CC BY
20
УДК 541.13 DOI: 10.24412/2071-6176-2022-2-21-29
ФОРМИРОВАНИЕ БИОСЕНСОРА НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА, ВЫДЕЛЕННОЙ ИЗ КОРНЕЙ ARMORACIA RUSTICANA
А.Р. Дмитрук, А.М. Черницкий, М.Г. Зайцев
Сформирован биорецепторный элемент биосенсора иммобилизацией фермента пероксидазы хрена в органосиликаную матрицу. Были определены константа Ми-хаэлиса иммобилизованной пероксидазы хрена, операционная стабильность и долговременная стабильность биосенсора на ее основе. В качестве анализируемого соединения использовали пероксид водорода, измерения проводили на амперометриче-ской биосенсорной установке кюветного типа с кислородным электродом типа Кларка.
Ключевые слова: биосенсор, пероксидаза хрена, константа Михаэлиса, операционная стабильность, долговременная стабильность, иммобилизация, золь-гель, пе-роксид водорода.
Введение
Пероксидаза хрена (Horseradish peroxidase, EC 1.11.1.7 phenolic donor:hydrogen-peroxide oxidoreductase) - один из наиболее распространённых ферментов, катализирующий окисление широкого спектра веществ пероксидом водорода. В настоящее время активно развивается направление использования пероксидаз в процедурах электрохимического обнаружения, в частности, при разработке электронных биосенсоров. Эти аналитические приборы находят все более широкое применение в сфере медицинских услуг, пищевой промышленности и мониторинге окружающей среды. [1]
Формирование биосенсора для определения пероксида водорода является актуальной задачей, так как присутствует потребность в анализе биологических и иных проб из-за того, что пероксид водорода играет важную роль в биохимических процессах, протекающих в организме и в окружающей среде. Высокая каталитическая активность пероксидазы хрена в реакции восстановления пероксида водорода позволяет использовать пероксидазу в качестве биораспознающего элемента на электроде, участвующего в прямом переносе электрона между активным центром фермента и субстратом [2]. Известны такие примеры пероксидазных биосенсоров, как стеклоуглеродый электрод, модифицированный поли (L-лейцинУполидопамином, с
иммобилизированной смесью пероксидазы хрена и хитозана ( Км = 0.12 ммоль/л, чувствительность 0,23 А л/моль*см2 , наименьшая определяемая концентрация 0,1 мкмоль/л) [3], и амперометрический биосенсор на который в смеси многостенных углеродных нанотрубок и
поливинилбутираля иммобилизовали пероксидазу хрена (Км = 0,049 мМ, предел обнаружения - 0,167 мкМ) [4].
Пероксидаза хрена является катализатором в реакции разложения пероксида водорода, в ходе которой происходит выделение кислорода. Так как фермент находиться в сопряжении с кислородным электродом, то можно регистрировать образующийся в ходе биохимической реакции кислород [5]. Кислород, содержавшийся в кювете до реакции, не оказывает влияния на величину ответа биосенсора, так как до начала определения устанавливают фоновое значение по исходному содержанию кислорода.
Таким образом, целью данного исследования является разработка биосенсора с пероксидазой хрена, иммобилизованной на поверхности кислородного электрода в органосиликатную золь- гель матрицу и определение основных характеристик разработанного биосенсора при анализе содержания перекиси водорода в растворе.
Материалы и методы исследования
Для формирования рецепторного элемента биосенсора использовали фермент пероксидазу хрена, выделенную в лабораторных условиях согласно модифицированной методики [6] из корней Armoracia rusticana. Используемый ферментный препарат характеризуется удельной ферментативной активностью равной 20 ед/мг.
В качестве методики иммобилизации использовали представленную в работе [6]. К 0,02 см3 5 % водного раствора поливинилового спирта прибавляли 0,05 см3 препарата пероксидазы хрена, собранной после очистки методом ионобменной хроматографии. Перемешивали в течение 5 минут (Elmi CM-70M07, Польша), добавляли 0,1 см3 смеси тетраэтоксисилана (ТЭОС) («Sigma», США) и метилтриэтоксисилана (МТЭС) («Sigma», США) и перемешивали в течение 5 минут. Затем добавляли 0,005 см3 (0,02 моль/дм3) раствора катализатора NaF, перемешивали 15 минут, отбирали 0,04 см3 полученного золь-геля и наносили на диализную мембрану, закреплённую на поверхности кислородного электрода [7].
Определение параметров биосенсора с иммобилизованной пероксидазой хрена проводили с использованием биосенсорной установки кюветного типа на основе анализатора жидкости «Эксперт - 001», совмещенной с кислородным электродом типа Кларка.
