CC BY
73
NK
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
УДК 616.001.6-036.22
ФОРМИРОВАНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ ENTEROBACTER CLOACAE И PSEUDOMONAS AEROGENOSA К ДЕЗИНФЕКТАНТАМ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ БАКТЕРИЦИДНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ПРЕПАРАТОВ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
В.И. Сергевнин1, Т.В. Клюкина2, Э.О. Волкова2, Н.И. Решетникова2, Н.М. Ключарева3,
1ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет им. акад. Е.А. Вагнера», 2Пермский краевой госпиталь для ветеранов войн,
3МУ «Городская больница № 1 им. акад. Е.А. Вагнера», г. Березники, Пермский край
Сергевнин Виктор Иванович - e-mail: viktor-sergevnin@mail.ru
В экспериментальных условиях установлено, что на тест-объектах из дерева и пластика штамм E. cloacae, обладающий неполной чувствительностью к дезинфектантам группы четвертично-аммониевых соединений, приобретает устойчивость к препаратам в концентрации, являюшейся по отношению к эталонным штаммам микроорганизмов бактерицидной после 2-12-го воздействия. Штаммы P. aeruginosa, обладающие неполной чувствительностью к хлорсодержашему дезинфектанту, приобретают устойчивость к препарату в бактерицидной концентрации после 3-4-го воздействия. Приобретенная резистентность P. aeruginosa к хлорсодержашему дезинфектанту формируется преимущественно у пигментных вариантов бактерий.
Ключевые слова: дезинфицирующие средства, бактерицидная концентрация, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, формирование устойчивости в эксперименте.
In experimental conditions it was found that the test objects made of wood and plastic strain of E. cloacae with incomplete sensitivity to disinfectants group, Quaternary ammonium compounds, acquired resistance to the drug concentration, which is compared to the reference strains of microorganisms antibacterial, after a 2-12 impacts. The P. aeruginosa strains with incomplete sensitivity to chlorine containing the disinfectant, develop resistance to the drug in bactericidal concentration after 3-4 impacts. Acquired resistance of P. aeruginosa to the chlorinated disinfectant is formed mainly in pigmented variants of bacteria.
Key words: disinfectant, bactericidal concentration, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, resistance in the experiment.
В последние десятилетия увеличилось количество сообщений о выявлении возбудителей гнойно-септических инфекций (ГСИ), устойчивых к дезинфицирующим средствам (ДС) [1, 2, 3]. Отмечается, что рост резистентности микроорганизмов происходит за счет селекции устойчивых вариантов под действием низких концентраций ДС [4, 5, 6, 7]. Вместе с тем вопрос о том, возможна ли выработка резистентности возбудителей ГСИ к ДС на фоне воздействия препаратов в бактерицидной концентрации, остается не ясным.
Цель работы: изучить возможность формирования индуцированной резистентности возбудителей ГСИ к дезинфектантам в концентрации, являющейся по отношению к эталонным штаммам микроорганизмов бактерицидной.
Материал и методы
Чувствительность микроорганизмов к ДС оценивали в соответствии с методическими рекомендациями [8]. В качестве контрольных культур использовали E. coli № 1257 и S. aureus № 906, стандартно применяемых для определения бактерицидного действия дезинфектантов. Штамм микроорганизмов считали чувствительным к ДС в изучаемом режиме при отсутствии роста микроорганизмов на питательной среде после обработки, не полностью чувствительным - при наличии роста бактерий от 1 до 299 КОЕ/мл, устойчивым - при росте 300 КОЕ/мл и более. В эксперименте использовали штамм Enterobacter cloacae,
выделенный в перинатальном центре от новорожденного, и четыре штамма Pseudomonas aeruginosa, изолированных от пациентов хирургического стационара. Штамм E. cloacae имел неполную чувствительность к препаратам на основе четвертично-аммониевых соединений (ЧАС) и альдегида (препарат М), ЧАС и амина (препарат А), ЧАС, амина и гуанидина (препарат Ф) и только ЧАС (препарат Б) на тест-объектах из дерева и пластика. Штаммы P. aeruginosa отличались неполной чувствительностью к хлорсодержа-щему дезинфектанту Х (натриевая соль дихлоризоциану-ровой кислоты и поверхностно-активные вещества) на тест-объекте из дерева. К началу эксперимента все штаммы P. aeruginosa визуально были беспигментными.
