CC BY
116
ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 577.218
Е. С. Минаева, Ж. М. Залуцкая, А. В. Аникина, Е. В. Ермилова
ВЫБОР РЕФЕРЕНС-ГЕНА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА ГЕННОЙ ЭКСПРЕССИИ В ПРОЦЕССЕ ГАМЕТОГЕНЕЗА ОДНОКЛЕТОЧНОЙ ЗЕЛЕНОЙ ВОДОРОСЛИ СНЬЛМУООМОМЛБ Р.ЕтНЛР.ОТП
Одноклеточная зеленая водоросль Chlamydomonas reinhardtii в настоящее время представляет одну из основных экспериментальных систем для изучения многих фундаментальных проблем современной биологии, включая регуляцию процессов дифференцировки [1]. Дифференцировка вегетативных клеток C. reinhardtii в гаметы, гаметогенез, является первым этапом в жизненном цикле микроорганизма (рис. 1). Инициация гаметогенеза у C. reinhardtii индуцируется голоданием по азоту, что приводит к формированию особой клеточной стадии — стадии прегамет [2]. Прегаметы в отличие от зрелых гамет не способны образовывать пары с гаметами другого типа спаривания. Для завершения процесса дифференцировки прегамет в гаметы необходимо действие второго сигнала — синего света.
Ранее нами была проанализирована активность двух типов транспортных систем аммония: с низким сродством к аммонию (ЬАТБ) и высоким сродством к аммонию (НАТБ) на разных этапах жизненного цикла микроорганизма. В частности, выявлено, что в вегетативных клетках и прегаметах (некомпетентных гаметах) функционально активна только система ЬАТБ, тогда как в гаметах — обе системы — ЬАТБ и НАТБ [3]. Впервые охарактеризованы особенности экспрессии восьми генов из семейства AMT1, кодирующих транспортеры аммония/метиламмония, на разных этапах жизненного цикла микроорганизма. Методом ПЦР в режиме реального времени показано, что световой контроль транскрипции генов AMT1.1, AMT1.2, и AMT1.4 не связан с процессом дифференцировки вегетативных клеток в гаметы. Установлено, что регуляторы гаметогенеза вовлечены в контроль транскрипции одного гена AMT1.5.
Количественный анализ экспрессии генов на уровне транскрипции методом ПЦР в реальном времени предполагает предварительный выбор референс-гена, который используется в качестве контроля при нормализации полученных данных [3-5].
© Е. С. Минаева, Ж. М. Залуцкая, А. В. Аникина, Е. В. Ермилова, 2011
Тетрада
и прорастание
Мейоз Ц синий свет
Зигота
Созревание |
І
Полное слияние клеток
Формирование . зиготы Т
Гаметы
Второй этап гаметогенезе
Прегаметы
\-LRG6 I—РЬої «-Синий свет
Первый этап А А Удаление азота
гаметогенезе І I в темноте
Вегетативные клетки
Митоз
£
Рис. 1. Схема жизненного цикла С. reinhardtii
Экспрессия референс-генов не должна изменяться в условиях эксперимента [6]. Для изучения механизмов светового контроля транспорта аммония в качестве референс-гена нами был выбран ген иВ1, кодирующий убиквитин-лигазу [7]. Однако для корректного сопоставления количественных данных в ряде случаев необходимо использование, по крайней мере, двух референс-генов, особенно когда эффективность амплификации генов интереса и выбранного референс-гена не совпадают [8-10]. Кроме того, по нашим данным, некоторые ингибиторы, например, 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевина, приводили к снижению транскрипции гена иВ1. Это обусловило необходимость поиска нового референс-гена для количественного анализа экспрессии генов в процессе гаметогенеза С. гетЪагйШ.
Материалы и методы исследования
Штаммы и условия культивирования. В работе использовались штаммы С. гетЪагйШ СС-124 (пН1а^1т1-) и 1^6 (1г^6т£-), любезно предоставленные профессорами Э. Харрис (Коллекция Культур СЫатуйотопа$ Университета г. Дюк, США) и К. Беком (Университет г. Фрайбурга, Германия) соответственно. Вегетативные клетки выращивали синхронно в режиме освещения люминесцентными лампами 12 ч свет : 12 ч темнота при 23 °С (освещенность 2000 лк) [11]. Для получения прегамет жидкую культуру синхронно растущих клеток в начале светового периода отмывали средой без азота, ресуспендировали в среде без азота и инкубировали в темноте в течение 24 ч. Гаметы получали из прегамет путем их освещения на протяжении 2 ч (освещенность 2000 лк).
