CC BY
246
УДК 614.4:615.28:61.001.5
ФОРМИРОВАНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ БАКТЕРИЙ К ЧЕТВЕРТИЧНЫМ АММОНИЕВЫМ СОЕДИНЕНИЯМ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ
В.В. Шкарин, О.В. Ковалишена, А.С. Благонравова,
О.Н. Воробьева, И.Г. Алексеева, Е.К. Яковлева, М.Л. Бугрова,
ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия»
Ковалишена Ольга Васильевна - e-mail: kovaiishena@maii.ru
В статье отражены современные представления об устойчивости микроорганизмов к дезинфицирующим средствам и механизмах её формирования. Рассмотрены различные варианты воздействия заниженных концентраций дезинфектантов, которые можно воспроизвести в
лабораторных условиях. Представлены результаты эксперимента по формированию приобретенной индуцированной резистентности тест-штамма E. coli к дезинфицирующему средству из группы четвертичных аммониевых соединений (ЧАС) в лабораторных условиях. Дана оценка изменений микробиологических свойств, чувствительности к антибиотикам и дезинфектанту, выполнена электронная микроскопия бактерий в процессе формирования устойчивости. Получены доказательства возможности формирования устойчивости микроорганизмов к дезинфицирующим средствам на основе ЧАС под влиянием повторных воздействий заниженных концентраций в лабораторных условиях, установлены сроки её появления.
Ключевые слова: устойчивость к дезинфектантам, механизмы устойчивости, дезинфицирующие средства, четвертичные аммониевые соединения.
This article shows the modern views of the resistance of microorganisms to disinfectants and mechanisms of its formation. Different versions of the impact of subbactericidal concentrations of disinfectants, which can be replicated in laboratory conditions. The results of experiments on the formation of induced acquired resistance by the test strain of E.coli to disinfectants from the group of quaternary ammonium compounds (QAC) in the laboratory. The estimation of changes in the microbiological properties, sensitivity to antibiotics and disinfectants, performed electronic microscopy of bacteria in the process of resistance appearance. Any evidence of the possibility of microbial resistance to QAC-containing disinfectants under the influence of repeated impacts of subbactercidal concentrations in laboratory conditions, the time frame of its appearance.
Key words: resistance to disinfectants, mechanisms of resistance, disinfectants,
quaternary ammonium compounds.
Введение
Длительное время существовала точка зрения, разделяемая многими исследователями, об отсутствии устойчивости микроорганизмов к дезинфицирующим средствам (ДС) и невозможности её формирования вследствие особенностей повреждающего действия средств химической дезинфекции на микробные клетки. В последние десятилетия число сообщений о выявлении устойчивых к ДС микроорганизмов увеличилось, что привело к признанию специалистами факта приобретения некоторыми штаммами резистентности к воздействию дезинфектантов в рекомендуемых для дезинфекции концентрациях и экспозициях [1-4].
Механизмы формирования устойчивости к дезсредствам изучены недостаточно, хотя к настоящему времени накоплены научные данные о наиболее общих механизмах резистентности микроорганизмов к антибактериальным средствам (АБС), включающим: мутационную и плазмидную устойчивость; активное выведение АБС (эффлюкс); инактивацию веществ в клетке; механизмы снижения проницаемости внешних структур бактерий; метаболическую и ферментную трансформацию, деградацию биоцидов в клетке; а также модификацию мишени действия АБС [5-10]. Отдельные исследования посвящены изучению изменений микроорганизмов под влиянием ДС [11-13]. Тем не менее, до сегодняшнего дня представления об устойчивости микроорганизмов к ДС существенно различаются и варьируют от
полной расшифровки механизмов к некоторым ДС у отдельных бактерий до отсутствия какой-либо информации о процессах, лежащих в основе её формирования.