В экспериментах применяли антибактериальные концентрации ДС, предусмотренные инструкциями - применительно к E. cloacae использовали ДС на основе ЧАС в концентрациях 0,01-0,1% при экспозиции обработки 60 минут, применительно к P. aeruginosa - препарат Х в концентрации 0,015% при экспозиции 15 минут.
В ходе исследований на тест-объектах проводили ежедневное воздействие ДС на штаммы E. cloacae и Р. aeruginosa, имеющие неполную чувствительность к тем же дезинфектантам на тех же тест-объектах. Иными словами, ежедневно осуществляли воздействие дезинфектанта-ми на те штаммы, которые сохранили жизнеспособность после предыдущего воздействия. Воздействия осуществляли до выработки устойчивости бактерий к ДС, т. е. до
▲1
SSM
момента перехода от неполной чувствительности к устойчивости.
Оценку достоверности различий показателей определяли с помощью t-критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение
Оценка влияния на E. cloacae препарата М показала (таблица 1), что на тест-объекте из дерева уже после 2-го воздействия по сравнению с фоном отмечено достоверное увеличение количества выросших колоний - с 2,7±0,8 до 24,7±5,8 КОЕ (р<0,05). После 3-го и 4-го воздействий количество бактерий (6,7±1,6 и 10,0±3,2) также статистически значимо превышало фоновый показатель, но бактерицидное действие оставалось неполным. После 5-го воздействия ДС на питательной среде выросло >300 КОЕ, т. е. E. cloacae приобрел устойчивость. На пластике уже после 2-го воздействия возбудитель приобрел устойчивость - количество колоний составило >300. Таким образом, E. cloacae, обладающий неполной чувствительностью к рабочему раствору препарата М, приобрел устойчивость к дезинфектан-ту на тест-объекте из дерева после 5-го воздействия, на тест-объекте из пластика - после 2-го воздействия.
Изучение действия на E. cloacae препарата А выявило (таблица 1), что на тест-объекте из дерева уже после 2-го воздействия по сравнению с фоном отмечено достоверное увеличение количества выросших колоний бактерий -с 19,0±2,3 до 45,3±8,3 КОЕ (р<0,05). После 3-9-го воздействия количество бактерий (39,7±2,6 - 110,0+14,2) продолжало статистически значимо превышать количество колоний фона при неполном бактерицидном действии. Сходные результаты были получены и на пластике. После 2-го воздействия произошло увеличение количества колоний с 10,0+1,9 (фон) до 56,3+ 6,1 (р<0,05). После 3-9-го воздействия количество бактерий (42,3+6,2 -91,7+18,3) сохранялось повышенным, но бактерицидное действие препарата оставалось неполным. После 10-го воздействия ДС на дереве и пластике выросло соответственно >300 КОЕ. Таким образом, E. cloacae с неполной чувствительностью к препарату А приобрел устойчивость к дезинфектанту на тест-объектах из дерева и пластика после 10-го воздействия.
Оценка действия на E. cloacae препарата Ф позволила установить (таблица 2), что на дереве количество колоний по сравнению с фоном возросло после 4-го воздействия с 7,3+2,2 до 180,0+14,2 (р<0,05) и в дальнейшем после 5-9-го воздействия держалось примерно на таком же уровне (96,0+12,2 - 172,0+6,5). После 10-го воздействия количество микроорганизмов составило >300 КОЕ. На пластике по сравнению с фоном (149,7+16,3) после 2-8-го воздействия отмечено статистически значимое снижение количества микроорганизмов до 10,0+4,8 -77,3+12,9. Однако после 9-го воздействия количество КОЕ возросло до 135,0+10,7, т. е. до исходного уровня. После 10-го воздействия количество колоний оказалось >300. Таким образом, E. cloacae с неполной чувствительностью к препарату Ф оказался устойчивым к дезинфектанту на тест-объектах из дерева и пластика после 10-го воздействия.
Оценка влияния на E. cloacae препарата Б показала (таблица 2), что на дереве в течение девяти воздействий количество бактерий колебалось от 1,0+1,1 - 8,0+2,6 до 23,3+5,4 - 58,3+12,5, оказываясь то ниже, то выше фоно-
вого показателя (39,3+5,9). После 10-го и 11-го воздействий количество микроорганизмов возросло до 216,7+28,6 и 258,3+11,4 соответственно. После 12-го исследования количество колоний составило >300. Таким образом, E. cloacae с неполной чувствительностью к препарату Б приобрел устойчивость к дезинфектанту на тест-объекте из дерева после 12-го воздействия.