Выделение РНК. Тотальная РНК была выделена из каждого образца с использованием TRIZOL Reagent Invitrogen™ в соответствии с инструкциями производителя. После экстракции пробы РНК были растворены в 20 мкл сверхчистой воды (Тип I), обработанной 0,1% диэтилпирокарбонатом (DEPC). Пробы РНК были обработаны ДНКазой I (Fermentas) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрации РНК до и после обработки ДНКазой I, а также соотношение А260/А280 и А260/А230 были определены спектрофотометром (SmartSpec Bio-Rad). Для анализа использовались образцы с соотношениями: А260/А280 от 1,9 до 2,1 и А260/А230 более 2,0. Оценку качества РНК до и после обработки ДНКазой I проводили с помощью электрофореза в агарозном геле с последующей визуализацией с применением гель-документацион-ной системы BioDoc-It™ Imaging System (UVP).
Проведение обратной транскрипции. кДНК были синтезированы из 2 мкг тотальной РНК с использованием OligodT и обратной транскриптазы SuperScriptIII (Invitro-gen™) в соответствии с инструкциями производителя. Количество синтезированной кДНК определяли спектрофотометром (SmartSpec Bio-Rad).
ПЦР в реальном времени. Реакции ПЦР в реальном времени проводили в оптических стрипованных пробирках для ПЦР в реальном времени (Bio-Rad) c использованием SYBRGreen I (Amersham™) для визуализации синтеза двухцепочечных ДНК. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 2,5 мкл 10х реакционного буфера, 1,25 мкл 0,5 мМ смеси dNTP, 1 мкл смеси прямого и обратного праймеров (10 мкМ, таблица), 1,25 мкл 50 мМ раствора MgCl2, 0,1 мкл HotStart Taq полимеразы (5 е.а./мкл), 1,25 мкл 1х раствора SYBRGreenI в DMSO, 200 нг кДНК. Реакции ПЦР в реальном времени проводили, применяя амплификатор MiniOpticon RealTime PCR System (Bio-Rad), в следующих условиях: 96 °С 5 мин, 40 циклов (96 °С 30 с, 60 °С 30 с, 72 °С 1 мин), 72 °С 5 мин, 4 °С. Каждая реакция ПЦР была проведена в тройном повторе. Для оценки специфичности амплификации с использованием программного обеспечения прибора были сняты кривые плавления продуктов амплификации со следующими параметрами: температура от 65 до 95 °С, шаг 0,2 °С, время удержания 0,5 с.
Праймеры, использованные в работе
Праймер Последовательность (5'-3') Применение
иВ1 прямой иВ1 обратный В.ВС31 прямой В.ВС31 обратный Рй-ОАРВИ прямой Рй-ОАРВИ обратный М1Р1 прямой М1Р1 обратный GTACAGCGGCGGCTAGAGGCAC AGCGTCAGCGGCGGTTGCAGGTATCT GACTACATCGTCGCCAACGG GGT CCAGTAGCGGTTGT CGT CGCATTTAGAGAGCATGGGC ACAGCAACCTCATCCACAAGC GCCGACGTGCACTAGAAACC GGCCCAACCCT CCAT GTTAC ОТ-ПЦР и ПЦР в режиме реального времени
Для ПЦР в реальном времени была использована кДНК, полученная из РНК, выделенной в трех независимых экспериментах.
Определение эффективности реакции и Ct (пороговый цикл). Эффективность амплификации и определение Ct проводили с помощью программного обеспечения Opticon3 (BioRad). Полученные данные использовали далее в Microsoft Excel для анализа экспрессии генов.
1Q1
Относительная количественная оценка уровней экспрессии. Для оценки уровня экспрессии генов интереса применяли показатели ДС и ДДС с геном UBI в качестве референс-гена по формулам (1) и (2)
Уровень экспрессии гена интереса = 2а(™)-а(ген интереса) , (1)
Уровень экспрессии гена интереса =2-ДДа, (2)
где ДДС = ДС (прегаметы или гаметы)-ДС (вегетативные клетки);
ДС = С (ген интереса, прегаметы или гаметы)-С (иБЬ, прегаметы или гаметы).
