CC BY
32
микроскопии менее затратная как во временном, так и материальном отношении, по сравнению с проведением электронномикроскопичес-кого и иммуногистохимического исследования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Болезни домашних и сельскохозяйственных птиц / Б. У. Кэлнек [и др.]; под ред. Б. У. Кэлнека; пер. с англ. И. Григорьева. М.: АКВАРИУМ БУК, - 2003. - С. 850-870.
2. Инфекционная анемия цыплят / А. С. Алиев [и др.] // Ветеринарная медицина. -2011. - № 1. - С. 49-53.
3. К а р п у т ь, И. М. Гематологический атлас сельскохозяйственных животных / И. М. Карпуть. - Минск: Ураджай, 1986. - 183 с.
4. Микроскопическая техника: Руководство / Д. С. Саркисов [и др.]; под ред. Д. С. Саркисова, Ю. Л. Петрова. М.: Медицина, - 1996. - С. 453-473.
5. Серологический мониторинг инфекционной анемии цыплят и молекулярно-биологическая характеристика изолятов вируса / В. А. Лобанов [и др.] // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2003. - N° 2. - С. 66-69.
6. Способ получения пунктата костного мозга у птиц и изучение миелограммы при вакцинациях / В. С. Прудников [и др.] // Ученые записки УО ВГАВМ. Витебск, 2006. -Т. 42. - Вып.1. - Ч. 1. - С. 82-85.
7. A d a i r, B. M. Immunopathogenesis of chicken anemia virus infection / B. M. Adair // Dev. Comp. Immunol. - 2000. - Vol. 24 (2-3). - P. 247-255.
8. Chicken anemia virus causes apoptosis of thymocytes after in vivo infection and of cell lines after in vitro infection / S. H. Jeurissen // J. Virol. - 1992. - Vol. 66. - № 12. - P. 7383-7388.
9. Chicken anemia virus inoculated by the oral route causes lymphocyte depletion in the thymus in 3-week-old and 6-week-old chickens / J. A. Smyth [et al.] // Avian Pathology. -2006. - Vol. 35(3). - P. 254-259.
10. C h o m c z y n s k i, P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thi-ocyanate-phenol-chloroform extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. 1987. -Vol. 162. - № 1. - P. 156-159.
11. M a t h i e u, H. M. Chicken anemia virus induced apoptosis: underlying molecular mechanisms / H. M. Mathieu // Vet. Microbiology. - 2004. - Vol. 98, Issue 2. - P. 89-94.
12. Pathological and immunohistochemical study of chickens with co-infection of Marek's disease virus and chicken anaemia virus / Mohie Haridy [et al.] // Avian Pathology. - 2009. -Vol. 38(6). - P. 469-483.
УДК 636.2:612-014:578.08
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ФАКТОРОВ ЛОКАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КОРОВ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ЛАКТАЦИИ
Н. Н. ЖЕЛАВСКИЙ Подольский государственный аграрно-технический университет, г. Каменец-Подольский, Хмельницкая обл., Украина, 32300
(Поступила в редакцию 29.01.2015) 24
Введение. Лактация коров - это высокоэнергетический метаболический процесс, который регулируется в организме сложными физиологическими механизмами нервной и эндокринной систем [1-4]. На сегодняшний день уже всесторонне изучены биохимические и цитологические показатели секрета молочной железы коров. Вместе с этим иммунные механизмы защиты локального иммунитета вымени в различные периоды лактации еще недостаточно освещены [5-8].
Среди множества современных методов исследования особенное внимание исследователей привлекают прикладные методы клинической иммунологии, которые раскрывают новые сведения о механизмах локальной защиты вымени, их состояние, взаимодействие и изменение в различные периоды лактации [9, 10]. Это имеет важное значение при определении диагностических критериев иммунологических нарушений [5-7, 11].
В систему клеточных факторов защиты молочной железы входят нейтрофилы, макрофаги, естественные киллеры и дендритные
клетки [6, 9]. Определено, что общее количество и популяционный состав этих клеток в молоке имеет видовые и породные особенности, а также зависит от физиологического состояния молочной железы. Физиологические колебания клеточного состава соматических клеток динамичны. Изменения их состава происходят даже в течение суток и имеют свои особенности в различные периоды лактации.
