамма дикого типа (СС124) и мутанта ^3 при освещении (час.) выращенных в темноте (ПТ) культур, разделяли в 8 % ПААГ в присутствии SDS. Для иммуноблоттинга использовали поли-клональные антитела к белкам хламидомонады: СНЬН и СНЫ — субъединицам магний-хелатазы, и CGE1 — ко-шапе-рону HSP70А (контроль), которые детектировали методом хемолюминисценции (ЕСЬ, Ате^ат).
анализировали потомство методом тетрадного анализа. Ранее полученные данные (Чекунова, Квитко, 1986), указывали на независимое наследование мутации lts3 и маркеров VI, X и XI ГЦ и ее слабом сцеплении с дис-тальным маркером msr1 первой ГЦ (29Р:7№30Т), далее именуемой хромосомой. Картирование гена LTS3 было осуществлено по результатам тетрадного анализа расщеплений в потомстве скрещиваний мутанта на штаммы-маркеры правого плеча хромосомы I (табл. 3). Оценки их сцепления позволили локализовать ген LTS3 в хромосоме I хламидомонады на расстоянии 0,34 сМ от маркера ас115, в 28—30 сМ от центромеры (рис. 4а).
Позиционное клонирование гена LTS3
Поиск гена LTS3 в геноме Chlamydomonas ггМагйШ был осуществлен методами позиционного клонирования и «геномной комплементации», применение которых возможно в случае известной локализации искомого гена на генетической карте объекта. Метод состоит в использовании фрагментов геномной ДНК из штамма дикого типа в составе библиотеки ВАС-клонов для трансформации му-тантных культур (Rymarquis et а1., 2005). У трансформантов, имеющих фенотип дикого типа, компенсация мутант-ной аллели происходит за счет привнесенного фрагмента ДНК, который затем служит предметом поиска гена интереса. Практически все фрагменты ДНК из геномной библиотеки ВАС-клонов хламидомонады имеют «привязку» к конкретным участкам генетической и физической карт Chlamydomonas лгinhanitii, и, зная положение гена на этих картах, можно подобрать клоны, которые с большой долей вероятности содержат фрагмент ДНК, соответствующий искомому участку хромосомы. Мы картировали ген LTS3 в группе сцепления I, и в базе данных геномного проекта хламидомонады (http://genome.jgi-psf.org/ СЫге3/СЫге3^оте.Мт1) провели поиск ВАС-клонов, которые могут нести ДНК участка хромосомы I, содержащего ген LTS3. Для экспериментов по трансформации были выбраны 25 клонов (табл. 4), суммарно перекрыва-
ющих (по геномной ДНК) область вероятной локализации LTS3 длиной ок. 1850 тпн приблизительно равную 15 сМ (рис. 4а).
Зеленые в темноте устойчивые к хлорамфениколу трансформанты были получены только в экспериментах, где в качестве трансформируемого материала использовали геномную ДНК двух BAC-клонов: PTQ9626 и PTQ 4402. Частоты их появления оказались сходными при трансформации мутантов BAC-ДНК обоих клонов и в среднем составили 0,7 * 10-7 и 1,4 * 10-7 для мутантов brc-1 и lts3, соответственно.
Поскольку два BAC-клона, ДНК которых компенсировала мутантные аллели гена LTS3, несли перекрывающиеся последовательности, мы предположили, что общий для обоих клонов фрагмент ДНК размером 11900 пн, содержит аллель дикого типа гена LTS3. При сопоставлении нуклеотидных последовательностей геномной ДНК, мРНК и EST-клонов в составе этого фрагмента хромосомы I было обнаружено три гена (рис. 4). В результате анализа рестрикционных карт генов-кандидатов были выбраны эндонуклеазы рестрикции, специфически режущие их ДНК (рис. 4). Далее, мутанты по гену LTS3 трансформировали ДНК BAC-клонов: PTQ9626 и PTQ 4402, обработанные рестриктазами: HindIII, BamH, Pst1, SphI. Отсутствие зеленых в темноте трансформантов было установлено только в экспериментах, в которых использовали BAC-ДНК, порезанную рестриктазой SphI (табл. 5). Эти результаты давали основание предположить, что ген LTS3 на фрагменте ДНК размером 11,9 тпн занимает положение: 9106—10076. Компьютерный анализ структуры этого гена (рис. 4б), и кодируемого им белка (программа PROSITE) выявили наличие в его последовательности ДНК-связывающего цинк-пальцевого домена (рис. 4в), характерного для транскрипционных факторов. Этот белок, в базе данных геномного проекта Chlamydomonas reinhardtii обозначен как: ID 171659 (http://genome.jgi-psf.org/ cgi-bin/dispCeneModel/ Chlre3.home.html).