Результаты исследования
Экспрессия Fd-GAPDH и Р.БСЗ на разных стадиях гаметогенеза. В качестве ре-ференс-генов часто используются гены, кодирующие глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу и малую субъединицу рибулозо-1,5-бис-фосфаткарбоксилазы [8]. Нами были сконструированы праймеры для генов Fd-GAPDH и RBCS1, кодирующих ФАД-зависи-мую глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу и малую субъединицу рибулозо-1,5-бис-фосфаткарбоксилазы соответственно (рис. 2). Для оценки экспрессии этих генов в качестве референс-гена был использован иБ1. Как видно из рис. 3, транскрипция обоих генов контролировалась светом, и в связи с этим они не могут быть использованы как референс-гены при анализе механизмов световой регуляции.
1
! 198 80 86 627 1561
^ I—□-----------О-1
jl 2 3 4 5 6 7 8 91011 12 13 14 15 _^ 16, 9271
ЬШНК]—0---------
ю о го см со s- со s.
О О О Г4* (О 1- N СМ
■Sl- СО CM 4t СМ СО СМ СМ
Рис. 2. Схема расположения экзонов и интронов в генах С. теткатйШ ЯБС81 (а), кодирующем малую субъединицу одного фермента рибуло-зо-1,5-бис-фосфаткарбоксилазы/оксигеназы, и ОАРБН (б), кодирующем глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу
Квадратами обозначены экзоны, заштрихованные участки показывают нетранслируемые последовательности. Локализация праймеров показана стрелками.
Уровень экспрессии CrMIPl в штамме lrg6. При изучении механизмов контроля синтеза и секреции осмолитика глицерина в процессе адаптации C. reinhardtii к действию осмотического стресса мы провели оценку экспрессии гена CrMIPl, который кодирует белок, обнаруживающий идентичность аквапоринам растений из семейства TIP [12]. Полученные нами предварительные данные позволили рассматривать ген CrMIPl в качестве кандидата на референс-ген [13].
Рис. 3. Уровни относительной экспрессии генов Fd-GAPDH (а) и RBCS1 (б) в вегетативных клетках С reinhardtii, выращенных в темноте, и после четырех часов освещения
б
Локализация сконструированных нами праймеров показана на рис. 4. Для исследования механизмов регуляции транспорта/ассимиляции аммония необходим ре-ференс-ген, транскрипция которого не зависит от наличия или отсутствия аммония в среде. В связи с этим для оценки возможного влияния аммония на экспрессию гена в процессе дифференцировки вегетативных клеток в гаметы мы выбрали штамм ^6, который демонстрирует светонезависимый гаметогенез [14]. В отличие от прегамет
,142
180 170
113
-О
3104
253
796
-С
Рис. 4. Схема расположения экзонов и интронов в гене MIP1 €^. reinhardtii (условные обозначения как на рис. 2)
дикого типа, прегаметы ^6-мутанта способны формировать пару с гаметами противоположного типа спаривания и, по сути дела, являются гаметами. Для обозначения этого типа гамет штамма ^6 будем использовать термин «темновые гаметы».
Количественная оценка уровней экспрессии гена CrMIP1 была проведена путем сравнения значений С (номера цикла, на котором флуоресцентный сигнал реакции пересекает порог) для вегетативных клеток, выращенных в среде ТАР, содержащей аммоний, темновых гамет и световых гамет (рис. 5). Для каждого типа клеток РНК была выделена в трех разных экспериментах, концентрация проб нормализована, получена кДНК, и реакция ПЦР в реальном времени проведена с 300 нг кДНК из каждой пробы. Как видно из представленных данных, отличия С в разных типах клеток не превышали 0,5, что соответствует требованиям, предъявляемым к референс-генам. Таким образом, экспрессия CrMIP1 не зависела от присутствия аммония и не изменялась в процессе гаметогенеза мутантного штамма ^6.
СС-124
I I Вегетативные клетки
| Прегаметы
Гаметы
Рис. 5. Транскрипция СгМ1Р1 в клетках мутанта 1^6 и штамма дикого типа СС-124
С — пороговый цикл.