Многогранную роль в формировании местного иммунитета молочной железы выполняют фагоциты (нейтрофилы, макрофаги) [10-12]. Нейтрофильные гранулоциты - наиболее активная популяция соматических клеток, которые выполняют важную роль в клеточной и локальной защите вымени [12-14]. Новейшие исследования доказывают, что значительное количество нейтрофилов секрета молочной железы находятся в неактивированном состоянии и со временем подвергаются апоптозу [8, 11, 15]. Потому в клинической практике ветеринарной медицины для полной оценки параметров локального иммунитета молочной железы особый интерес представляет изучение иммунобиологических аспектов лактации, а также полное раскрытие патогенетических механизмов иммунопатологии мастита [5, 8, 10, 12].
Цель работы - изучить функциональное состояние клеточного звена локального иммунитета молочной железы коров в различные периоды лактации.
Материал и методика исследований. Клинико-экспериментальные исследования проводили в фермерских хозяйствах Хмельницкой и Винницкой областей Украины и в специализированной лаборатории воспроизводства животных учебно-научного института ветеринарной медицины Подольского государственного аграрно-технического университета (г. Каменец-Подольский, Хмельницкая область, Украина). Опыты проводились на коровах-аналогах украинской черно-пестрой молочной породы методом групп и периодов. Диспансеризацию поголовья проводили согласно методическим рекомендациям по профилактике бесплодия крупного рогатого скота (Г. В. Зверева, В. А. Яблонский и др., 2000) [14]. Исследование иммунобиологической защиты организма коров проводили в различные периоды лактации: в начале (3-5-е сут.), в середине (3-5-й мес.) и в конце (запуск - 5-7-е сут.; сухостой - 12-20-е сут.) функционирования молочной железы.
Состояния локального иммунитета молочной железы коров исследовали по состоянию клеточного звена неспецифической иммунобиологической реактивности. Функциональное состояние противомик-робной защиты фагоцитов секрета молочной железы изучали с помощью цитохимических методов исследования. Кислороднезависимые механизмы противомикробной защиты фагоцитов определяли в реакции с интралейкоцитарным лизоцимом (ИЛЛ) и реактивностью лизо-сомальных катионных белков (ЛКБ). Кислородзависимый потенциал фагоцитарной защиты определяли в цитохимической реакции миело-пероксидазы (МПО) и по интенсивности внутриклеточного метаболического восстановления (редукции) нитросинего тетразолия в гранулы диформазана (НСТ-тест). Функциональные параметры противомик-робной реактивности фагоцитарных клеток определяли по общему числу активированных фагоцитов, а также по показателям интенсивности их цитохимической реактивности. При этом определяли индекс активации нейтрофилов (ИАН), цитологический индекс (ЦЛИ), индекс дегрануляции нейтрофилов (ИДН) и суммарный показатель цитохимической реактивности (СПЦР) фагоцитарных клеток. Биометрический анализ полученных результатов и интерпретацию данных проводили с помощью статистического софта Statistica V. 5.5 А.
Результаты исследований и их обсуждение. Клеточные и гуморальные факторы локального иммунитета молочной железы коров играют важное значение в формировании и поддержании иммунного
гомеостаза на протяжении всей лактации [5-9]. Как известно, в патогенезе мастита в организме происходят различные метаболические и функциональные нарушения, развивается целый каскад иммунологических реакций [6, 7, 11, 12]. Первыми мессенджерами и эффекторами воспаленной реакции в зоне патологического процесса являются фагоциты, которые осуществляют активную атаку и нейтрализацию микробного агента. Исходя из таких позиций, исследователю нужно четко знать параметры локального иммунитета молочной железы в различные периоды лактации, а также прогнозировать возможные «срывы» в защите. И это особенно важно как для ранней диагностики мастита, так и для проведения мониторинга адекватной терапии [10, 11, 15].
Проведенные опыты показали, что в различные периоды лактации в организме коров происходят динамические изменения в параметрах клеточного звена локального иммунитета их молочной железы.
Комплексными иммунологическими исследованиями определенно, что в молозиве подопытных коров происходит существенное увеличение количества реактивных фагоцитов. И в первую очередь это происходило за счет популяции фагоцитарных клеток, которые проявляли интенсивную цитохимическую реактивность кислороднезависимых механизмов противомикробной защиты.
