CC BY
80
УДК:591.1:636.92
10.18286/1816-4501-2016-2-101-105
ГАММА-ГЛУТАМИЛТРАНСФЕРАЗА В ТКАНЯХ ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ У КРОЛЬЧАТ
Игнатьев Николай Георгиевич, доктор биологических наук, профессор кафедры «Агрохимия и экология»
Терентьева Майя Генриховна, кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры «Биотехнологии и переработка сельскохозяйственной продукции»
428003 Чувашская Республика, г. Чебоксары, ул. Карла Маркса, 29; тел. 89278659031; e-mail: [email protected]
Ключевые слова: ферменты, гамма-глутамилтрансфераза, фазы питания, двенадцатиперстная кишка, крольчата
Приведены результаты исследований по изучению закономерностей возрастных изменений активности фермента гамма-глутамилтрансферазы в тканях слизистого и мышечного слоев проксимальной, медиальной и дистальной частей слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки у разновозрастных крольчат. Выявлены неравномерность, ге-терохронность и фазность возрастных изменений активности гамма-глутамилтрансфе-разы. Наиболее интенсивные процессы белкового обмена в тканях слизистого слоя двенадцатиперстной кишки происходят у крольчат в первые сутки жизни, а в тканях мышечного слоя - у крольчат более зрелого возраста.
Введение
Гамма-глутамилтрасфераза (ГГТ) КФ 2.3.2.1 - фермент класса трансфераз. Катализирует перенос гамма-глутамиловой группы глутатиона (GSH) и других гамма-глутамил-пептидов на пептиды или отдельные аминокислоты (метионин, цистеин и др.). Практически ГГТ содержится во всех тканях организма и биологических жидкостях. Является показателем состояния белкового обмена в тканях органов [1]. В научной литературе имеется ряд работ, в которых освещены закономерности возрастных изменений ГГТ в тканях органов пищеварения у продуктивных животных[2,3,4,5,6]. Определение закономерностей становления ферментных систем в тканях органов у животных, в том числе и индикаторов белкового обмена как транс-феразы, позволяет раскрывать внутренние механизмы формирования, роста и развития тканей органов, органов и организма в целом на молекулярном уровне, оценить на молекулярном уровне влияние кормовых добавок, биологически активных веществ и лекарственных препаратов на структуры и функции изучаемых органов.
Целью нашей работы стало определение закономерностей становления ферментной системы гамма-глутамилтрансферазы в
тканях слизистого и мышечного слоев проксимальной, медиальной и дистальной частей двенадцатиперстной кишки у растущих крольчат. Подобных работ в научной литературе не обнаружено.
Объекты и методы исследований
Исследования проведены с использованием крольчат породы серый великан в возрасте 1, 6, 12, 18 24, 30, 45, 60, 90 и 120 суток, выращенных в условиях личного хозяйства Чувашской Республики с соблюдением необходимых ветеринарно-санитарных правил и норм кормления в весенне-летний сезон, по 5 голов в каждом возрасте.
Крольчат натощак вводили в состояние общего наркоза. Эвтаназию и все манипуляции выполняли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» [7].
Извлеченную двенадцатиперстную кишку очищали от содержимого, промывали с холодным физиологическим раствором, разделяли на проксимальную, медиальную и дистальную части и замораживали их отдельно в жидком азоте сосуда Дюара. В лабораторных условиях части (пробы) кишки отделяли на слизистую и мышечную слои, ткани гомогенизировали в гомогенизаторе. В гомогенатах определяли активность фермен-
та ГГТ колометрированием (КФК-2) и одновременно спектрофотометрированием ((UV-1800) с использованием набора реагентов компании ОАО «Витал Девелопмен Корпо-рэйшн» (СПб). Расчет активности фермента провели по калибровочному графику.
Результаты исследований
Полученные в ходе исследований данные обобщены в таблице 1.
У односуточных крольчат (табл.), питающихся молозивом, в тканях слизистого слоя проксимальной части двенадцатиперстной кишки определяются относительно высокие величины ГГТ - 538,3±32,3. В молозив-но-молочную фазу питания у шестисуточных крольчат они примерно такие же высокие -523,5±27,1. Очевидно, в первых фазах питания крольчат активность белкового обмена с участием гамма-глутамилтрансферазы высокая.