Экспрессия CrMIP1 в ходе гаметогенеза СС-124. Для оценки возможного действия света на транскрипцию гена СгМ1Р1 нами был проанализирован штамм СС-124 со светозависимым гаметогенезом. Сравнение значений а для вегетативных клеток, прегамет и гамет показывает, что различия в значениях а в разных типах клеток также не превышали 0,5 (см. рис. 5).
Стабильность транскрипции CrMIP1. Для оценки стабильности транскрипции гена СгМ1Р1 в процессе гаметогенеза была проведена относительная количественная оценка экспрессии гена интереса с применением иВ1 в качестве гена-нормализатора. Для сопоставления трех типов клеток (вегетативных клеток, прегамет и гамет) использовался показатель Да (рис. 6, а). Из приведенных данных видно, что значения ДСf гена СгМ1Р1, рассчитанные для каждого типа клеток, в ходе гаметогенеза с учетом уровня экспрессии референс-гена иВ1 в каждой пробе, достоверно не отличались.
Дополнительная оценка ДДС£ с использованием вегетативных клеток в качестве контроля подтверждает вывод о независимости от света транскрипции СгМ1Р1 в процессе гаметогенеза. Из рис. 6, б видно, что значения уровней относительной экспрессии
а а
Рис. 6. Уровень относительной экспрессии гена СгМ1Р1 на разных этапах гаметогенеза, рассчитанный с использованием методов ДС (а) и
дда (б)
ю - 10 - I г ■
б дда ,о - : ■ 1 ■
Ш Вегетативные клетки | Прегаметы | Гаметы
гена CrMIP, рассчитанные с помощью метода ААС относительно калибратора — вегетативных клеток, не отличались достоверно на разных этапах гаметогенеза, и во всех типах клеток были близки к единице.
Полученные данные позволяют предлагать ген CrMIP1 в качестве референс-гена для сравнения генной экспрессии в вегетативных клетках, прегаметах и гаметах.
Обсуждение результатов исследования
Анализ экспрессии генов представляет собой одну из важнейших областей исследований любого организма, и метод ПЦР в реальном времени обеспечил возможность быстрой и точной количественной оценки экспрессии на уровне транскрипции [15]. Важным этапом корректной оценки результатов, полученных методом ПЦР в реальном времени, является нормализация по отношению к референс-гену, что обеспечивает устранение почти всех источников вариабельности при проведении количественной ПЦР [3, 5]. Основным условием для выбора гена на эту роль является его одинаковая экспрессия во всех пробах, которые будут сравниваться. Выявленная нами ранее зависимость транскрипции ряда генов от света [3] обусловила необходимость разграничения этого типа регуляции от световой регуляции в процессе гаметогенеза. Принимая во внимание тот факт, что уровни экспрессии даже наиболее часто используемых референс-генов могут изменяться в определенных условиях и разных типах клеток, нами были проверены в качестве генов — кандидатов на роль референс-генов часто используемые гены, кодирующие глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу и малую субъединицу рибулозо-1,5-бис-фосфаткарбоксилазы [8]. Как видно из представленных результатов, гены Fd-GAPDH и RBCS1 не подходят в качестве нормализаторов для наших экспериментов, поскольку обнаруживают световую зависимость транскрипции (см. рис 3). Это обусловило поиск нового референс-гена.
В геноме C. reinhardtii выявлена нуклеотидная последовательность (XM_001694068 XP_001694120) из 1654 п.о., содержащая 6 экзонов (см. рис. 4 [12]). Предполагаемый белок, состоящий из 300 а.о., имеет 5 потенциальных трансмембранных доменов и, по-видимому, относится к семейству основных внутренних белков (Major Intrinsic Proteins, MIP), так как обнаруживает идентичность аквапоринам растений из семейства TIP. Предварительный анализ транскрипции гена интереса в среде ТАР и в условиях осмотического стресса позволил предположить, что регуляция экспрессии белка происходит на посттранскрипционном уровне.
