CC BY
33ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ 1Хамидова Хуршеда, 2Шакиров Зоир, 3Каримов Хусниддин, 4Якубов Искандар
1,2'3'4Институт микробиологии Академии Наук Республики Узбекистан https://doi.org/10.5281/zenodo.8372171
Аннотация. Изучена фосфатмобилизующая способность 6 штаммов микромицетов и 3 штаммов молочнокислых бактерий из труднодоступного трикальцийфосфата. Показано, что все испытанные микромицеты в различной степени мобилизуют фосфат из фосфата кальция. Наиболее активными оказались молочнокислые бактерии, образующие кислоты, что подтверждает факт механизма растворения фосфора из труднодоступных фосфатов благодаря образованию органических кислот.
Ключевые слова: фосфор, микромицеты, молочнокислые бактерии, фосфатмобилизующая способность.
Abstract. The phosphate-mobilizing ability of 6 strains of micromycetes and 3 strains of lactic acid bacteria from hard-to-access tricalcium phosphate was studied. It was shown that all tested micromycetes mobilize phosphate from calcium phosphate to varying degrees. The most active were lactic acid bacteria, which form acids, which confirms the mechanism of phosphorus dissolution from hard-to-reach phosphates due to the formation of organic acids.
Keywords: phosphorus, micromycetes, lactic acid bacteria, phosphate-mobilizing ability.
Аннотация. 6 та микромицет штамми ва 3 та сут кислотали бактерия штаммларининг фосфатни мобилизация цилиш цобилияти цийин узлаштириладиган трикалций фосфатда урганилди. Барча текширилган микромицетлар фосфатни кальций фосфатдан турли даражада мобилизация цилишлари курсатилди. Энг фаол сут кислотаси бактериялари булиб, улар кислоталар %осил цилади, бу органик кислоталарнинг шаклланиши туфайли узлаштириш цийин булган фосфатлардан фосфорнинг эриш механизмини тасдицлайди.
Калит сузлар: фосфор, микромицет, сут кислотаси бактериялари, фосфатларни мобилизация цилиш цобилияти.
Для обеспечения страны продовольственными и сельскохозяйственными продуктами необходимо получение высокого и качественного урожая растительной продукции, повышение плодородия почвы. Одним из важнейших условий повышения продуктивности земледелия является степень обеспеченности растений фосфором. Фосфор - чрезвычайно важнейший биогенный элемент биосферы, который входит в состав таких макромолекул, как ДНК, РНК, ATP, фосфолипиды и некоторые кофакторы. Валовые запасы неорганического фосфора в почве достаточно велики, однако он находится в малодоступном для растений виде. Коэффициент использования растениями фосфора, получаемого из минеральных удобрений, чрезвычайно низкий - всего 10-15%, в то время как азота - 50% и калия 60-70%. Так как в природе не существует круговорота фосфора и он односторонне выносится из почвы вместе с урожаем, поэтому недостаток фосфора в почве может быть восстановлен лишь при внесении соответствующих удобрений. В структуре первичных минералов фосфор представлен слаборастворимыми фосфатами кальция и марганца - в нейтральных или щелочных почвах, железа и алюминия - в кислых почвах. Фосфор играет исключительно важную роль в процессах
обмена энергии в растительных организмах. Фосфориты представляют собой богатые фосфором образования, основная масса в них представлена в виде 3-х замещенного фосфата кальция. При этом большая часть фосфора находится в формах, недоступных для усвоения. Цикл превращения фосфора в почве происходит при непосредственном и активном участии микроорганизмов, которые участвуют в процессах растворения минеральных и органических фосфатов, связанных с кальцием и другими металлами[1,2].
В результате расщепления органических веществ, содержащих фосфор, образуется фосфорная кислота, которая сразу же связывается c основаниями почвы и переходит в труднорастворимые соли кальция, магния и железа. Эти соли кислотообразующие бактерии переводят в растворимые соли фосфорной кислоты [ 3,4] .