Серийными цитохимическими исследованиями определено, что уровень интралейкоцитарного лизоцима в этот период составлял 48,09±0,63 %. Параллельно с этим происходило увеличение индекса активации нейтрофилов (1,42±0,05) и ЦЛИ (3,17±0,03 %). Индекс де-грануляции нейтрофилов в этот момент находился на уровне 0,81±0,02, что указывает на максимальную экскрецию интралейкоци-тарного лизоцима микрофагальными клетками в молозиво. Интенсивную цитохимическую реактивность также проявляли и лизосомальные катионные белки активированных фагоцитарных клеток секрета молочной железы. При этом в молозиве общее количество реактивных фагоцитов с гранулами ЛКБ составляло 61,54±0,71 %, что происходило с максимальным возрастанием ИАН (1,45±0,08) и ЦЛИ (3,41±0,04 %). В середине лактации опытных коров реактивность ЛКБ несколько снижалась (рис. 1).
Реактивация нейтрофилов при этом происходила на фоне резкого снижения ЦЛИ исследованных кислороднезависимых механизмов защиты и возрастания индекса дегрануляции нейтрофилоцитов. Как по-
казали наши дальнейшие исследования, этот феномен являлся одним из ранних признаков физиологического старения и смерти (апоптоза) иммунокомпетентных клеток, которые реализовали свой потенциал.
%
- Общее к-во ИЛЛ+, % ИЛЛ-ИАН
-ИЛЛ-ЦЛИ,% -ИЛЛ-ИДН
- Общее к-во ЛКБ+, % ЛКБ-ИАН ЛКБ-ЦЛИ,% СПЦР
Середина лактации
Рис. 1. Динамика цитохимической реактивности кислороднезависимых факторов защиты фагоцитов секрета молочной железы коров в различные периоды лактации (п=33)
юо
ю
0,1
Кислородзависимые факторы защиты фагоцитов также имели свои характерные особенности на протяжении всей лактации. В серийном эксперименте было установлено, что на 3-5-е сутки лактации в молозиве коров фагоцитарные клетки проявляли самый высокий противо-микробный эффект. Общее количество МПО и НСТ-положительных нейтрофилов в молозивный период составляла: 82,12±0,78 % и 77,72±0,87 %, соответственно. Цитохимическая реактивность фагоцитарных клеток проявлялась на фоне высокого индекса активации нейтрофилов и ЦЛИ. В середине лактации цитохимическая реактивность миелопероксидазы и образование цитоплазматических гранул диформазана фагоцитарных клеток изменялась (рис. 2).
В дальнейшем, в период запуска и сухостоя, общее количество фагоцитарных клеток с гранулами миелопероксидазы стремительно возрастало, что сопровождалось параллельным увеличением цитологического индекса (2,53±0,17). В этот период происходила также интенсивная (27,7±1,23 %, р<0,001) активация фагоцитарных клеток в НСТ-тесте. Суммарный показатель цитохимической реактивности иммуно-компетентных клеток был также динамичным.
28
Рис. 2. Динамика цитохимической реактивность кислороднезависимых факторов защиты фагоцитов секрета молочной железы коров в различные периоды лактации (п=33)
Таким образом, на протяжении всей лактации коров происходят динамические изменения в системе клеточного звена локальной иммунной защиты их молочной железы, что непосредственно связано с морфологическими и функциональными изменениями, происходящими в организме в исследованные периоды.
Заключение. Клеточное звено локального иммунитета молочной железы коров представлено кислородзависимыми и кислороднезави-симыми механизмами защиты. Противомикробный потенциал фагоцитов секрета молочной железы динамически изменялся на протяжении всей лактации. Наибольшая цитохимическая реактивность кислородза-висимых (МПО, НСТ-тест) факторов защиты фагоцитарных клеток проявлялась в начале лактации, в период запуска и сухостоя. Наименьшая реактивность ИЛЛ фагоцитов отмечена в конце лактации. Функциональное состояние клеточного звена и параметров иммунного гомеостаза регулируются механизмами апоптоза и зависят от физиологических процессов, происходящих в организме животных в различные периоды лактации.
ЛИТЕРАТУРА
1. Г а в р и ч е н к о, Н. И. Воспроизводительная способность, молочная продуктивность и частота акушерско-гинекологических заболеваний у коров с разным типом стрессоустойчивости / Н. И. Гавриченко, В. Р. Каплунов, Т. В. Павлова // Актуальные проблемы ветеринарного акушерства и репродукции животных [Текст]: материалы международной научно-практической конференции, посвященной 75-летию со дня рожде-
29
ния и 50-летию научно-практической деятельности доктора ветеринарных наук, профессора Г. Ф. Медведева, (10-12 октября 2013 г.). - Горки: БГСХА, 2013. - С. 528-533.