Пары маркеров P:N:T D Пары маркеров: ген — центромер
(сМ) маркеры PD:ND:T D (сМ)
lts3/arg7 72:2:12 9,3 lts3/pf2* 7:7:18 28,1
lts3/acl4 13:0:7 17,5 lts3/n +1** 6:11:26 30,2
lts3/pab2 173:1:2 1,1 arg7/y-6* 45:0:40 23,5
lts3/ac115 145:0:1 0,3
Примечания. * — pf2 — центромерный маркер группы сцепления XI хламидомонады; y-6 — центромерный маркер группы
сцепления I.
** — Приведены данные по расщеплению трисомика ( + +—) по I группе сцепления Анеуплоидия используется как
центромерный маркер и позволяет оценить расстояние ген-центромер как У частоты тетратипов.
D — расстояние между маркерами, определенное по формуле: D(сМ) = (Ы + 0,5Т)/(Р + N + Т) х 100, где: Р, Ы, Т — родительский дитип, неродительский дитип и тетратип, соответственно.
Таблица 3
результаты тетрадного анализа зигот скрещиваний мутанта с маркерами I группы сцепления Chlamydomonas reinhardtii и центромерными маркерами
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В настоящей работе мутанты хламидомонады по гену LTS3 стали предметом изучения генетической детерминации механизмов темнового биосинтеза хлорофилла (ТБХ) — наименее изученной области исследований процессов хлорофиллобразования. Анализ пигментного состава показал, что мутации: lts3 и brc-1 в этом гене приводят к блокированию ТБХ и накоплению интерме-диатов ранних этапов биосинтеза хлорофилла: ПП, Mg-ПП, Mg-ППМЭ и ПХЛД. На свету, мутанты зеленеют и синтезируют хлорофилл до уровня, характерного для клеток дикого типа, выращенных темноте.
Свет в норме индуцирует ферменты биосинтеза хлорофилла у высших растений на 20—50 %. Их продуктивность у организмов, способных к образованию хлорофилла в темноте и на свету, составляет ок. 60 % и 40 %, соответственно (Reinbothe and Reinbothe 1996; Timko, 1998). Магний-хелатаза и магний-протопорфирин IX метилтрансфераза у мутантов по гену LTS3 утратили способность к активации светом, и эти данные позволили предположить, что продукт гена LTS3 участвует в световой регуляции этих ферментов.