Одним из механизмов формирования устойчивости бактерий является адаптация к систематическому воздействию ДС, сопровождающаяся фенотипическими изменениями клеток. Отдельные исследователи обращают внимание на то, что в большинстве случаев устойчивость микроорганизмов к биоцидам возникает как результат неправильного применения (занижение концентраций) или хранения последних (снижение биоцидной активности) [7]. В целом ряде публикаций отмечается, что рост резистентности происходит за счет селекции устойчивых вариантов под действием низких концентраций биоцидов [14-17]. Это согласуется с данными некоторых исследователей, которые указывают на изменения поверхностных структур клетки под действием ДС (bleb formation) [12, 13].
Воздействие заниженных концентраций ДС можно воспроизвести в лабораторных условиях, изменяя условия культивирования микроорганизмов. Однотипные изменения условий культивирования с периодичностью 1 раз в одну или более генераций (часы или сутки) называют переменными режимами, т. к. одна генерация бактерий испытывает влияние измененных условий (воздействие ДС), а следующая за ней - нет, и такое чередование происходит многократно. Если изменение условий (воздействие ДС) ведет к
РАЗДЕЛ IV
РАЗДЕЛ IV
IVK
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
повреждению клеточных структур или к торможению внутриклеточных процессов, то возврат к начальным условиям роста может сопровождаться репарационными процессами. Если частота повторения смены условий составляет минуты, в результате чего одно поколение подвергается многократным однотипным воздействиям или сменам условий, то такие режимы можно назвать циклическими. Как при переменных, так и при циклических режимах, культура бактерий постоянно находится в переходных состояниях, что может привести к проявлению таких ее свойств, которые не наблюдались ранее при стационарном (установившемся) состоянии популяции.
Задачами данного исследования было установление возможности искусственного формирования приобретенной индуцированной резистентности микроорганизмов к ДС из группы четвертичных аммониевых соединений (ЧАС), определение условий ее выработки и выявление изменений свойств микроорганизма в процессе появления устойчивости.
Материалы и методы
Для решения поставленных задач был проведен лабораторный эксперимент на основе разработанного «Способа определения чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующему средству (варианты)» (Шкарин В.В., Ковалишена О.В., Благонравова А.С. и др. Патент 2378363 РФ).
Объектом исследования послужил микроорганизм Escherichia coli шт. 1257, использующийся в соответствии с Российскими требованиями в качестве тест-штамма для оценки бактерицидной активности ДС в отношении грам-отрицательных бактерий при регистрационных испытаниях дезинфектантов, обладающий типичными морфологическими, тинкториальными, культуральными свойствами, присущими данному виду.
Воздействия осуществляли ДС из группы ЧАС, зарегистрированным в установленном порядке и разрешенным к применению в лечебно-профилактических организациях (ЛПО). Выбор ДС из данной группы для проведения эксперимента обусловлен широким применением этих химических соединений в ЛПО, значительной распространенностью и возможностью относительно быстрого формирования устойчивости микроорганизмов к данным веществам.
Определение антибиотикорезистентности проводилось диско-диффузионным методом согласно Методическим указаниям по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (МУК 4.2.1890 -04). Набор антибиотиков для E. coli включал ампициллин, цефтриаксон, ципрофлоксацин, гентамицин, канамицин.
Чувствительность микроорганизмов к дезинфектантам изучалась в соответствии со Способом определения чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующему средству (варианты). Оценка чувствительности проводилась по следующим параметрам:
• штамм чувствителен к действию ДС - роста нет;
• неполное бактерицидное действие ДС - рост 1-99 КОЕ/мл;
• суббактерицидное действие ДС - рост 100-299 КОЕ/мл;
• штамм устойчив к воздействию ДС - рост 300 и более КОЕ/мл.
Электронно-микроскопическое исследование проводилось следующим образом: материал фиксировали в 2,5%
растворе глутарового альдегида с последующей дофиксаци-ей 1%-м раствором осмиевой кислоты, обезвоживанием в спиртах возрастающей концентрации и заливкой в эпоксидные смолы смеси аралдит и эпон 812. Полутонкие и ультра-тонкие срезы готовились на ультратоме Ultracut фирмы Reichert-jung и просматривались на трансмиссионном электронном микроскопе Morgagni 268D фирмы FEI с последующим выводом изображения на экран компьютера через видеокамеру Mega View III и фотографированием. Проводился подсчет общего числа бактерий, делящихся форм в 10 полях зрения (площадью 52,76 мкм) методом случайной выборки, измерение толщины клеточной стенки, оценка морфологии клеток.