В течение последующих шести суток жизни у 12-суточных крольчат в первую фазу молочного питания активность ГГТ существенно падает, на 37,3%, р<0,001, до 328,5±18,5. На уровне 12-суточных она обнаруживается и у 18-суточных - 336,0±17,9. Весьма вероятно, что в первой и во второй фазах молочного питания крольчат процессы белкового обмена в тканях слизистого слоя проксимальной части кишки, связанные с гамма-глутамилтрансферазой, замедляются.
К 24-суточному возрасту, в третьей фазе молочного питания, активность фермента в тканях слизистого слоя продолжает достоверно уменьшаться, на 38,5%,р<0,001,
Активность ГТТ в тканях двенадцатип<
до206,7±16 4. Такой же уровень ГГТ в тканях слизистого слоя обнаруживается у месячных (213,6±13,2), 45-суточных (194,8±11,9) и двухмесячных (196,9±14,3). По-видимому, с включением в рацион питания крольчат зеленого травяного корма участие фермента в процессах белкового обмена в тканях слизистого слоя снижается.
В течение последующего месяца, к трехмесячному возрасту крольчат, активность ГГТ увеличивается существенно, в 1,5 раза, р<0,01, до 299,3±22,8 и на таком же уровне в тканях слизистого слоя проксимальной части изучаемой кишки она определяется и у четырехмесячных, 292,7±28,4. Полагаем, что у крольчат, находящихся на откорме, с повышением в рационе комбикормов, с увеличением всасывания массы аминокислот, белковый обмен в тканях слизистого слоя проксимальной части слизистой оболочки значительно возрастает, что отражается на активности ферментосинтезирующих систем в них.
По нашим данным, наиболее интенсивные изменения активности ГГТ в тканях слизистого слоя проксимальной части кишки выявляются с 6 по 12 сутки (падает на 37,3%), с 18 по 24 сутки (уменьшается на 38,5%) жизни крольчат и с двухмесячного по трехмесячный (увеличивается в 1,5 раза) возраст.
В тканях мышечного слоя проксимальной части двенадцатиперстной кишки у крольчат в фазах молозивного и молозивно-молочного питания, или у одно- и шестисуточных, активность ГГТ относительно невысо-
Таблица 1
ой кишки у крольчат
Часть кишки Возраст, сут
1 6 12 18 24 30 45 60 90 120
Проксим. слизистая 538,3 ±32,3 523,5 ±27,1 328,5 ±18,5 336,0 ±17,9 206,7 ±16 4 213,6 ±13,2 194,8 ±11,9 196,9 ±14,3 299,3 ±22,8 292,7 ±28,4
Проксим. мышечная 208,8 ±16,5 228,5 ±13,2 385,9 ±21,7 323,8 ±19,6 179,4 ±14,2 284,2 ±18,3 234,5 ±23,3 246,6 ±17,6 226,6 ±15,9 269,3 ±21,1
Медиал. слизстая 563,8 ±27,2 520,5 ±32,2 512,2 ±21,5 521,4 ±22,3 242,8 ±16,7 255,1 ±19,1 171,7 ±12,3 169,4 ±15,2 246,6 ±16,7 260,5 ±18,4
Медиал. мышечная 263,9 ±21,1 272,0 ±13,7 252,2 ±19,2 374,6 ±26,6 346,8 ±18,6 303,3 ±22,5 336,0 ±20,4 270,1 ±14,3 218,4 ±18,5 226,3 ±16,7
Дист. сизистая 430,1 ±33,2 425,9 ±28,8 331,3 ±29,1 324,2 ±18,9 326,0 ±21,6 262,6 ±17,7 245,8 ±15,2 211,2 ±12,5 355,8 ±27,1 356,0 ±31,3
Дист. мышечная 318,4 ±19,9 323,1 ±23,3 242,8 ±12,8 254,8 ±15,7 245,6 ±17,2 223,4 ±16,2 254,3 ±13,5 352,5 ±19,8 324,7 ±27,7 312,7 ±19,7
кая и определяется на уровне таких величин, как 208,8±16,5 и228,5±13,2. Очевидно, в эти фазы питания крольчат в тканях проксимальной части кишки процессы белкового обмена с участием гамма-глутамилтрасферазы замедлены, двигательная активность проксимальной части кишки невысокая, в совокупности создаются условия для более длительного и глубокого усвоения компонентов молозива.