Выращенные в темноте проростки высших растений — желтые. Они имеют недифференцированные пластиды, называемые этиопластами, не синтезируют хлорофилл и накапливают протохлорофиллид. После освещения в их клетках запускается процесс зеленения: активируется экспрессия генов, кодирующих белки, задействованные в процессах фотосинтеза (PRP—photo-synthetic-related proteins), из этиопластов формируются хлоропласты, и образуется хлорофилл (Беляева, 2009; Armstrong, 1998). Клетки дикого типа хламидомонады, растущие гетеротрофно, обладают хорошо развитой системой хлоропластных мембран и способны к образованию хлорофилла. Мутанты yellow подобны этиолированным проросткам высших растений. Выращенные в темноте, их клетки содержат слабо структурированные хлоропластные мембраны и накапливают ПХЛД, а после освещения, синтез хлорофилла, также как и структура тилакоидных мембран у них полностью восстанавливаются в течение 6—8 часов (Li, Timko, 1996). Штаммы хламидомонады brc-1 и lts3 в темноте имеют одинаковое с yellow строение хлоропластных мембран (Wang, 1978; Grimm, личное сообщение). Для ответа на вопрос, сохраняется ли сходство мутантов при освещении, мы изучили процесс их зеленения и показали, что для мутантов по гену LTS3 характерна временная задержка индуцированного светом синтеза хлорофилла. По-видимому, освещение сначала ведет к уменьшению содержания порфириновых интермедиатов, после чего начинается процесс зеленения. Такая последовательность событий, описанная для мутанта brc-1 (Wang et al., 1974), характерна и для мутанта lts3. Очевидно, свет снимает эффект мутаций, — выращенные в тем-
Таблица 4
Клоны из геномной библиотеки BAC-клонов Chlamydomonas reinhardtii
PTQ № клона граница граница размер(тпн)
9626 26m5 1853496 1949182 95689
4402 12c22 1937413 2012699 75286
7079 19m18 2100142 2249357 149215
3828 10h11 2421403 2511909 90506
14544 38p12 2453648 2555787 102176
6480 17p12 2537569 2608200 70631
7247 19n12 2588329 2664468 76179
2380 7g19 2665338 2751600 86262
11174 30k9 2703376 2774837 71461
2769 8a21 2772603 2873176 100573
6797 18j19 2812005 2866622 54617
7911 21n9 2845300 2912365 67065
3158 9k21 2866826 2978807 111981
7156 19h13 2997671 3052605 54934
10208 27p7 3039229 3161492 122263
4727 13m6 3077547 3161505 83956
3288 9p5 3141794 3188241 46447
10734 28120 3188252 3229167 40915
12782 34k4 3280117 3360784 80667
11273 30a12 3391655 3423603 31948
3060 8h22 3391640 3456971 65316
14506 38d4 3407874 3467932 60058
6788 18h17 3473846 3562269 88423
14290 38c21 3563194 3591002 27808
14282 38c19 3587669- 3703690 106021
Примечания. PTQ — нумерация ВАС-клонов в каталоге № клона в библиотеке клонов, представленных на 40 чашках, каждая из которых содержит 384 клона. Нумерация клонов определяется номером чашки, буквенным обозначением ряда (от А до Р) и номером колонки (1 —24). Полужирным шрифтом выделены клоны, содержащие аллель дикого типа гена ЦГБЗ.
ноте мутанты перестают накапливать протопорфирины, и их клетки, вновь образованные в результате деления, становятся способны к синтезу хлорофиллов. На основании этих наблюдений (с учетом результатов изучения активности ферментов) мы предположили, что продукт гена LTS3 может контролировать ферментную систему,
Трансформация мутантов по гену LTS3*
Таблица 5
Рестриктазы Положение сайтов рестрикции на фрагменте ДНК, содержащем аллель дикого типа гена LTS3 Результаты**
HindIII 118, 6228, 11914 +
BamHI 164, 1968, 11010 +
PstI 451,1559,1815, 5804, 7183, 8221,8660 +
SphI 2082, 6458, 7854, 9015, 9256, 10040, 11227 -
* — клетки трансформировали ДНК ВАС клонов: PTQ9626 и PTQ 4402, порезанных указанными рестриктазами; ** — ( + ) — наличие трансформантов дикого типа (зеленых в темноте); ( — ) — их отсутствие.
осуществляющую темновое превращение ПП в ХЛД в той её части, которая регулируется светом. В этой связи возникла необходимость оценить влияние мутации в гене LTS3 на экспрессию генов, кодирующих магний-хелата-зу и другие ферменты биосинтеза хлорофилла.
У покрытосеменных растений гены PRP строго регулируются светом на уровне транскрипции. Уровень их мРНК крайне низок в тканях, культивируемых в темноте, и быстро увеличивается при освещении. У голосеменных, способных к темновому синтезу хлорофилла, такая зависимость выражена слабо. В их клетках мРНК целого ряда генов PRP накапливается в достаточно больших количествах в отсутствие света и лишь слегка увеличивается при переносе растений на свет (Ohad et al., 1967). Методом Нозерн-блот анализа мы показали, что характер экспрессии генов, кодирующих ферменты биосинтеза хлорофилла, отражает динамику синтеза хлорофиллов в процессе зеленения анализируемых культур хламидомонады. Световая индукция транскрипции этих ядерных генов наблюдается как в клетках штамма дикого типа, так и бесхло-рофильных в темноте мутантов. Различия состоят в снижении их экспрессии у мутанта lts3 в темноте и на ранних стадиях зеленения.