Этапы эксперимента.
1. Подбор суббактерицидной концентрации ДС.
2. Экспериментальное формирование устойчивости к ДС.
3. Оценка чувствительности микроорганизмов к бактерицидной концентрации ДС в течение всего периода эксперимента после каждого воздействия ДС в суббактерицидной концентрации.
4. Изучение микробиологических свойств тест-штамма для комплексной оценки изменений в ходе эксперимента (культуральные, морфологические, тинкториальные свойства культуры, оценка подвижности микроорганизма, биохимическая активность, чувствительность к антибиотикам, чувствительность к ДС в бактерицидной концентрации).
Результаты и их обсуждение
На начальном этапе была проведена серия опытов по подбору неполной бактерицидной и суббактерицидной концентрации дезинфектанта. В таблице 1 продемонстрирована чувствительность тест-микроорганизма к ДС в режиме, рекомендованном Инструкцией по применению для дезинфекции различных объектов при бактериальных (кроме туберкулеза) инфекциях и в заниженных концентрациях при фиксированной экспозиции воздействия.
ТАБЛИЦА 1.
Подбор концентрации ДС, оказывающей неполное бактерицидное действие на E. coU шт. 1257 (фрагмент исследования)
№ опыта Рост микроорганизма при различных концентрациях ДС (%)
0,5* 0,1** 0,05** 0,02**
1 рн рн рн 30 КОЕ
2 рн рн рн 160 КОЕ
3 рн рн рн 45 КОЕ
Оценка чувствительности микроорганизма полная чувствительность полная чувствительность полная чувствительность неполная чувствительность
Примечание: * - концентрация и время воздействия ДС, рекомендованные Инструкцией, ** - заниженная концентрация ДС, *** - применялась фиксированная экспозиция 60 минут, рекомендованная Инструкцией, РН - роста нет.
В результате серии опытов была определена концентрация раствора ДС, после воздействия которой часть микробных клеток сохраняла свою жизнеспособность. Данная концентрация рассматривалась как суббактерицидная и в дальнейшем использовалась в качестве рабочей при проведении эксперимента по выработке устойчивости к ЧАС.
На следующем этапе исследования выполнялся основной эксперимент по формированию устойчивости к ЧАС в рабочей концентрации. Производилось систематическое воздействие
ДС на штаммы, которые сохраняли жизнеспособность после предыдущего воздействия.
В ходе эксперимента:
• после каждого воздействия ДС оценивался рост культур на чашках Петри; из нескольких колоний готовили мазки с окраской по Граму;
• при обнаружении роста от 1 до 299 КОЕ/мл на чашке Петри несколько изолированных колоний (от 5 до 10) пересевали на скошенный питательный агар (инкубация при t= 37° в течение 24-48 часов);
• штаммы из выросших колоний включались в эксперимент и последующее воздействие дезинфектантом в рабочей концентрациии производилось уже на них.
Таким образом, было выполнено 6 серий воздействий дезинфицирующего средства.
В ходе выполнения эксперимента отмечались определенные изменения культуры микроорганизма (таблица 2).
После первого и второго воздействия культуральные, тин-кториальные, морфологические, биохимические и др. свойства микроорганизма не изменились (рис. 1а).
После третьего воздействия ДС отмечен ряд изменений. Культуральные свойства: на плотной питательной среде Эндо выросли плоские красные колонии, характеризующиеся полиморфизмом, диаметром 0,06-0,8-1,5 мм с выраженным сильнее обычного слизеобразованием. Биохимические свойства, антибиотикограмма без изменений, штамм чувствителен к воздействию бактерицидной концентрации ДС.
