CC BY
31
2.3. ИССЛЕДОВАНИЯ БИОСИСТЕМ И ЖИДКОСТЕЙ
ОПЫТ СОВМЕСТНЫХ РАБОТ ПО ПРИМЕНЕНИЮ МЕТОДА «ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНЫХ ИСКЛЮЧЕНИЙ» ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ПИГМЕНТНОГО СОСТАВА МУТАНТОВ ХЛАМИДОМОНАДЫ С ПОМОЩЬЮ ДВУМЕРНОГО СПЕКТРА ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ А.О. Орлова, В.Г. Маслов, А.С. Чунаев
Введение.
В последнее время значительное внимание уделяется изучению спектральных свойств мутантных штаммов высших растений и водорослей, в частности мутантных штаммов хламидомонады. Это обусловлено тем, что мутантные штаммы хламидомонады являются удобным объектов для изучения процессов биосинтеза пигментов и их регуляции. В данной статье представлены результаты совместных работ ГОИ, СПбГУИТМО и СПбГУ, имеющих своей целью исследовать возможности применения недавно разработанного метода анализа двумерных спектров (метод «последовательных исключений») люминесценции мутантных штаммов хламидомонады для исследования состава и состояния содержащихся в этих штаммах пигментов.
Мутантные штаммы хламидомонады характеризуются различной степенью дезагрегации фотосинтетического аппарата. В ряде случаев дезагрегация фотосинтетического аппарата приводит к появлению в спектре люминесценции клеток мутантного штамма полос нескольких пигментов - биологических предшественников хлорофилла a. При исследовании спектрально-люминесцентных свойств таких объектов in vivo встречаются ситуации, когда отсутствует априорная информация о пигментом составе исследуемого образца. Поэтому при анализе спектров люминесценции таких объектов целесообразно применять специальные математические методы, которые позволяют определять спектрально-люминесцентные свойства компонент смеси при отсутствии априорной информации. В данной работе для анализа двумерных спектров люминесценции (набор спектров люминесценции, зарегистрированных при различных длинах волн возбуждающего света) клеток штаммов хламидомонады был применен разработанный нами ранее метод последовательных исключений [1], позволяющий определять число компонент смеси, спектры люминесценции и спектры возбуждения люминесценции компонент на основе анализа двумерного спектра люминесценции образца.
Нами исследовались спектральные свойства следующих штаммов Chlamydomonas reinhardii: штамма с нормально развитой структурой фотосинтетического аппарата cc-124 и трех типов мутантных штаммов, имеющих мутации различных генов из коллекции БиНИИ СПбГУ: ацетат-зависимый (ac-5) мутантный штамм cc-1677, штамм Н-164 с нарушенным синтезом каротиноидов (lts-1) и штамм Н-19 с нарушенным синтезом хлорофилла a (chl-1) [2]. Спектры люминесценции и возбуждения люминесценции штаммов регистрировались на спектрофлуориметре «Hitachi-650». Поскольку данный спектрофлуориметр не имеет ни цифрового, ни аналогового выходов, спектры регистрировались на бумажную основу, затем зарегистрированные спектры люминесценции сканировались и сохранялись в виде файла в точечном формате (bmp). Оцифровка кривых, соответствующих зарегистрированным спектрам люминесценции, проводилась с помощью программы «Tracer 2.0» [4].
Исследование штамма хламидомонады с нормально развитым фотосинтетическим аппаратом
В данной работе были исследованы спектральные свойства клеток штамма хламидомонады с ненарушенным фотосинтетическим аппаратом (сс-124), который является «диким» типом для всех исследованных здесь мутантных штаммов. Существенным свойством штамма «дикого» типа является то, что, вне независимости от условий освещения при выращивании, у данного штамма наблюдается только люминесценция хлорофилла а. Спектр люминесценции штамма сс-124 (рис.1, кривая 1), выращенного в темноте, характерен для фотосинтезирующих объектов с нормально развитой структурой фотосинтетического аппарата - полоса хлорофилла а занимает свое обычное положение (максимум около 680 нм). В спектре возбуждения люминесценции (рис. 1, кривая 2) присутствует полоса в области 470-500 нм, сложная форма которой обусловлена тем, что в нее вносят вклад как полоса поглощения хлорофилла Ь, так и полоса поглощения в -каротина, и полоса поглощения хлорофилла Ь (650 нм). Наличие этих полос в спектре возбуждения люминесценции хлорофилла а свидетельствует о переносе энергии с данных пигментов на хлорофилл а.