Константу Михаэлиса иммобилизованного фермента определяли следующим образом: в кювету объёмом 5см3 переносят натрий фосфатный буферный раствор с pH = 7,6 объемом 4,9 см3. При тщательном перемешивании происходит выравнивание концентрации растворенного кислорода и выход значений на стационарный уровень. Затем в кювету
добавляют 100 мкл перекиси водорода с концентрациями в интервале 0,03125 - 1,25 ммоль/дм3.
Результаты и обсуждение
В ходе ферментативной реакции в приэлектродном пространстве протекает реакция [8], показанная на рис. 1.
/-¿Г/
+ Н202
>
ЧА—
+ Н20
Уф/
—+ Н202
А-^
-- М-^-ЙЧ
+ Н20 + о,
Рис. 1. Реакция пероксидазы хрена с пероксидом водорода
Концентрация кислорода увеличивается. Изменение содержания растворенного кислорода в ходе реакции представлено на рис. 2.
Рис.2. Изменение концентрации растворенного кислорода в ходе
ферментативной реакции.
За ответ биосенсора принимали скорость изменения концентрации кислорода, для этого из полученной зависимости выделяли линейный участок и определяли тангенс угла наклона (рис. 3).
Рис.3 Линейный участок зависимости концентрации растворенного кислорода в ходе ферментативной реакции
Для каждого из стандартных растворов определяли по три значения ответа биосенсора, исходя из них была построена градуировочная зависимость ответа биосенсора от концентрации пероксида водорода в кювете. Полученная зависимость представлена на рис. 4.
20 гОтвет биосенсора, мг02/дм3*с
15 -
10
5 -
0
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
3
Концентрация пероксида водорода в кювете, ммоль/дм
Рис. 4. Зависимость ответа сенсора от концентрации пероксида
водорода
Данная зависимость описывается уравнением Михаэлиса - Ментен:
Я =
[5]
Км +[5]
По графику зависимости Rmax — 20,1 ± 0,5 мг О2/дм3*с. Следовательно Км — 0,12 ± 0,01 ммоль/дм3, что близко к литературным данным (0.11 ммоль/дм3) [9-10].
Операционная стабильность является одной из важнейших характеристик биосенсора. Она показывает устойчивость ответа сенсора на одну и ту же концентрацию субстрата при проведении большого числа последовательных измерений и тесно связана с метрологической характеристикой сходимостью (повторяемостью).
Для определения операционной стабильности было проведено 15 последовательных измерений ответа сенсора на перекись водорода с концентрацией в кювете 0,005 ммоль/дм3 (концентрация соответствует середине линейного участка градуировочной кривой). Время между измерениями составило около 10 минут.
Результаты серии единичных измерений для определения операционной стабильности были получены на 4 день после иммобилизации и представлены на рис. 5.
а
£ ° я *
Г3
О Оо
и И
н О
16 15,5 15 14,5 14 13,5 13
—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Номер измерения
Рис. 5. Повторяемость ответов биосенсора при многократном проведении эксперимента с концентрацией пероксида водорода
0,005ммоль/дм3
Количественной характеристикой операционной стабильности является величина относительного стандартного отклонения для ответов сенсора. Количественные результаты определения операционной стабильности представлены в таблице.
Как видно из представленных значений биосенсор обладает высокой повторяемостью единичных результатов. Относительное стандартное отклонение составило 0,03%.
Характеристика операционной стабильности биосенсора
Количество измерений Х ± АХ мг 02/(дм3 *с) Sr, %
15 14,69 ± 0,05 0,03
Долговременная стабильность является характеристикой разработанного рецепторного элемента, показывающая как долго можно использовать иммобилизованный биоматериал без значительного снижения величины аналитического сигнала, и, соответственно чувствительности сенсора. Она зависит от природы и от способа иммобилизации биоматериала.
Эксперимент по определению ответов сенсора на одну и ту же концентрацию пероксида проводили 55 дней подряд, в некоторых случаях с двухдневным интервалом. Последовательно устанавливали величину ответа сенсора на внесение пероксида водорода в кювету (конечная концентрация Н2О2 0,01 ммоль/дм3). Между измерениями сенсор хранился в буферном растворе при температуре 20 °С.
За время стабильной работы рецепторного элемента принимали время, в течение которого величина сигнала составляла не менее 90% от максимальной. Полученные результаты представлены на рис. 6.
20 18 16 14 12 10 8
6
17,27
ш
♦
15,54
14,57
8,62
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54
Время, сутки
Рис. 6. Долговременная стабильность биосенсора
В первый день после формирования рецепторного элемента пероксидаза хрена иммобилизованная в ПВС имеет низкую активность. К 4 дню активность вырастает, это объясняется тем, что происходит адаптация пероксидазы к условиям среды. На 5 день значения ответов стабилизируется, это связано с тем, что плохо закреплённый в матрице биоматериал вымывается, а оставшиеся дают стабильный отклик. Высокая активность сохраняется 39 дней. Как было установлено, созданный биорецепторный элемент обладает высокой долговременной стабильностью (44 дня). К 41 дню наблюдалась уменьшение активности пероксидазы хрена, а к 44 дню снизилась меньше чем на половину от максимальной.