После четвертого воздействия наблюдались выраженные изменения. Культуральные свойства: на плотных питательных средах отмечается диссоциация на Б и К формы, полиморфизм колоний по размеру - обычные колонии диаметром 1,5-2,5 мм и мелкие диаметром 0,3-0,5 мм, характеризующихся выраженным слизеобразованием, не характерным для интактных палочек, поверхность колоний неровная.
Морфологические свойства (световая микроскопия): полиморфные по размеру грамотрицательные тонкие и
утолщенные палочки, встречаются вытянутые формы, достигающие 6,0-9,0 мкм в длину. Биохимические свойства без изменений, штамм чувствителен к антибиотикам и воздействию бактерицидной концентрации ДС.
После пятого воздействия отмечено нарастание интенсивности изменений (рис. 1б). Культуральные свойства: на плотных питательных средах усилился полиморфизм колоний по размеру с преобладанием мелких колоний диаметром менее 1 мм. Отмечается выраженное слизеобразование, не характерное для интактных палочек. На среде Эндо часть колоний бледно окрашены, тусклые. Морфологические свойства (световая микроскопия): полиморфные по размеру грамо-трицательные тонкие и утолщенные палочки с закругленными, вытянутыми и загнутыми концами. Встречаются вытянутые формы, достигающие 6,0-9,0 мкм в длину. При проведении электронной микроскопии установлено, что палочки укрупнены, набухли, видна неровная поверхность клеток. Жгутики и реснички присутствуют в препарате, но оторваны. Клетки внешне изменены, имеют утолщенную и гофрированную поверхность клеточной стенки, спаянной с цитоплазмой. У погибших клеток клеточная стенка отделена, свернута в кольцевые структуры. Цитоплазма клеток неоднородна, имеются просветы и разрывы. Видны нити и спирали ДНК. Рибосомы смещены к периферии клеток. Появились электронно-плотные черные зерна по 2-3-5 в клетке. Делящихся клеток мало, формы и стадии деления нарушены.
Антибиотикограмма без изменений. При оценке воздействия бактерицидной концентрации ДС отмечен рост, выявлена неполная чувствительность культуры к ДС - в разных сериях обнаружен рост от 15 до 69 КОЕ.
Штаммы, сохранившие жизнеспособность после шестого воздействия, характеризовались следующими изменениями. Культуральные свойства: на плотных питательных средах выявлен резко выраженный полиморфизм колоний по размеру и форме с подавляющим преобладанием мелких колоний диаметром до 1 мм. Отмечается обильное слизеобразование. На среде Эндо часть колоний бледно окрашены,
ТАБЛИЦА 2.
Обобщенная характеристика изменений микробиологических свойств E. шт. 1257 в ходе эксперимента
Свойства культуры Порядковый номер воздействия ДС в рабочей концентрации
1 2 3 4 5 6
Тинкториальные Грам- Грам- Грам- Грам- Грам- Грам-
Культуральные (на мясо-пептонном агаре, среде Эндо) Нет Нет На Эндо колонии обычного размера, с более выраженным блеском, слизистые На Эндо полиморфизм колоний по размеру, более выраженным слизеобразованием На Эндо преобладают мелкие колонии до 1 мм. Бледные, тусклые колонии. Выраженное слизеобразование Обильное слизеобразование, преимущественно мелкие тусклые колонии, выраженный полиморфизм
Морфологические (микроскопические) Нет Нет Нет Полиморфизм клеток по размеру, отдельные палочки длиной 6-9 мкм Полиморфизм клеток по форме, размеру, отдельные палочки длиной 6-9 мкм Полиморфизм по форме, размеру, большое кол-во вытянутых форм
Морфологические (электронно- микроскопические) - - - Крупные набухшие палочки с неровной КС (Фото 1б) Полиморфизм, гофрированная КС, «полюсные шапочки» (Фото 1в)
Биохимические (на агаре Олькеницкого) Нет Нет Нет Нет Нет Нет
Подвижность Хорошая Хорошая Хорошая Хорошая Хорошая Хорошая
Антибиотико- чувствительность Ч Ч Ч Ч Ч Ч
Чувствительность к бактерицидной концентрации ДС РН РН РН РН Неполная чувствительность (рост 15-69 КОЕ) Сплошной рост
Примечание: Ч - чувствителен; РН - роста нет.