6 -
2 -0 -
/
—I—
350
—I—
450
—I—
500
—I—
600
—I—
750
X нм
Рис. 1. Люминесценция штамма СС-124, 1- спектр люминесценции - длина волны возбуждения (Явозб = 430нм) , 2- спектр возбуждения люминесценции хлорофилла а (длина
волны регистрации люминесценции Ярег = 685 нм).
Как видно из рис. 1, в спектре люминесценции исследованного нами штамма сс-124 (кривая 1) присутствует только одна полоса люминесценции с максимумом 685 нм - полоса хлорофилла а. Однако это еще не означает, что данный объект может рассматриваться как однокомпонентная система, так как, в принципе, могла бы иметь место зависимость положения полосы люминесценции хлорофилла а от длины волны возбуждения, свидетельствующая о гетерогенности хлорофилла а. Для выяснения этого вопроса был проведен анализ спектров люминесценции штамма хламидомонады сс-124 методом последовательных исключений. Спектры люминесценции клеток штамма сс-124 были зарегистрированы в области 580-730 нм при длинах волн возбуждения от 385 до 420 нм.
При определении числа люминесцирующих пигментов штамма сс-124 методом последовательных исключений [1] были получены ортогонализованные векторы, значения норм которых приведены в табл. 1. Из таблицы видно, что норма первого вектора, соответствующего зарегистрированному спектру люминесценции при длине волны возбуждающего света 385 нм, существенно больше значений норм всех остальных векторов. Это свидетельствует о том, что в исследованном штамме присутствует люминесценция только одного пигмента. На рис. 2 для сравнения приведены спектры люми-
несценции штамма, соответствующие первым трем ортогонализованным векторам. Видно, что во всех спектрах наблюдается люминесценция только одного пигмента -хлорофилла а с максимумом люминесценции 685 нм. Следовательно, с точки зрения люминесцентных свойств штамм сс-124 представляет собой однокомпонентную систему, а спектру люминесценции и возбуждения люминесценции этой компоненты соответствуют зарегистрированные спектры штамма сс-124 (рис. 1).
Длина волны возбуждения Нм Номер вектора V', п/п Значение нормы вектора N'
385 1 1.000000е+ 000
400 2 1.488741е - 002
405 3 1.369283е - 002
395 4 1.024798е - 002
410 5 1.006652е - 002
390 6 7.648556е - 003
420 7 6.561237е - 003
415 8 6.002409е - 003
Таблица 1. Значения норм векторов, полученных в результате ортогонализации.
3,5 -.
X нм
Рис. 2. Зарегистрированные спектры люминесценции штамма сс-124, соответствующие первым трем ортогонализованным векторам. 1 - длина волны возбуждения Лвозб = 385 нм, 2 - Лятб = 400 нм, 3 - к, = 405 нм.
Исследование ацетат-зависимого штамма хламидомонады
Нами был исследован мутантный штамм хламидомонады сс-1677, имеющий мутацию гена ас-5. У данного штамма присутствует специфический каротиноид - ^-каротин, который является биосинтетическим предшественником каротиноидов и не встречается у штамма «дикого» типа. В работе были исследованы спектральные свойства штамма сс-1677, выращенного при различных условиях освещения. Зарегистрированный нами спектр люминесценции штамма, выращенного на свету, был тождественен спектру люминесценции штамма «дикого» типа (рис.1). Нами было выяснено, что у данного штамма, выращенного в темноте, наряду с люминесценцией хлорофилла а (~680 нм), присутствуют две полосы люминесценции с максимумами 595 и 635 нм, которые принадлежат биосинтетическим предшественникам хлорофилла а - металлокомплекса протопорфирина и протохло-
рофилла соответственно (рис.3, кривая 1). Наличие в спектре люминесценции полос биосинтетических предшественников хлорофилла а обычно считается признаком структурной недоразвитости фотосинтетического аппарата данных объектов.
В спектре возбуждения люминесценции хлорофилла а (рис. 3, кривая 2) наблюдается слабая полоса хлорофилла Ь (~650 нм), что свидетельствует о переносе энергии с хлорофилла Ь на хлорофилл а. Отсутствие же полосы, принадлежащей ^-каротину (в спектрах поглощения ~380 нм) говорит о том, что перенос энергии от ^-каротина к хлорофиллу а отсутствует.
350 400 450 500 550 600 650 700 750
X нм
Рис. 3. Люминесценция штамма сс-1677, выращенного в темноте. 1 - спектр люминесценции (Лвозб = 430нм); 2 - спектр возбуждения люминесценции (Лрег = 680нм); 3 - спектр возбуждения люминесценции (Л = 635нм); 4 - спектр возбуждения люминесценции (Л = 595нм).