2. Ж е л а в с ь к и й, М. М. Змши протимжробного потенщалу фагоципв за маститу корiв / М. М. Желавський // Проблеми зоошженери та ветеринарно! медицини: зб. наук. праць Харгавсько! державно! зооветеринарно! академп. Серiя «Ветеринарш науки». -2011. - Вип. 23, Т. 2, Ч. 2. - С. 438-440.
3. З в е р е в а, Г. В. Рекомендацп з профшактики неплщносп велико! рогато! худоби. Департамент ветеринарно! медицини Укра!ни / Г. В. Зверева, В. А. Яблонський, С. П. Хомин, Г. Г Харута, В. Й. Любецький. - К.: Науковий свгт, 2001. - 18 с.
4. К у з ь м и ч, Р. Г. Клиническое акушерство и гинекология животных / Р. Г. Кузьмич. - Витебск. - 2002. - 313 с.
5. К у з ь м и ч, Р. Г. Рекомендации по совершенствованию диагностики, лечения и профилактики при маститах у коров / Р. Г. Кузьмич, А. А. Летунович. - Витебск: УО ВГАВМ. - 2006. - 63 с.
6. М е д в е д е в, Г. Ф. Акушерство, гинекология и биотехника размножения сельскохозяйственных животных: учеб. пособие / Г. Ф. Медведев, К. Д. Валюшкин. - Минск: Беларусь, 2006. - 287 с.
7. Я б л о н с ь к и й, В. А. Апоптоз iмунокомпетентних кштин кровi корiв у перюд лактаци / В. А. Яблонський, М. М. Желавський // Науковий вюник Нацюнального аграрного ушверситету. - 2008. - Вип. 126. - С. 233-236.
8. Я б л о н с к и й, В. А. Изменение уровня циркулирующих иммунных комплексов и средних молекул при мастите коров / В. А. Яблонский, Н. Н. Желавский // Актуальные проблемы ветеринарного акушерства и репродукции животных [Текст]: материалы международной научно-практической конференции, посвященной 75-летию со дня рождения и 50-летию научно-практической деятельности доктора ветеринарных наук, профессора Г. Ф. Медведева, (10-12 октября 2013 г.). - Горки: БГСХА, 2013. - С. 484-489.
9. Я б л о н с к и й, В. А. Локальный иммунитет и апоптоз иммунокомпетентных клеток при субклиническом мастите коров / В. А. Яблонский, Н. Н. Желавский // Материалы Международной научно-практическая конференции «Современные проблемы ветеринарного обеспечения репродуктивного здоровья животных», посвященной 100-летию со дня рождения профессора В. А. Акатова, Воронеж, 27-29 мая, 2009 г. -Воронеж: Изд-во Истоки, 2009. - С. 393-397.
10. Variation in hepatic regulation of metabolism during the dry period and in early lactation in dairy cows / [van H. A. Dorland, S. Richter, I. Morel, M. G. Doherr et al.] // J. Dairy Sci. - 2009. - Vol. 92. - P. 1924-1940.
11. Local and systemic response to intra-mammary lipopolysaccharide challenge during long-term manipu-lated plasma glucose and insulin concentrations in dairy cows / [M. C.Vernay, M. B.Wellnitz, L. Kreipe, van H. A. Dorland et al.] // J. Dairy Sci. - 2012. -Vol. 95. - P. 2540-2549.
12. R a i n s, J. L. Hyperketonemia increases monocyte adhesion to endothelial cells and is mediated by LFA-1 expression in monocytes and ICAM-1 expression in endothelial cells / J. L. Rains, S. K. Jain // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. - 2011. - Vol. 301. - P. 298-306.
13. Staphylococcus aureus and Escherichia coli cause deviating expression profiles of cytokines and lactoferrin messenger ribonucleic acid in mammary epithelial cells / [B. Griesbeck-Zilch, H. D. Meyer, C. Kühn, M. Schwerin et al.] // J. Dairy Sci. - 2008. -Vol. 91. - P. 2215-2224.
14. W a l t, D. R. Optical methods for single molecule detection and analysis / D. R. Walt // Analytical Chem. - 2013. - Feb. 5. - Vol. 85 (3). - P. 1258-1263.