Результаты анализа пигментного состава, процесса зеленения и экспрессии генов ферментов биосинтеза хлорофиллов у анализируемых мутантов хламидомонады позволяли предположить, что мутации в гене LTS3 влияют на световую регуляцию клетки, а его продукт в темноте активирует экспрессию ядерных генов, кодирующих магний-хелатазу (CHLH, CHLD и CHLI) и глютамат 1-полуальдегид аминотрансферазу (GSA).
Для поиска гена LTS3 в геноме хламидомонады была выбрана стратегия позиционного клонирования, которая применяется в случаях, когда ген картирован, но неизвестны функции кодируемого им белка. Полученные нами данные о локализации LTS3 были использованы в экспериментах по «геномной комплементации».
MIPGLVPGTFMAPGMAFPEAKRPVPSVPKPRKRASPNGN PPKAPAPNPNGHCCTQCGTQTTPVWRAGPHGPKTLCNA CGVRYMKVAKSGATQPAPRRQQQQHHQ
GATAI - цинк-пальцевый домен
■Со-
программы PROSITE (Database ofprotein domains, families and functional sites)
53-78 CtQCgtqt..TpvWRAgphgPkll Рис. 4.
Идентификация гена LTS3.
а. Генетическое и молекулярное картирование гена LTS3 в геноме хламидомонады. Расстояние между маркерами на фрагменте генетической карты (группа сцепления I) указаны в сантиморганах. Положение маркеров на участке ДНК хромосомы I обозначены порядковым номером нуклеотидов скаффолда I. Фрагменты геномной ДНК из библиотеки BAC-клонов, использованные в работе, перекрывают участок скаффолда 1 (позиции: 1853—3704 тпн). Позиции фрагментов, содержащих аллели дикого типа генов LTS3 и Ac115 указаны курсивом.
б. Область перекрывания ВАС—клонов (фрагмент ДНК размером 1,9 тпн), и структура гена LTS3 (длина — 815 пн, включает 1 интрон (156 пн). На схеме указаны: инициирующий кодон (ATG), стоп-кодон (TGA) и сайт полиаденилирования (TGAA).
в. Структура белка LTS3. Предсказанный белок протяженностью 104 ак, содержит цинк-пальцевый GATA1-домен. «Цинковый палец», расположенный ближе к С-концу молекулы (54 ак — 78 ак), имеет каноническую конфигурацию: Cys-X2-Cys-X17/18 — Cys-X2-Cys, петля которого состоит из 18 аминокислотных остатков. Он узнает консенсусную последовательность ДНК: WGATAR (где W-A/T, а R — A/G).
В результате, в библиотеке BAC-клонов хламидомонады найден фрагмент ДНК, содержащий аллель дикого типа гена LTS3. Анализ структуры гена и аминокислотной последовательности кодируемого им белка позволили установить, что он кодирует транскрипционный фактор семейства GATA. В этой связи, наши предположения о
а
в
функциях белка LTS3 как регулятора транскрипции нашли свое подтверждение, и, по-видимому, фактор транскрипции LTS3 выступает в роли активатора и (или) реп-рессора экспрессии генов: CHLH, CHLD, CHLI и GSA в темноте и на свету, соответственно.
В ходе генетического анализа известных транскрипционных факторов арабидопсиса, принадлежащих к семейству GATA (ДНК-связывающий домен которых содержит «цинковый палец», узнающий мотив: 5'-(A/T) GATA(A/r)-3' в промоторах светозависимых генов), был обнаружен один белок (из 30-ти), принимающий участие в регуляции биосинтеза хлорофилла (Bi et al, 2005). Им оказался фактор GNC (GATA, nitrate-inducible, carbon metabolism-involved), отсутствие которого в результате Т-ДНК инсерции в кодирующем его гене, вызывает редукцию синтеза хлорофиллов. GNC участвует в координации метаболизмов: азота, углерода, и хлорофиллов во время фотоморфогенеза — при переходе от гетеротрофного к фототрофному росту на свету. Выполняет ли белок LTS3 подобные функции у хламидомонады, или его роль сводится к светозависимой регуляции экспрессии генов, контролирующих магний-хелатазу, покажут дальнейшие исследования.