ТАБЛИЦА 1.
Результаты многократных воздействий на E. cloacae рабочих растворов дезинфицирующих препаратов М и А
Сроки исследования обработанных тест-объектов Кол-во КОЕ микроорганизма, выявленных на обработанных дезинфектантом тест-объектах, M±m
М А
дерево пластик дерево пластик
До обработки (фон) 2,7±0,8 80,7±13,2 19,0±2,3 10,0±1,9
После 1-го воздействия 3,0±1,2 75,7±4,6 24,0±2,6 9,0±3,3
После 2-го воздействия 24,7±5,8 >300 45,3±8,3 56,3±6,1
После 3-го воздействия 10,0±3,2 - 47,0±2,6 45,3±2,9
После 4-го воздействия 6,7±1,6 - 52,3±10,7 51,3±5,8
После 5-го воздействия >300 - 39,7±2,6 42,3±6,2
После 6-го воздействия - - 43,3±11,5 50,0±-9,4
После 7-го воздействия - - 96,7±17,9 63,3±17,9
После 8-го воздействия - - 110,0±14,2 91,7±18,3
После 9-го воздействия - - 81,3±10,3 86,0±12,7
После 10-го воздействия - - >300 >300
ТАБЛИЦА 2.
Результаты многократных воздействий на E. cloacae рабочих растворов дезинфицирующих средств Ф и Б
Сроки исследования обработанных тест-объектов Кол-во КОЕ микроорганизма, выявленных на обработанных дезинфектантом тест-объектах, M±m
Ф Б
дерево пластик дерево
До обработки (фон) 7,3±2,2 149,7±16,3 39,3±5,9
После 1-го воздействия 10,0±4,8 178,0±11,3 23,3±5,4
После 2-го воздействия 10,7±6,2 52,0±6,5 1,0±1,1
После 3-го воздействия 4,7±1,9 38,3±2,5 10,3±7,8
После 4-го воздействия 180,0±14,2 10,0±4,8 26,7±5,8
После 5-го воздействия 170,0±32,7 25,0±3,6 3,7±3,9
После 6-го воздействия 111,7±12,5 35,0±8,4 23,7±5,6
После 7-го воздействия 96,0±12,2 77,3±12,9 58,3±12,5
После 8-го воздействия 151,3±5,7 73,3±8,3 8,0±2,6
После 9-го воздействия 172,0±6,5 135,0±10,7 8,0±2,6
после 10-го воздействия >300 >300 216,7±28,6
после 11-го воздействия - - 258,3±11,4
после 12-го воздействия - - >300
Результаты второго эксперимента показали, что уже на фоне обработок штаммов P. aeruginosa дезинфектантом отмечен рост не только беспигментных колоний бактерий, но и колоний с пигментом. При этом динамика приобретения устойчивости к ДС колоний без пигмента и с пигментом штаммов № 1, № 2 (рис. 1) и № 3, № 4 (рис. 2) существенно различалась.
При обработке штаммов № 1 и № 2 устойчивость приобрели как беспигментные, так и пигментные варианты P. aeruginosa. Так, количество беспигментных колоний штамма № 1 после 1-3-го воздействия ДС колебалось от 11,0±0,7 до 21,4±9,0 при фоне 11,0±1,4. После 4-й обработки
NK
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
интенсивность роста микроорганизмов (48,0±5,7) по сравнению с фоном увеличилась в 4,4 раза (р<0,05), а после 5-й обработки беспигментные колонии приобрели устойчивость к ДС - выросло >300 колоний. Количество пигментных колоний штамма № 1, появившихся после 1-го экспериментального воздействия, составило 6,0±0,7, после 2-го увеличилось до 103,3±5,4 (р<0,05), а после
3-го составило >300.
Количество беспигментных колоний штамма № 2 при фоне 18,0±0,7 после 1-й и 2-й обработок составило соответственно 18,0±0,7 и 30,0±1,2. После 3-й обработки количество колоний возросло до 130,0±1,2, а после 4-й беспигментные клетки приобрели устойчивость. Количество пигментных колоний штамма № 2 после 1-3-го воздействия составило 11,0±2,2 - 30,0±1,9, а после
4-го составило >300.