РАЗДЕЛ IV
РАЗДЕЛ IV
IVK
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
тусклые. Морфологические свойства (световая микроскопия): полиморфные по форме и размеру грамотрицательные тонкие и утолщенные палочки с закругленными, вытянутыми и загнутыми концами. В большом количестве встречаются вытянутые формы, достигающие 6,0-9,0 мкм в длину. Электронно-микроскопическая картина выглядела следующим образом (рис. 1в). Общий вид: клетки внешне резко изменены, поверхность их неровная. В большом количестве присутствуют однополярно вытянутые палочки с загнутым концом, клетки в форме капли, а также клетки, утратившие обычную форму. Клеточная стенка утолщена, контурирова-на, неровная, имеет гофрированный вид, по всей поверхности плотно спаяна с цитоплазматической мембраной. На полюсах некоторых палочек видны утолщения клеточной стенки в виде «полюсной шапочки» толщиной около 12 нм. По сравнению с центральной частью палочки, где клеточная стенка имеет толщину около 2 нм, «шапочки» толще в 6-7 раз. Цитоплазматическая мембрана многих клеток разрушена и практически не визуализируется; сохранившаяся цитоплазматическая мембрана неоднородна, имеются просветы. Рибосомы во всех клетках расположены по периферии, их количество уменьшено. Видны электронно-плотные зерна по 2-3-5 мм в клетке. Вакуоли, нити ДНК не визуализируются. Делящихся клеток мало, формы деления нарушены. Есть очень длинные E. coli, по виду не разделившиеся.
При проведении исследований чувствительности штамма к испытуемому ДС выявлена устойчивость к бактерицидной концентрации.
При измерении толщины клеточных стенок в ходе эксперимента установлено, что толщина клеточных стенок интакт-
РИС. 2.
Сравнение толщины клеточной стенки интактных и устойчивых к ЧАС Е. соИ.
ных микроорганизмов находилась в пределах от 0,01 мкм до 0,05 мкм (в среднем 0,03+0,0002 мкм), толщина клеточных стенок устойчивых штаммов колебалась от 0,01 до 0,11 мкм (в среднем 0,06+0,0009 мкм) (рис. 2). Таким образом, толщина клеточных стенок устойчивых палочек была в 1,1-6 раз больше по сравнению с интактными, что свидетельствует об участии внешних структур E. coli в формировании индуцированной устойчивости к ДС на основе ЧАС.
Таким образом, в результате проведенного эксперимента получены доказательства возможности формирования устойчивости микроорганизмов к ДС на основе ЧАС под влиянием повторных воздействий заниженных концентраций в лабораторных условиях.
Выводы
1. Экспериментально доказано формирование устойчивости бактерий к ДС, что подтверждает возможность появления устойчивых вариантов микроорганизмов в клинических условиях.
2. Установлено, что систематическое воздействие заниженных до суббактерицидных концентраций ДС приводит к формированию устойчивости тест-штаммами микроорганизмов. На основании этого можно утверждать, что клинические изоляты, способные быстро, по сравнению с эталонными, адаптироваться к различным неблагоприятным условиям, могут вырабатывать устойчивость к применяемым на практике дезинфектантам.
3. Показано изменение морфологии, физиологии и биохимических свойств E. coli при формировании устойчивости к ДС. Морфологические и физиологические изменения анатомической структуры клетки являются проявлениями адаптационных процессов в результате многократных повторных воздействий ДС в ходе выработки устойчивости.
ЛИТЕРАТУРА
1. Маркович Н.И., Сергевнин В.И., Сармометов Е.В. и др. Вспышка синегнойной инфекции среди новорожденных в отделении реанимации и интенсивной терапии. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2010. № 3 (52). С. 5-10.