Исследование штамма с нарушенным синтезом каротиноидов (Ш-1)
Следующим объектом исследования в данной работе был штамм хламидомонады, имеющий мутацию гена /£?-1 - штамм Н-164. Одним из основных проявлений мутации данного гена является блок синтеза каротиноидов без накопления их каких либо биосинтетических предшественников. Поэтому, в отличие от штамма сс-1677, данный штамм нежизнеспособен при выращивании на свету.
X нм
Рис. 4. Люминесценция штамма Н-164. 1 - спектр люминесценции (Лвозб = 420нм); 2 -спектр возбуждения люминесценции (Лрег = 672нм); 3 - спектр возбуждения люминесценции (Л = 632нм); 4 - спектр возбуждения люминесценции (Л = 592нм).
В спектре люминесценции штамма Н-164 (рис. 4, кривая 1), выращенного в темноте, наблюдались полосы трех пигментов с максимумами 672 нм, 592 нм и 632 нм. Из сравнения спектров возбуждения люминесценции данных полос (рис. 4) со спектрами возбуждения люминесценции пигментов штамма cc-1677 (рис. 3), видно, что у обоих штаммов наблюдается люминесценция одних и тех же пигментов - хлорофилла а, металлокомплекса протопорфирина и протохлорофилла. Следует отметить, что у данного штамма, по сравнению со штаммом cc-1677, положение максимумов полос люминесценции всех пигментов сдвинуто в коротковолновую сторону, что может свидетельствовать о большей степени дезагрегации фотосинтетического аппарата по сравнению со штаммом cc-1677.
Исследование штамма с нарушенным синтезом хлорофилла a
К данному типу относится мутантный штамм хламидомонады Н-19, у которого синтез хлорофилла блокирован на стадии образования протопорфирина IX (мутация гена chl-1). Были исследованы образцы штамма Н19, выращенные в темноте. В спектре люминесценции этого штамма (рис.5, кривая 1) присутствуют четыре полосы с максимумами 590, 635, 675 и 705 нм. Из сравнения спектра возбуждения люминесценции полосы 595 нм со спектрами возбуждения полос 595 нм (рис.3) и 592 нм (рис.4), обнаруженной нами у штаммов cc-1677 и Н-164, было установлено, что она принадлежит металлокомплексу протопорфирина. Сопоставление данных, приведенных на рисунке 5, со спектрами поглощения и люминесценции, приведенных в [5] показывает, что полосы люминесценции 635 нм и 705 нм принадлежат мономерной форме протопорфирина IX. Полоса 675 нм в спектре люминесценции штамма Н-19 (рис.5) по форме и ширине практически тождественна спектру люминесценции агрегированной формы протопорфирина IX in vitro, которая наблюдалась в бинарных смесях этанол - глицерин в работе [5].
о я
20 -
15 ■
10 -
5 -
0 -
350
—I—
400
—I—
450
—I—
500
—I—
550
—I—
600
—I—
650
—I—
700
—I—
750
—I
800
X нм
Рис. 5. Люминесценция штамма Н-19. 1 - спектр люминесценции (Явозб =430 нм); 2 -спектр возбуждения люминесценции (Ярег = 635нм); 3 - спектр возбуждения люминесценции (Лрег = 675нм); 4 - спектр возбуждения люминесценции (Ярег = 590нм); 5 -спектр возбуждения люминесценции (Лрег =705нм).
Как видно из рис. 5, в спектре люминесценции штамма Н-19 полосы, принадлежащие различным пигментам, также как и соответствующие им спектры возбуждения, достаточно сильно перекрываются друг с другом. Поэтому для определения спектров люминесценции пигментов этого штамма нами был применен метод последовательных исключений. В результате процедуры определения числа компонент смеси были полу-
чены ортогонализованные векторы, значения норм которых приведены в табл. 2. Согласно предложенному нами ранее критерию [3], число компонент смеси („) определяется как максимальный номер ортогонализованного вектора V' (] = 1,..., к ), для значения нормы которого еще одновременно выполняются следующие неравенства:
К'п - N'„+1 > а • (N'„+1 - КП+2),
N'„+1 - N„+2 > N„+2 - N„+3, ( )
где N1, Nn+1, N„+2, N„+3 - значения норм ортогонализованных векторов, соответственно, V', Vи'+1, V'+ 2 и Vи'+3; а - эмпирически подбираемый параметр. Применение этого
критерия для анализа норм ортогонализованных векторов, приведенных в табл. 2, показывает, что у штамма Н-19 присутствуют три люминесцирующих пигмента.