По значению в питании растений фосфор занимает одно из ведущих мест. Он относится к основным питательным элементам, обеспечивающим благоприятное влияние на рост и развитие растений, ускорение образования репродуктивных органов и созревание растений, формирование высоких и устойчивых урожаев сельскохозяйственных культур с благоприятным качеством товарной продукции. Наибольшую питательную ценность для культурных растений имеют легкоусвояемые соединения фосфора из почвы и удобрений. Перспективным направлением улучшения фосфорного питания сельскохозяйственных культур является биологическая фосфатмобилизация с помощью почвенных микроорганизмов (бактерий, актиномицетов, мицелиальных грибов), способствующая переводу труднорастворимых соединений фосфора из почвы и удобрений в доступные для высших растений формы [5].
Фосформобилизующие микроорганизмы превращают труднодоступные фосфаты органических и неорганических соединений фосфора в доступную для растений форму, благотворно влияющую на рост и развитие растений. Полезное действие микробов состоит еще и в том, что они активизируют развитие других полезных групп микроорганизмов: нитрификаторов и азотфиксаторов, чем повышают процент усвоения азота. Это происходит в силу нескольких причин: выделение микроорганизмами витаминов и фитогормонов, продукция ими антибиотиков, ингибирующих развитие патогенов; перевод минеральных элементов в доступную для растений форму. Так, среди микроорганизмов населяющих ризосферу известно большое количество бактерий и грибов способных мобилизовать труднорастворимые формы фосфатов. Среди них широко встречаются следующие виды бактерий: Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Enterobacter, Achromobacter, Agrobacterium, Microccocus и др. Органические соединения фосфора способны разлагать, микромицеты родов Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Rhizopus, Trichotecium, Alternaria, дрожжи Rhodotorula, Saccharomyces, Саndida, Нansenula. На сегодняшний день общепринято, что основным механизмом растворения минеральных фосфатов микроорганизмами является действие органических и неорганических кислот, продуцирующих микроорганизмами.
Таким образом, учитывая недостаток фосфорных удобрений в сельском хозяйстве, необходимо создание высокоэффективных биоудобрений с содержанием легкоусваиваемых форм фосфора и необходимо разработать новые методы интенсификации процесса синтеза метаболитов, активизации микробиологических, биохимических процессов в почве с участием азотфиксирующих, фосфатрастворяющих, ростстимулирующих и защищающих от фитопатогенов микроорганизмов.
В связи с этим, основной целью работы являлось изучение фосфатмобилизующей способности микромицетов, ранее выделенных из ризосферы различных сельхоз культур, а также молочнокислых бактерий для отбора наиболее активных фосфатмобилизующих микроорганизмов для создания в перспективе новых экологически чистых биопрепаратов.
Методика. Объектом исследования являлись микромицеты Trichoderma harzianum UzCF-28, T. harzianum UzCF -55, T. asperellum UzA-4, Penicillium canescens UzCF -54, Beauveria spp.7, Metarhizium spp.9 и молочнокислые бактерии Enterococcus hirae UzLA-12, Lactobacillus reuteri UzLA-15 и Lactobacillus plantarum UzLA- 21, ранее выделенные и сохраняемые в лаборатории путем пересевов.
Оценку фосфатмобилизующих свойств микромицетов проводили по образованию зоны просветления вокруг колоний на агаре при посеве в чашки Петри с агаризованной средой Пиковской с трикальцийфосфатом ( Са3(РО4)2 ) и индикатором бромкрезоловым синим, а также в пробирки со скошеннной агаризованной средой Пиковской с индикатором в динамике (24, 48, 72, 144 и далее до 240 часов). Исходный цвет питательной среды взятой в качестве контроля темно фиолетового цвета. В случае изменения реакции среды в кислую сторону под действием метаболитов, продуцируемых микроорганизмами происходило обесцвечивание питательной среды [6,7].
Определение общего количества титруемых кислот проводили по методу Ермакова А.И. [8]. Микромицеты выращивали в колбах Эрленмейера ёмкостью 300 мл, вносили по 100 мл питательной среды. Состав среды (г/л): сахароза-30; Са3(РО4)2 -100; (NH4)2SO4 -1,4; KH2PO4 - 2,0; CaCh - 0,3; MgSO4/H2O -0,3; вода водопроводная 1000,0 мл; pH 6,0. Культивировали при температуре 280С в шейкере 160 об/мин. Общее количество титруемых кислот в питательной среде проверяли в динамике (48, 96, 144 часа). Культуральную жидкость в количестве 5 мл помещали в конические колбы объемом 200 мл и добавляли в качестве индикатора 4-5 капель фенолфталеина и титровали 0,1 н раствором NaOH до появления устойчивой слабо розовой окраски. Общее содержание кислот в переводе на молочную выражали в процентах и вычисляли по следующей формуле:
ax100
X = -
b
где, a - количество см 0,1 н NaOH, израсходованное на титрование; b - объем культуральной жидкости взятой на титрование, х - общее количество титруемых кислот в данном эксперименте.
Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли стандартными методами расчета ошибок, средних, доверительных интервалов, стандартных отклонений. Все расчеты и математические анализы выполнены с помощью программы Microsoft Excel 2007.
Результаты исследования.
Изучение способности к мобилизации фосфата проводили в агаризованной среде с 5 г Ca3(PO4)2.
Фосформобилизующие свойства были изучены в динамике роста у ранее выделенных из ризосферы пшеницы, кукурузы и хлопчатника микромицетов T. harzianum UzCF-28, T. harzianum UzCF -55, T. asperellum UzA-4, P. canescens UzCF -54, Beauveria spр.7, Metarhizium spр.9.
Эксперименты показали, что через 24 часа изменился цвет питательной среды в пробирках, засеянных T. asperellum UzA-4 на 20%, T. harzianum UzCF -28- 30, T. harzianum UzCF-55-30%, незначительные изменения окраски питательной среды наблюдались у Metarhizium spp.9, P. canescens UzCF - 54. В образцах с Beauveria spp.7 окраска питательной среды не изменялась .
В 48-часовой культуре динамика обесцвечивания среды изменилась, наибольшую фосформобилизующую активность проявила Metarhizium spр.9, затем следовали следующие микромицеты в уменьшаемой последовательности P.canescens UzCF -54, T. harzianum UzCF -55, T.harzianum UzCF-28, T. asperellum UzA-4, наименьшую зону просветления проявила культура Beauveria spр.7 (рис1а,табл.1).
В 96 часовых культурах максимальное обесцвечивание среды наблюдалось у культуры Metarhizium spр.9, затем P. canescens UzCF -54, T. asperellum UzA-4, T. harzianum UzCF -55, T. harzianum UzCF-28 и также наименьшее у Beauveria spр.7.
В 144 часовых культурах полное отсутствие цвета наблюдалось у Metarhizium spр.9 и P.canescens UzCF -54 (100%), затем T. asperellum UzA-4 (100%), T. harzianum UzCF -55, T. harzianum UzCF-28 (65%), Beauveria spр.7 (рис.1в, табл.1). Было обнаружено, что Beauveria spр.7 производит наименьшее количество кислоты. Штаммы Metarhizium spр.9 и P. canescens UzCF -54 имели 100% солюбилизацию фосфатов (полное изменение окраски) за 6 дней, T. asperellum-4 также 100%, эта культура вначале проявила замедленный рост, а затем возможно за счет образования метаболитов (особенно это заметно в чашечном методе ( рис.2)), T. harzianum UzCF-28- 100%, Beauveria spр.7 -65%, T. harzianum UzCF-55-60%
: шнин ищг-
а 48 часов в 144 часа
Рис.1. Качественная оценка фосфатмобилизующей способности микромицетов (а -48-часовые культуры^- Metarhizium spр.9, B- P. canescens UzCF -54, С- T . harzianum UzCF -55, D- T. harzianum UzCF-28, E- T. asperellum UzA-4, F- Beauveria spр.7, J-контроль).
(в- 144 часовые культуры; А- Metarhizium spр.9, В- P. canescens UzCF -54, С- T. asperellum UzA-4, D- T. harzianum UzCF-28, E - Beauveria spр.7, F - T. harzianum UzCF-55, J-контроль).
На рисунках в пробирках (рис.1) видно изменение окраски среды под влиянием метаболитов, продуцируемых микромицетами по сравнению с контролем.
Таблица 1.
Качественная оценка фосфатмобилизующей способности микромицетов,%
Часы
Микромицеты 24 48 144 192 240
T. harzianum UzCF-28 30,0 50,0 65,0 70,0 80,0
T. harzianum UzCF- 55 30,0 55,0 65,0 65,0 70,0
T. asperellum UzA-4 20,0 45,0 90,0 85,0 100,0
P. canescens UzCF -54 30,0 65,0 100,0 100,0 100,0
Metarhizium spp.9 25,0 85,0 100,0 100,0 100,0
Beauveria spp.7 10,0 10,0 15,0 15,0 20,0
Рис.2 Зоны просветления образованные вокруг фосфатмобилизующих микромицетов (чашечный метод). а-24 часовая культура Т. ha.rzia.num UzCF- 55, в- 48 часовая Т. harzianum UzCF-28, с- 144 часовая Т. а$реге11ит UzA - 4.