Заключение
Разработана лабораторная модель биосенсора для определения содержания пероксида водорода, на основе пероксидазы хрена иммобилизованной на поверхность кислородного электрода в органосиликатную золь-гель матрицу. Для полученного биорецепторного элемента были определены такие основные характеристики как: константа Михаэлиса, составившая 0,12 ± 0,01 ммоль/дм3, операционная стабильность биосенсора - относительное стандартное отклонение составило 0,03%. Биосенсор характеризуется значительной долговременной стабильностью в течение 39 дней.
Работа выполнена при поддержке госзадания Минобрнауки РФ (FEWG-2020-0008)
Список литературы
1. PeroxiBase: a database with new tools for peroxidase family classification / D. Koua, L. Cerutti, L. Falquet [et al.] // Nucleic acids research. 2009. V. 37. I. 1. P. 261-266.
2. Chau Y.P., Lu K.S. Investigation of the blood ganglion barrier properties in rat sympathetic ganglia by using lanthanum ion and horseradish peroxi-dase as tracers // Cells Tissues Organs. 1995. V. 153. I. 2. P. 135-144.
3. Биосенсор на пероксид водорода на основе стеклоуглеродного электрода, модифицированного пероксидазой хрена/поли (L-лейцином)/полидопамином / С. Жен, Ю. Гуо, Ж. Жен [и др.] // Электрохимия. 2017. № 5 С. 505-514.
4. Биосенсор на пероксид водорода на основе электрода, модифицированного поливинилбутиралем и многостенными углеродными нано-трубками (наноматериалы-УНТ) / X. Ли, Х. Тао, М. Хуан [et al.] // Электрохимия. 2016. № 2. С. 133-141.
5. Преснова Г. В., Рубцова М. Ю., Егоров А. М. Электрохимические биосенсоры на основе пероксидазы хрена // Российский химический журнал. 2008. № 2. С. 60-65.
6. Патент 2486240 РФ. Способ получения пероксидазы из корней хрена / Полозников А.А., Хушпульян Д.М., Захарянц А.А. [и др.] Опубл. 2013. Бюл. № 18.
7. Стабильный биокатализатор окисления метанолана основе мети-лотрофных дрожжей в ормосил-гелях из тетраэтоксисилана и диметилди-этоксисилана / Д.Г. Лаврова, О.А. Каманина, П.В. Рыбочкин [и др.] // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2018. № 4.
8. Nakajima R., Yamazaki I. The mechanism of oxyperoxidase formation from ferryl peroxidase and hydrogen peroxide // Journal of Biological Chemistry. 1987. V. 262. I. 6. P. 2576-2581.
9. Kinetic characterization of phenol and aniline derivates as substrates of peroxidase / M.A. Gilabert, L.G. Fenoll, F. Garcia-Molina [et al.] // Biological Chemistry. 2004. V. 385. I. 9. P. 785-800
10. Kinetic characterization of the oxidation of esculetin by polyphenol oxidase and peroxidase / J.L. Munoz-Munoz, F. Garcia-Molina, R. Varon [et al.] // Bioscience, biotechnology, and biochemistry. 2007. P. 390-396.
Дмитрук Александр Романович, мл. науч. сотр., dmitrukAR@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Черницкий Александр Михайлович, студ., сИепискИа/а \>апс1ех.ги, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Зайцев Максим Геннадьевич, канд. хим. наук, доц., m.g.zaytcev@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет
DEVELOPMENT OF A BIOSENSOR BASED ON IMMOBILIZED HORSERADISH PEROXIDASE ISOLATED FROM THE ROOTS OF ARMORACIA RUSTICANA
A.R. Dmitruk, A.M. Chernetsky, M.G. Zaytsev
The bioreceptor element of the biosensor was formed by immobilization of the horseradish peroxidase enzyme into a sol-gel matrix based on polyvinyl alcohol. Operational stability, long-term stability, and the Michaelis constant of immobilized horseradish peroxidase were determined. Hydrogen peroxide was used as the analyzed compound, measurements were carried out on an amperometric biosensor installation of a cuvette type with an oxygen electrode of the Clark type.
Keywords: biosensor, horseradish peroxidase, Michaelis constant, operational stability, long-term stability, immobilization, sol-gel, hydrogen peroxide.
Dmitruk Alexander Romanovich, Junior Researcher, dmitrukAR@gmail.com, Russia, Tula, Tula State University,
Chernitsky Alexander Mikhailovich, student, сhernickiia@yandex.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Zaytsev Maxim Gennadievich, Candidate of Chemical Sciences, Associate Professor, m.g.zaytcev@gmail.com, Russia, Tula, Tula State University