В течение последующих шести суток жизни крольчат, у 12-суточных, в тканях мышечного слоя активность фермента существенно возрастает, в 1,7 раза, р<0,001, до 385,9±21,7 и на таком относительно высоком уровне она сохраняется и 18- суточных - 323,8±19,6. Увеличение активности фермента, вероятно, связано с возрастанием во второй и третьей фазах молочного питания объема поступающего молока в двенадцатиперстную кишку, с повышением обменных процессов в тканях мышечного слоя и увеличением двигательной активности проксимальной части кишки.
К 24-суточному возрасту крольчат активность ГГТ резко падает, до 179,4±14,2, на 44,6%, р<0,001. Временное снижение активности ГГТ в тканях мышечного слоя в начале переходной фазы с молочного на растительное питание, возможно, связано с временной перестройкой клеток мышечного слоя с началом усвоения компонентов растительного корма и замедлением обменных процессов в них с участием ГГТ.
В последующем, к месячному возрасту, активность исследуемого фермента в тканях мышечного слоя проксимальной части кишки существенно повышается, в 1,6 раза, р<0,01, до 284,2±18,3 и на этом относительно высоком уровне она сохраняется у более физиологически зрелых крольчат. Высокая активность гамма-глутамилтрансферазы в тканях мышечного слоя проксимальной части у физиологически более зрелых крольчат, по нашим представлениям, отражает повышенную активность процессов формирования мышечного слоя для усиления двигательной функции и обеспечения оптимизации прохождения растительных компонентов корма в двенадцатиперстной кишке.
Результаты свидетельствуют, что высокая интенсивность возрастных изменений ак-
тивности ГГТ в тканях мышечного слоя проксимальной части слизистой оболочки кишки обнаруживается в следующие промежутки жизни крольчат: с 6 по 12 сутки (возрастает в 1,7 раза), с 18 по 24 сутки (падает на 44,6%) и с 24 по 30 сутки (повышается в 1,6 раза).
В тканях слизистого слоя медиальной части двенадцатиперстной кишки активность ГГТ на одинаковом, относительно высоком уровне, определяется у одно-, шести-, двенадцати- и восемнадцатисуточных крольчат, соответственно 563,8±27,2, 520,2±32,2, 512,2±21,5 и 521,4±22,3. Возможно, в моло-зивной, молозивно-молочной, первой и второй молочной фазах питания крольчат происходит усиленное формирование структуры слизистого слоя медиальной части кишки с участием исследуемого фермента.
В течение последующих шести суток жизни, к 24-суточному возрасту, активность фермента значительно (на 53,5%, р<0,001, до 242,8±16,7) снижается. На этом же уроне активность ГТТ выявляется и у месячных -255,1±19,1. К 45-суточному возрасту крольчат она продолжает достоверно уменьшаться, на 30,4%, р<0,01, до171,7±12,3, и у двухмесячных она сохраняется на предыдущем уровне, 169,4±15,2. Относительно низкая активность гамма-глутамилтрансферазы в тканях слизистого слоя медиальной части кишки в фазах молочно-растительного, в первой и второй фазах растительного питания, как нам кажется, связана с замедленной перестройкой структур слизистого слоя медиальной части кишки в связи с уменьшением роли этой части кишки в процессах усвоения новых компонентов корма.
Через месяц, у трехмесячных, активность фермента снова достоверно возрастает, до 246,6±16,7, в 1,4 раза, р<0,05, а у четырехмесячных уровень фермента существенно не изменяется, составляет 260,5±18,4. Не существенное повышение активности исследуемого фермента в более зрелые возрастные сроки также дают основание полагать, что усиленное структурно-функциональное формирование слизистого слоя медиальной части кишки у крольчат происходит в течение более ранних фаз питания.
Высокая интенсивность возрастных изменений активности ГГТ в тканях слизистого слоя медиальной части слизистой оболочки
кишки у крольчат отмечается лишь с 6 по 12 сутки их жизни (снижается на 53,5%). Возрастные изменения активности фермента умеренные с 30 по 45 сутки жизни (уменьшается на 30,4%) и с двухмесячного по трехмесячный возраст (возрастает в 1,4 раза).