БЛАГОДАРНОСТИ
Автор приносит искреннюю благодарность своим немецким коллегам: проф. К. Беку (Ch. Beck) и проф. Б. Гримму (B. Grimm), за предоставленную возможность выполнения части экспериментов на базе их лабораторий.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ: 09-04-01646а
Литература
1. Александрова Н. Н., Крэла Л. П., Тугаринов В. В, 1979. Генетическая детерминация признаков хлоропласта у хламидомонады. Сообщ. I. Создание множественно-маркированных линий // Исследования по генетике. Вып. 8. С. 139-149.
2. Беляева О. Б., 2009. Светозависимый биосинтез хлорофилла. Москва: Бином. Лаборатория знаний, 232 с.
3. Квитко К. В., Борщевская Т. Н, Чунаев А. С., Тугаринов В. В., 1983. Петергофская генетическая коллекция штаммов зеленых водорослей Chlorella, Scenedesmus, Chlamydomonas // Культивирование коллекционных штаммов водорослей. Л. С. 28-56.
4. Столбова А. В., 1971. Генетический анализ пигментных мутаций Chlamydomonas reinhardtii. Со-общ. I. Идентификация основных пигментов и описание коллекции пигментных форм // Генетика. Т. 7 № 9. С. 90-94.
5. Терентьев П. В., Ростова Н. С., 1977. Практикум по биометрии. Ленинград: ЛГУ. С. 20-34 .
6. Чекунова Е. М., Квитко К. В., 1986. Генетическое изучение мутантов хламидомонады, накапливающих протопорфирин IX // Исследования по генетике. N 10. С. 104-112.
7. Чекунова Е. М., Шалыго Н. В., Яронская Е. Б. и др., 1993. Регуляция биосинтеза предшественников хлорофилла у мутантов зеленой водоросли Chla-mydomonas reinhardtii // Биохимия. Т. 58. Вып. 9. С. 1430-1436.
8. Шалыго Н. В., Чекунова Е. М, Чунаев А. С., Аверина Н. Г, 1990. Анализ состава порфиринов в мутантах Chlamydomonas reinhardtii // Известия АН БССР. Сер. Биол. наук. N4. С. 53-57.
9. Armstrong G. A., 1998. Greening in the dark: Ligth-independent chlorophyll biosynthesis from anoxygenic photosynthetic bacteria to gymnosperms // J. Photochem. Photobiol. B: Biology. Vol. 43. P 87-100.
10. Bi Y. M, Zhang Y, Signorelli T. et al., 2005. Genetic analysis of Arabidopsis GATA transcription factor gene family reveals a nitrate-inducible member important for chlorophyll synthesis and glucose sensitivity // Plant J. Vol. 44(4). P. 680-692.
11. Cahoon A. B., Timko M, 2000. Yellow-in-the-dark mutants of Chlamydomonas lack the CHLL cubunit of light-independent protochlorophyllide reductase // The Plant Cell. Vol. 12. P. 559-568.
12. Chekounova E., Voronetskaya V., Papenbrock J. et al., 2001. Characterization of Chlamydomonas mutants defective in the H subunit of Mg-chelatase // Mol. Gen. Genet. Vol. 266. P. 363-373.
13. Choquet Y., Rahire M., Girard-Bascou J. et al., 1992. A chloroplast gene is required for light-independent accumulation of chlorophyll in Chlamydomonas reinhardtii // J. EMBO. Vol. 11. N 5. P. 1697-1704.
14. Ford C., Mitchell S, Wang W. Y., 1981. Protochlorophyllide photoconversion mutants of Chlamydomonas reinhardtii // Mol. Gen. Genet. Vol. 184. P. 460-464.
15. Forreiter C., Apel K., 1993. Ligth-independent and light-dependant protochlorophyllide-reducing activities and two distinct NADPH-protochlorophyllide oxidoreductase polypeptides in mountain pine (Pinus mugo) // Planta Vol. 190. P. 536-545.