Длина волны возбуждения, Нм Номер вектора V', п/п Значение нормы вектора N'
385 1 1.000000е + 000
445 2 4.194756е - 001
420 3 8.638185е - 002
440 4 3.638268е - 002
380 5 3.418771е - 002
390 6 3.008600е - 002
400 7 2.646303е - 002
395 8 2.411744е - 002
415 9 2.207645 е - 002
410 10 2.059319 е - 002
435 11 1.831226 е - 002
425 12 1.703119 е - 002
405 13 1.658941 е - 002
430 14 1.634511 е - 002
Таблица 2. Значения норм векторов, полученных в результате ортогонализации
Спектры люминесценции пигментов, полученные методом последовательных исключений, приведены на рис. 6-8. Из рисунков видно, что спектры люминесценции агрегированной формы протопорфирина IX (рис.6) и металлокомплекса протопорфирина (рис. 8) оказались существенно больше зашумлены, чем спектр люминесценции мономолекулярной формы протопорфирина IX (рис. 7). Это связано с тем, что во всех спектрах люминесценции клеток штамма, составляющих двумерный спектр люминесценции, преобладала люминесценция мономолекулярного протопорфирина (главный максимум люминесценции 635 нм).
На рис. 9 приведены полученные методом последовательных исключений спектры возбуждения люминесценции пигментов. Полученные спектры возбуждения люминесценции пигментов могут быть сопоставлены со спектрами возбуждения люминесценции штамма Н-19, зарегистрированными при длинах волн 590, 635 и 675 нм, на которых преобладающим является вклад каждой из исследованных форм по отдельности. При сравнении спектров нами было установлено, что они имеют между собой хорошее качественное соответствие.
о о
® Е? «
к
о К ® £
« о н
-0,5
X нм
Рис.6. Спектр люминесценции первого пигмента - агрегированной формы
протопорфирина
о о
я ч:
рр о
К « 2 •
о К <Ц О
я
К
1 -
—I—
550
—I—
600
—I—
650
—I—
700
—I—
750
—I—
800
X нм
Рис.7. Спектр люминесценции второго пигмента - протопорфирина IX
о О
и К
о И я н о
X нм
Рис.8. Спектр люминесценции третьего пигмента - металлокомплекса протопорфирина
о .
х ч
И О
s «
о К
Е fe
о о
Ь
5
2,0 -1,81,61,4 -1,2 -1,00,80,60,40,20,0 -370
-■-1 -А--3
■ч#
—i—1—i—1—i—1—i—1—i—1—i—1—i—1—i—
380 390 400 410 420 430 440 450
X нм
Рис. 9. Спектры возбуждения люминесценции пигментов штамма Н-19, полученные
методом последовательных исключений.
Заключение
В работе впервые in vivo была обнаружена люминесценция металлокомплекса протопорфирина IX (положение главной максимума полосы люминесценции 590 нм). Нами было установлено, что данный пигмент присутствует во всех трех типах исследованных мутантных штаммов. Применение разработанного нами метода последовательных исключений позволило впервые определить полный спектр люминесценции металлокомплекса протопорфирина, а также впервые in vivo определить спектр люминесценции агрегированной формы протопорфирина IX.
Нами продемонстрирована применимость метода последовательных исключений для контроля спектральной гомогенности хлорофилла a у штаммов хламидомонады с нормально развитым фотосинтетическим аппаратом.
Авторы выражают искреннюю благодарность проф. В.М. Золотареву за инициативу постановки данной работы и конструктивное обсуждение полученных результатов.
Литература
1. Орлова А.О. Анализ многокомпонентной смеси по двумерным спектрам люминесценции. // Современные технологии. Труды молодых ученых ИТМО. Под ред. проф. С.А. Козлова. СПб, СПбГИТМО (ТУ), 2001, с.24-31.
2. Квитко К.В., Борщевская Т.Н., Чунаев А.С., Тугаринов В.В. Петергофская генетическая коллекция штаммов зеленых водорослей Chlorella, Scenedesmus, Chlamydomonas. Культивирование коллекционных штаммов водорослей. Л., 1987, с. 28-57.
3. Орлова А.О., Маслов В.Г. Применение метода последовательных исключений для определения люминесцирующих компонент фотосинтезирующих объектов. // Оптический журнал. 2002. Т. 69. №3. С.21-24.
4. «Tracer 2.0», http://www.geocities.com/karolewski/soft.htm
5. Гуринович Г.П. и др. Спектроскопия хлорофилла и родственных соединений. Минск: Наука и техника, 1968. 520 с.