На рисунке видны «прозрачные зоны», образующиеся вокруг колоний фосфатмобилизующих культур, на среде с фосфатом кальция в качестве единственного источника фосфора.
Таблица 2.
Общее количество титруемых кислот, выделяемых микромицетами, (%)
Микромицеты Время культивирования, часы
48 96 144
T. harzianum UzCF- 55 8,6±0,06 10,3±0,17 28,1±0,26
T. harzianum UzCF-28 15,3±0,13 24,0±0,21 27,0±0,23
Beauveria spp.7 4,8±0,26 4,2±0,06 13,3±0,15
Metarhizium spp.9 12,1±0,24 21,5±0,17 28,8±0,25
P. canescens UzCF -54 14,1±0,21 26,4±0,24 29,7±0,17
T. asperellum UzA - 4 8,8±0,09 21,1±0,21 18,1±0,12
Как показывают полученные результаты, количество выделяемых микромицетами титруемых кислот в культуральной жидкости колебалось через 48 часов от 4,8 до 15,3, в 96 часовых культурах от 4,2 до 26,4%. Наибольшее содержание титруемых кислот в культуральной жидкости образовывалось через 144 часа. Максимальное количество выделяли микромицеты P. canescеns UzCF-54 и Metarhizium &рр.9 (29,7 и 28,8% ) (Таблица 2).
Известно, что основным механизмом, с помощью которого микроорганизмы переводят в раствор фосфаты, является образование органических кислот[6], нам было интересно определить эти свойства у лактобактерий, известных кислотообразующей способностью. Фосфатмобилизующая способность была проверена у Enterococcus hirae UzLA-12, Lactobacillus reuteri UzLA-15 и Lactobacillus plantarum UzLA- 21. Уже через 7 часов после посева уколом в скошенные пробирки и глубинный посев в чашки Петри произошло 100% - ное обесцвечивание среды Пиковской, что подтверждает факт зависимости фосфатмобилизующей способности микроорганизмов c образованием кислот, наиболее эффективный механизм высвобождения фосфора из нерастворимого минерального сырья реализуется микроорганизмами через образование органических кислот.
Таким образом, одним из способов перевода труднорастворимых фосфатов в доступные для растений соединения является мобилизация фосфатов фосфатрастворяющими микроорганизмами.
REFERENCES
1. Муромцев Г.С., Маршунова Г.Н., Павлова В.Ф., Зольникова Н.В. Роль почвенных микроорганизмов в фосфорном питании растений. Успехи микробиологии, т.20, 1985 г.
2. Alori, E. T., Glick, B. R., and Babalola, O. O. (2017). Microbial phosphorus solubilization and its potential for use in sustainable agriculture. Front. Microbiol. 8:971. doi: 10.3389/fmicb.2017.00971
3. В. Н. Босак, Г. В. Сафронова, З. М. Алещенкова, О. Н. Минюк //Способ оптимизации фосфатного режима почвы при возделывании сельскохозяйственных культур // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты. - 2016. - Т. 8. -С.148-162.
4. Yanliang Wang&Hans Lambers Plant and Soil volume 447, pages135-156 (2020) https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2009.04489.x
5. T. Deepshikha, K. Rajesh, S. Vineet Phosphate solubilising microorganisms: role in phosphorus nutrition of crop plants
6. Белясова Н.А., Игнатовец О.С., Сергиевич Д.С., Минаковский А.Ф., Босак В.Н., Сачивко Т.В. Выделение и характеристика почвенных фосфатмобилизующих микроорганизмов // Журнал Вестник Белорусской государственной сельскохозяйственной академии. 2018. С. 93-97.
7. Mehta, S., Nautiyal, C. An Efficient Method for Qualitative Screening of Phosphate-Solubilizing Bacteria. Curr Microbiol 43, 51-56 (2001). https://doi.org/10.1007/s002840010259
8. Ермаков А.И. Методы биохимических исследований растений. Ленинград 1972, с.192-194.