В тканях мышечного слоя медиальной части двенадцатиперстной кишки активность ГГТ у одно-, шести- и двенадцатисуточных крольчат определяются примерно одинаковыми и относительно низкими величинами, соответственно 263,9±21,1, 272,0±13,7 и 232,2±19,2. Такие результаты исследований приводят нас к предположению, что в течение первых фаз питания у крольчат интенсивность процессов обмена белка с участием исследуемого фермента в тканях мышечного слоя слизистой оболочки медиальной части двенадцатиперстной кишки относительно низкая, структурно-функциональное развитие мышечного слоя в этот промежуток жизни крольчат происходит медленно, двигательная активность медиальной части не высокая, и в этих условиях обеспечивается более глубокое и длительное усвоение ну-триентов пищи.
К 18-суточному возрасту крольчат величина фермента в мышечном слое существенно повышается, в 1,5 раза, р<0,01,до 374,6±26,6. Далее на таком относительно высоком уровне она определяется у 24-суточ-ных, месячных и 45-суточных, соответственно 346,8±18,6, 303,3±22,5 и 336,0±20,4. Очевидно, с возрастом крольчат интенсивность структурно-химического совершенствования мышечного слоя медиальной части кишки существенно повышается и возрастает его роль в передвижении химуса по кишке.
У двухмесячных активность ГГТ достоверно ниже, чем у 45-суточных, на 19,6%, р<0,05, и составляет 270,9±14,3. В течение последующих месяцев жизни крольчат активность фермента в тканях мышечного слоя медиальной части двенадцатиперстной кишки остается на таком же уровне или на уровне двухмесячных. Весьма вероятно, что формирование мышечного слоя медиальной части кишки, судя по активности ГГТ, в основном завершается к двухмесячному возрасту.
Высокая интенсивность возрастных изменений активности ГГТ в тканях мышечного слоя медиальной части двенадцатиперстной
кишки выявляется лишь с 12 по 18 сутки жизни крольчат (возрастает в 1,5 раза). Достоверное возрастное изменение активности фермента отмечается с 45 по 60-суточный возраст (уменьшается на 19,6%).
В тканях слизистого слоя дистальной части двенадцатиперстной кишки активность ГГТ у одно- и шестисуточных крольчат определяется максимальными величинами, соответственно 430,1±33,2 и 425,9±28,8. Вероятно, в тканях слизистого слоя дистальной части, как и в тканях слизистого слоя проксимальной и медиальной частей кишки у крольчат, белковый обмен с участием гамма-глутамилтрансферазы наивысший в первые фазы их постнатальной жизни.
К 12-суточному возрасту крольчат уровень фермента в тканях слизистого слоя дистальной части достоверно снижается, на 22,2%, р<0,05, до 331,3±20,1. В последующем у крольчат 18- и 24-суточных уровень фермента не изменятся, определяется соответственно величинами 324,2±19,9 и 326,0±21,6. Повторное достоверное снижение активности ГГТ отмечается у месячных, на 19,5%, р<0,05, до 242,6±17,7. Такая же величина фермента обнаруживается у 45-суточных (245,8±15,2) и двухмесячных (221,2±12,5). По-видимому, волнообразное снижение активности гамма-глутамилтрансферазы в тканях слизистого слоя дистальной части кишки от двенадцати-суточного по двухмесячный возраст отражает снижение активности белкового обмена с участием исследуемого фермента, зависит от тонкого структурно-функционального приспособления слизистого слоя дистальной части кишки, как и других частей, к усвоению разнообразных компонентов поступающего корма в этот промежуток жизни крольчат.
У более физиологически зрелых, у трехи четырехмесячных крольчат, активность фермента существенно выше, чем у крольчат предыдущего возраста, в 1,6, р<0,01 и 1,7 раза, р<0,01, определяется соответственно на уровне 355,8±27,1и369,4±31,3. Можно допустить, что интенсивное структурно-химическое формирование слизистого слоя дис-тальной части кишки у взрослых крольчат продолжается, однако в меньшей степени, чем у новорожденных.
Интенсивность возрастных изменений активности ГГТ в тканях слизистого слоя дис-
тальной части двенадцатиперстной кишки у крольчат наиболее выражена с двухмесячного по трехмесячный возраст (увеличивается в 1,6 раза). Достоверные возрастные изменения активности фермента обнаруживаются с 6 по 12 сутки (снижается на 22,2%) и с 24 по 30 сутки (падает на 19,5%) жизни крольчат.