Для сопоставления транскрипции CrMIP1 в разных типах клеток, формирующихся в жизненном цикле C. reinhardtii, нами был использован показатель Ct, который позволяет оценить начальное количество копий ДНК, поскольку значение Ct обратно пропорционально количеству исходной матрицы. При сходных уровнях транскрипции генов в неодинаковых условиях разница значений С в различных пробах не должна превышать 0,5. Сравнение С для вегетативных клеток, прегамет и гамет у двух штаммов с разной световой зависимостью гаметогенеза показывает, что различие в значениях С в разных типах клеток как у мутанта lrg6, так и у штамма СС-124 не превышало 0,5 (см. рис. 5). Полученные данные свидетельствуют о том, что транскрипция CrMIP1 не изменяется в процессе гаметогенеза.
Итак, относительная количественная оценка экспрессии с использованием UBI в качестве гена-нормализатора (см. рис. 6) подтверждает вывод о независимости от
света транскрипции CrMIP1 в ходе гаметогенеза. Полученные данные позволяют предлагать CrMIPl в качестве нового референс-гена для количественного анализа экспрессии в процессе половой дифференцировки C. reinhardtii.
***
Работа проводилась при финансовой поддержке РФФИ (грант № 10-04-00156). Литература
1. The Chlamydomonas Sourcebook. 2nd ed. / ed. by E. H. Harris, D. Stern, G. Witman. Acad. Press, 2008. Vol. 1-3. 2000 p.
2. Beck C. F., Acker A. Gametic differentiation of Chlamydomonas reinhardtii-. Control by nitrogen and light // Plant Physiol. 1992 Vol. 98. P. 822-826.
3. Regulation by light of ammonium transport systems in Chlamydomonas reinhardtii / Ermilova E. V., Zalutskaya Z. M., Nikitin M. M., Lapina T. V., Fernandez E. // Plant Cell Environ. 2010. Vol. 33. P. 1049-1056.
4. Bustin S. A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays // J. Mol. Endocrinol. 2000. Vol. 25. P. 169-193.
5. Accurate normalization of Real-Time quantitative RT-PCR by geometric averaging of multiple internal control genes / Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F., Poppe B., Van Roy N., De Paepe A., Speleman F. // Genome Biol. 2002. Vol. 3. P. 0034.I-0034.II.
6. Housekeeping genes as internal standards- use and limits / Thellin O., Zorzi W., Lakaye B., De Borman B., Coumans B., Hennen G., Gristar T., Igout A., Heinen E. // J. Biotechnol. 1999. Vol. 75. P. 291-295.
7. Ermilova E., Nikitin M., Fernandez E. Chemotaxis to ammonium/methylammonium in Chlamydomonas reinhardtii- the role of transport systems for ammonium/methylammonium // Planta. 2007. Vol. 226. P. 1323-1332.
8. Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-time PCR / Dheda K., Huggett J. F., Bustin S. A., Johnson M. A., Rook G., Zumla A. // Biotechniques. 2004. Vol. 37. P. 112119.
9. Pfaffl M. W., Tichopad A., Prgomet C., Neuvians T. P. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity- BestKeeper — Excel-based tool using pair-wise correlations // Biotechnol. Lett. 2004. Vol. 26. P. 509-515.
10. Bustin S. A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems // J. Mol. Endocrinol. 2002. Vol. 29. P. 23-39.
11. Gorman D. S., Levine R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1965. Vol. 54. P. 1665-1669.
12. Functional identification of the glycerol transport activity of Chlamydomonas reinhardtii CrMIP1 / Anderca M. I., Suga S., Furuichi., Shimogawara K., Maeshima M., Muto S. // Plant Cell Physiol. 2004. Vol. 45. P. 1313-1319.
13. Лапина Т. В., Ермилова Е. В. Осмоакклимация Chlamydomonas reinhardti// VIII Международный научно-практический симпозиум «Новые и нетрадиционные культуры и перспективы их использования». 22-26 июня 2009 г. Т. 3. С. 36.
14. Dame G., Gloeckner G., Beck C. F. Knock-out of a putative transporter results in altered blue-light signalling in Chlamydomonas // Plant J. 2002. Vol. 31. P. 577-587.
15. Bustin S. A., Nolan T. Pitfalls of quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction // J. Biomol. Tech. 2004. Vol. 15. P. 155-166.
Статья поступила в редакцию 9 июня 2011 г.