Несколько иные результаты были получены при оценке штаммов № 3 и № 4. Беспигментные клетки этих штаммов под воздействием ДС отмирали, а пигментные вырабатывали резистентность. Так, количество беспигментных колоний штамма № 3 после 1-й и 2-й обработок составило соответственно 11,7±2,8 и 44,0±4,5 при фоне 24,7±3,0. После 3-го воздействия количество микробных клеток снизилось до 1,3±0,4, т. е. по сравнению с фоном уменьшилось в 19,0 раз (р<0,05), а после 4-й обработки бактерии погибли. В то же время пигментные колонии штамма № 3 после 1-го воздействия отсутство-
вали, после 2-го их количество составило 37,3±4,8, а уже после 3-го >300.
Количество беспигментных колоний штамма № 4 после первых трех воздействий снизилось с 28,3±2,1 до 22,7+4,5 при фоне 98,7+12,8, после 4-го - до 8,0±1,4 (р<0,05 во всех случаях). После 5-й обработки беспигментные клетки погибли. Напротив, количество пигментных вариантов штамма № 4 после 1-й обработки составило 115,0+12,8, а уже после 2-й пигментные бактерии оказались устойчивыми к ДС.
Полученные данные свидетельствуют, что устойчивость возбудителей ГСИ к дезинфектантам может происходить не только под воздействием низких концентраций препаратов, но и при использовании средств дезинфекции бактерицидной концентрации. Экспериментально установлено, что штамм E. cloacae, обладающий неполной чувствительностью к дезинфектантам, содержащим ЧАС, приобретает устойчивость к препаратам в концентрации, являющейся по отношению к эталонным штаммам микроорганизмов бактерицидной, после 2-12-го воздействия. Штаммы P. aeruginosa, обладающие неполной чувствительностью к хлорсодержащему дезинфектанту, приобретают устойчивость к препарату в концентрации, являющейся по отношению к эталонным штаммам микроорганизмов бактерицидной после 3-4-го воздействия. Приобретенная резистентность P. aeruginosa к хлорсодержащему дезинфектанту формируется преимущественно у пигментных вариантов бактерий.
РИС. 1.
Результаты воздействий на штаммы № 1 (верх)
и № 2 (низ) P. aeruginosa рабочего раствора хлорсодержащего
дезинфектанта на тест-объекте из дерева.
По оси абсцисс - номера воздействий, по оси ординат - среднее
количество выросших колоний.
РИС. 2.
Результаты воздействий на штаммы № 3 (верх)
и № 4 (низ) P. aeruginosa рабочего раствора хлорсодержащего
дезинфектанта на тест-объекте из дерева.
По оси абсцисс - номера воздействий, по оси ординат - среднее
количество выросших колоний.
Al
ЭдУД
ЛИТЕРАТУРА
1. Сергевнин В.И., Зуева Н.Г., Азанов П.Б. и др. Устойчивость к дезин-фектантам и антисептикам Klebsiella pneumonia, выделенной в акушерском стационаре при неединичной заболеваемости новорожденных гнойно-септическими инфекциями. Дезинфекционное дело. 2011. № 1. С. 41-45.
Sergevnin V.I., Zueva N.G., Azanov P.B. i dr. Ustojchivost k dezinfektantam i antiseptikam Klebsiella pneumonia, vydelennoj v akusherskom stacionare pri needinichnoj zabolevaemosti novorozhdennyx gnojno-septicheskimi infekciyami. Dezinfekcionnoe delo. 2011. № 1. S. 41-45.
2. Сергевнин В.И., Клюкина Т.В., Волкова Э.О. и др. Приобретенная устойчивость возбудителей внутрибольничных гнойно-септических инфекций к дезинфицирующим и антисептическим средствам. Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2013. № 1. С. 41-46.
Sergevnin V.I., Kklyukina T.V, Volkova E.O. idr. Priobretennaya ustojchivost vozbuditelej vnutribolnichnyx gnojno-septicheskix infekcij k dezinficiruyushhim i antisepticheskim sredstvam. Epidemiologiya i infekcionnye bolezni. Aktualnye voprosy. 2013. № 1. S. 41-46.