В тканях мышечного слоя дистальной части двенадцатиперстной кишки активность ГТТ у одно- и шестисуточных крольчат характеризуется более высокими величинами, соответственно 318,4±19,9 и 323,1±23,3. Таким образом, в отличие от предыдущих частей, белковый обмен здесь с участием гамма-глутамилтрансферазы в ранние фазы питания крольчат находится на высоком уровне, следовательно, интенсивное формирование мышечной активности этой части кишки начинается раньше, чем других частей двенадцатиперстной кишки.
У 12-суточных крольчат активность ГГТ определяется на уровне 242,8±12,8. Эта величина ниже, чем у 6-суточных на 24,9%, р<0,05. Такой же уровень фермента обнаруживается у 18- (254,8±15,7) и 24-суточных (245,6±17,2), месячных (223,4±16,2), а также 45-суточных (254,3±13,5). Полученные результаты, вероятно, отражают временное замедление структурно-функционального совершенствования мышечного слоя дистальной части кишки с 12- по 45-суточный возраст.
В последующем, к двухмесячному возрасту, активность ГГТ возрастает существенно, в 1,4 раза, р<0,01, до 352,5±19,8. У трех- и четырехмесячных крольчат в тканях мышечного слоя дистальной части двенадцатиперстной кишки активность фермента сохраняется на уровне двухмесячных. Возможно, интенсивность формирования мышечного слоя дистальной части кишки у физиологически зрелых крольчат снова возрастает для повышения ее двигательной функции.
Выраженные возрастные изменения активности ГГТ в тканях мышечного слоя дистальной части слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки определяются с 6 по 12 сутки (снижается на 24,9%) и с 45-суточного по двухмесячный возраст (повышается в 1,4 раза).
Выводы
1. Крольчата рождаются с относительно высокой активностью гамма-глутамилтранс-феразы в тканях слизистого слоя и низкой - в
тканях мышечного слоя проксимальной, медиальной и дистальной частей двенадцатиперстной кишки.
2.Возрастные изменения активности гамма-глутамилтрансферазы происходит пофазно. В тканях слизистого и мышечного слоев она более интенсивно изменяется в первую, третью фазу молочного и во вторую фазу растительного питания.
3. Активность гамма-глутамилтрансфе-разы стабилизируется в тканях слизистого слоя проксимальной, медиальной и дисталь-ной частей с трехмесячного, а мышечного слоя - в тканях проксимальной части с месячного, а медиальной и дистальной частей - с двухмесячного возраста.
Библиографический список
1. Биссвангер, Х. Практическая энзимоло-гия / Х. Биссвангер // Изд-во «Бином. Лаборатория Знаний». - М.,2010. - 328 с.
2. Игнатьев, Н.Г. Глутамилтрансфераза в тканях толстого кишечника у молодняка свиней / Н.Г. Игнатьев, М.Г. Терентьева //Ученые записки КГАВМ. - Казань, 2014. - Т. 119.-С.-267-271.
3.Терентьева, М.Г. Активность Y-глутамилтрансферазы в тканях желудка у поросят / М.Г. Терентьева, Н.Г. Игнатьев // Аграрный вестник Урала. - 2011. - №9(88). - С. 33-39.
4.Терентьева, М.Г. Активность Г-Глутамилтрансферазы в тканях печени при добавлении в рацион свиней БВМД / М.Г. Терентьева / Maetrialy v111 miedzynarodowejnaukowi-praktycznejikonfrencji «Naukaiinowacja - 2012» / М.Г. Терентьева / PrzemysiNaukalstudia. -2012. - S. 96-98.
5. Терентьева, М.Г. Глутамилтрансфераза в тканях толстого кишечника у молодняка свиней / М.Г. Терентьева, Н.Г. Игнатьев / Ученые Записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. -Казань. - 2014. -Т. 219. - С.267-271.
6.Терентьева, М.Г Уровень Y-глутамилтрансферазы в тканях поджелудочной железы у поросят при включении в рацион свиней БВМД / М.Г. Терентьева, Н.Г. Игнатьев // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. - 2011. - №12 (86) -С. 76 -78.
7. Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных // Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР №775 от 12.03.1977.
1!
£ & ES SS »1
Si
р и ш Sä ;ii H ■ i
са s!