16. Harris E. H, 1989. The Chlamydomonas Sourcebook: a comprehensive guide to biology and laboratory use. — San Diego, California: Academic Press, 780 p.
17. Li J., Timko M. P., 1996. The pc-1 phenotype of Chlamydomonas reinhardtii results from a deletion mutation in the nuclear gene for NADPH protochlorophyllide oxidoreductase // Plant. Mol. Biology. Vol. 30. P. 15-37.
18. Merchant S. S, Prochnik S. E., Vallon O. et al., 2007. The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions // Science. Vol. 318 (5848). P. 245-250.
19. Ohad I., Siekevitz P., Palade G. E, 1967. Biosynthesis of chloroplast membranes II Plastid differentiation during greening of a dark grown algal mutant (Chla-mydomonas reinhardti) // J. Cell Biology. Vol. 35. P. 553-584.
20. Reinbothe S., Reinbothe C, 1996. The regulation of enzymes involved in chlorophyll biosynthesis // Eur. J. Biochemistry. Vol. 237. P. 323-343.
21. Rochaix J.-D, 1995. Chlamydomonas as the photosynthetic yeast // Annu. Rev. Genet. Vol. 29. P. 209-230.
22. Rymarquis L. A., Handley J. M, Thomas M, Stern D. B., 2005. Beyond complementation. Map-based cloning in Chlamydomonas reinhardtii // Plant Physiol. Vol. 137. P. 557-566.
23. Timko M. P., 1998. Pigment biosynthesis: Chlorophylls, Heme, and Carotenoids // The molecular biology of chloroplast and mitohondria in Chlamydomonas / Eds.: J.-D. Rohaix et al., Kluwer Academic Pabl. P. 377-341.
24. Wang W-Y, Wang W.L, Boynton J. E, Gillham N. E, 1974. Genetic Control of Chlorophyll Biosynthesis in Chlamydomonas. Analysis of mutants at two loci mediating the conversion of protoporthyrin-IX to magnesium-protoporthyrin // J. Cell Biology. Vol. 63. P. 806-823.
LTS3 GENE coNTRoLS LIGHT-INDEPENDENT
chlorophyll biosynthesis in green algae
CHLAMYDOMONAS REINHARDTII
E. M. Chekunova, N. V. Savelieva
■ SuMMARY: The genetic control of light-independent chlorophyll biosynthesis in plant cells has been investigated using Chlamydomonas reinhardtii Lts3-mutants defective in dark chlorophyll biosynthesis on the stage before protochlorophyllide to chlorophyllide conversion. In heterotrophic conditions the mutants are unable to synthesize chlorophyll and accumulate protoporphyrins, after illumination they are greening. The mutants were tested for pigment contents, activity of enzymes and expression of the genes, encoding these enzymes. The LTS3 gene has been identified by positional cloning, and the predicted LTS3 protein appeared to be a GATA transcription factor, which activate the expression of genes encoded chlorophyll biosynthesis enzymes: Mg-chelatase and glutamate 1-semialdehyde aminotransferase in the dark, and possibly, important for adaptation of plant cells for autotrophic conditions.
■ KEY woRDS: genetic control; dark reactions of chlorophyll biosynthesis.
Ф Информация об авторах:
Чекунова Елена Михайловна — СПбГУ, старший научный сотрудник. Университетская набережная 7/9, Санкт-Петербург, 199034, Россия. E-mail: [email protected].
Савельева Наталья Владимировна — СПбГУ, младший научный сотрудник кафедры генетики и селекции биолого-почвенного факультета СПбГУ. Университетская набережная 7/9, Санкт-Петербург, 199034. E-mail: [email protected].
Chekunova Elena Mikhaylovna — senior research fellow. The State University of Saint-Petersburg. Universitetskaya nab., 7/9, St.-Petersburg, Russia. 199034. E-mail: [email protected].
Savelieva Natal'ya Vladimirovna — junior research fellow. The State University of Saint-Petersburg. Universitetskaya nab., 7/9, St.-Petersburg, Russia. 199034. E-mail: [email protected].