3. Tambe S.M., Sampath L., Modak S.M. In vitro evaluation of risk of developing bacterial resistance to antiseptics and antibiotics used in medical devices. J. Antimicrob Chemother. 2001. № 47. Р. 589-598.
4. Шкарин В.В., Ковалишена О.В., Благонравова А.С. и др. Формирование устойчивости бактерий к четвертичным аммониевым соединениям в экспериментальных условиях. Медицинский альманах. 2012. № 3. С. 129-133.
Shkarin V.V., Kovalishena O.V., Blagonravova A.S. i dr. Formirovanie ustojchivosti bakterij k chetvertichnym ammonievym soedineniyam v eksperimentalnyx usloviyax. Medicinskij almanax. 2012. № 3. S. 129-133.
5. Gomez Escalada M., Harwood J.L. Triclosan inhibition of fatty acid synthesis and its effect on growth of E. coli and P. aeruginosa. J. Antimicrob. Chemother. 2005. № 55. Р. 879-582.
6. Maillard J.-Y. Bacterial resistance to biocides in the health care environment: should it be of genuine concern? J. Hosp. Infect. 2007. № 65. Р. 60-72.
7. Thomas L., Russell A.D., Maillard J.-Y. Antimicrobial activity of chlorhexidine diacetate and benzalkonium chloride against Pseudomonas aeruginosa and its response to biocide residues. J. Appl. Microbiol. 2005. № 98. Р. 533-543.
8. Шкарин В.В., Ковалишена О.В., Воробьева О.Н. и др. Способ определения чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующим средствам. Методические рекомендации. Н. Новгород. 2010.
Shkarin V.V., Kovalishena O.V., Vorobeva O.N. li dr. Sposob opredeleniya chuvstvitelnosti mikroorganizmov k dezinficiruyushhim sredstvam. Mtodicheskie rekomendacii. N. Novgorod. 2010.
УДК 614.21-036.882-053.31:614.4
БАКТЕРИОФАГИ ДЛЯ КУПИРОВАНИЯ ВСПЫШКИ, ВЫЗВАННОЙ STAPHYLOCOCCUS AUREUS, В ОТДЕЛЕНИИ РЕАНИМАЦИИ НОВОРОЖДЕННЫХ
Б.И. Асланов1, А.В. Любимова1, Л.П. Зуева1, А.А. Малашенко1, Н.А. Шаляпина1, Г.В. Рубин2,
1ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова», г. Санкт-Петербург, 2СПб ГБУЗ «Детская городская больница № 17 Святителя Николая Чудотворца», г. Санкт-Петербург
Асланов Батырбек Исмелович - e-mail: batyra@mail.ru
Отделения реанимации новорожденных характеризуются высоким риском развития инфекций, связанных с оказанием медицинской помоши. Наряду с бактериями рода Enetrobacteriaceae, золотистый стафилококк остается одним из актуальных возбудителей инфекций в этих отделениях. В условиях глобального роста антибиотикорезистентности использование бактериофагов становится особенно актуальным. В исследовании была проведена оценка эпидемиологической эффективности применения бактериофага для купирования вспышки, вызванной S. aureus, в отделении реанимации новорожденных. Частота внутрибольничного инфицирования в ходе вспышки достигала 22,2 на 100 пациентов. Было продемонстрировано, что применение бактериофага, обладающего высокой литической активностью, приводит к полному купированию вспышки - после окончания курса фаготерапии частота внутрибольничного инфицирования снизилась до нуля.
Ключевые слова: бактериофаг, фаготерапия, S. aureus, вспышка, отделение реанимации новорожденных.
Outbreaks of health care associated infections in neonatal intensive care units (NICUs) are frequent and have disastrous consequences for neonates. Enterobacteriaceae are significantly more often responsible for NICU outbreaks, at the same time Staphylococcus aureusremains one of the important pathogens in these patients. The emergence of bacteria resistant to available antibiotics has become a critical problem in modern health care. In the context of this global health problem, use of lytic bacteriophages becomes especially important. Our objective was to assess effectiveness of lytic bacteriophages for control of Staphylococcus aureus outbreak in the NICU. The rate of S.aureus nosocomial infections during the outbreak was 22,2%. It has been demonstrated that the use of staphylococcus phages with high lytic activity leads to complete elimination of outbreak.
Key words: bacteriophage, phage therapy, S. aureus, outbreak, newborn ICU.