2. Сергевнин В.И., Зуева Н.Г., Азанов П.Б. и др. Устойчивость к дезинфектантам и антисептикам Klebsiella pneumonia, выделенной в акушерском стационаре при неединичной заболеваемости новорожденных гнойносептическими инфекциями. Дезинфекционное дело. 2011. № 3. С. 41-45.
3.Tambe S.M., Sampath L., Modak S.M. In vitro evaluation of risk of developing bacterial resistance to antiseptics and antibiotics used in medical devices. J. Antimicrob Chemother. 2001. № 47. P. 589-598.
4. White D.G., McDermott P.F. Biocides, drug resistance and microbial evolution // Current Opinion in Microbiology. 2001. Vol. 4. Is. 3. P. 313-317.
РИС. 1. Е. соИ шт. 1257
а - интактная; б - с неполной чувствительностью к ЧАС (5-е воздействие); в - устойчивая к ЧАС (6-е воздействие).
5.Гудкова Е.И., Адарченко А.А., Слабко И.Н. и др. Микробиологический мониторинг госпитальных эковаров условно-патогенных бактерий-возбудителей внутрибольничных инфекций. Медицинские новости. 2003. № 3. С. 11-15, 46.
6. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии. /Под ред. Л.С. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова. Смоленск: МАКМАХ, 2007. 464 с.
7. Assesment of the Antibiotic Resistance Effects of Biocides: Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks (SCENIHR). 28th plenary on 19 January 2009 [электронный ресурс]. Режим доступа: http: ec. europa.eu/health/ph_risk/risk_en.htm.
8. Fernandes P., Ferreira B.S., Cabral J.M.S. Solvent tolerance in bacteria: role of efflux pumps and cross-resistance with antibiotics. International Journal of Antimicrobial Agents. 2003. Vol. 22. Is. 3. P. 211-216.
9. Russell A.D. Mechanisms of bacterial resistance to biocides. Int. Biodeterior. Biodegrad. 1995. Vol. 36. P. 247-265.
10. Sheldon A.T. Antiseptic «resistance»: real or perceived threat? Clin. Infect. Dis. 2005. V. 40. Р. 1650-1656.
11. Бахолдина С.И., Шубин Ф.Н., Санина Н.М., Соловьева Т.Ф. Действие фенола на бактерии Yersinia pseudotuberculosis, культивированные в различ-
ных средах. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011. № 6. С. 64-69.
12. Гаврилова И.А., Титов Л.П. Применение атомно-силовой микроскопии для оценки изменений бактериальных клеток при воздействии дезинфектанта. Материалы II Международного Конгресса по внутрибольничным инфекциям (Москва, 23-24 ноября 2011 г.). М. 2011. С. 18-19.
13. Yoshimatsu T., Hiyama K. Mechanism of the action of didecyldimethylammonium chloride (DDAC) against Escherichia coli and morphological changes of the cells. Biocontrol Sci. 2007. Vol. 12 (3). P. 93-99.
14. Gomez Escalada, M., Harwood, J.L. Triclosan inhibition of fatty acid synthesis and its effect on growth of E. coli and P. aeruginosa. J. Antimicrob. Chemother. 2005. Vol. 55. P. 879-82.
15. Langsrud S., Sidhu M.S., Heir E., Holck A.L. Bacterial disinfectant resistance - a challenge for the food industry. Int. Biodeter. Biodegrad. 2003. Vol. 51. P. 283-90.
16. Maillard J.-Y. Bacterial resistance to biocides in the health care environment: should it be of genuine concern? J. Hosp. Infect. 2007. Vol. 65 (Suppl 2). P. 60-72.
17. Thomas L., Russell A.D., Maillard J.-Y. Antimicrobial activity of chlorhexidine diacetate and benzalkonium chloride against Pseudomonas aeruginosa and its response to biocide residues. J. Appl. Microbiol. 2005. Vol. 98. P. 533-43.
РАЗДЕЛ IV
