CC BY
0
БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 541.138.3::577.15 001: 10.24412/2071-6176-2024-2-54-64
ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ МЕТИЛОТРОФОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В БИОЭЛЕКТРОКАТАЛИЗЕ (МИНИ-ОБЗОР)
Д.С. Потапова
Несколько видов формиатдегидрогеназ метилобактерий и метанотрофов ферментативно превращают формиат в углекислый газ, а в искусственных условиях могут катализировать обратную реакцию. Обратимость этого процесса в присутствии медиаторов электронного транспорта свидетельствует о перспективах технологий биоэлектохимического синтеза формиата и одновременной утилизации парникового углекислого газа при участии формиатдегидрогеназ.
Ключевые слова: метилотрофы, метилобактерии, Methylorubrum extorquens ЛМ1, формиатдегидрогеназа, биоэлектрокатализ, углекислый газ, формиат.
Метилотрофы используют в качестве источников углерода и энергии широкий спектр (более 50) С1-соединнений биогенного и абиогенного происхождения от предельно восстановленного СН4 до предельно окисленного СО2: метанол, формальдегид, формиат, метиламин и др. Многие из этих субстратов обладают цитотоксическим и канцерогенным действием, а также ответственны за так называемый парниковый эффект, поскольку истощают озоновый слой атмосферы. Аэробные метилотрофы выполняют уникальную функцию природного биофильтра на пути эмиссии ^-соединений в атмосферу и играют жизненно важную роль в глобальных циклах углерода, что является причиной большого интереса к исследованию их биоразнообразия, особенностей экофизиологии и метаболизма.
Метилотрофия широко распространена в микробном мире, известно более 50 родов метанотрофов и метилобактерий, относящихся к а-, Р-, у-Рго1еоЪас1впа, УвггысотгсгоЪга, а также несколько родов метилотрофных дрожжей. Метанотрофы представляют собой высокоспециализированную группу бактерий, способных расти на СН4. Метилобактерии используют в качестве источников углерода и энергии замещенные или окисленные производные метана, а метилотрофные дрожжи - метанол. Аэробные метилотрофы реализуют уникальные пути С1-окисления (с участием хиноновых, птериновых, тиоловых и никотинамидных кофакторов) и С1-ассимиляции (пентозофосфатные и сериновый циклы) с участием более 20 специфических ферментов, кодируемых >100 генами [1, 2].
1. Метаболическая функция формиатдегидрогеназ (ФДГ) метилотрофов и их классификация
Процессы окисления восстановленных ^-субстратов, происходящие при участии комплекса ферментных систем, обеспечивают клетки метилотрофов энергией и восстановительными эквивалентами, при этом переводя субстраты в доступные для дальнейшей ассимиляции формы, в зависимости от того, каким образом включается углерод в клеточные компоненты (в формальдегид, формиат и углекислый газ (СО2)) [3].
Окисление формиата - завершающая стадия цепи реакций прямого окисления у аэробных метилотрофов. Её катализируют формиатдегидро-геназы (ФДГ) и формиатоксидазы. Причём ФДГ отличаются наибольшим разнообразием [4]. Они различаются акцепторами электронов, чувствительностью к кислороду, составом субъединиц и некоторыми другими параметрами. Активные центры ФДГ очень разнообразны по структуре (имеют в своём составе различные ионы металлов, остатки аминокислот и коферменты) [3, 4].
У метилотрофов выделяют следующие виды ферментов, катализирующие превращение формиата в углекислый газ:
- мембрансвязанная формиатоксидаза (использует в качестве природного акцептора электронов кислород);
- мембрансвязанная цитохром с-зависимая ФДГ (использует в качестве акцепторов электронов цитохром с);
- цитоплазматическая ФДГ, являющаяся высокогомологичной молибдоптеринзависимым оксидоредуктазоподобным белком;
- цитоплазматическая НАД-зависимая ФДГ (наиболее распространенная) [3, 5, 6].
ФДГ четвёртой группы можно разделить на два различных класса в зависимости от содержания металлов. Первый класс ферментов - это безметалловые НАД-зависимые ФДГ, которые не имеют металлических активных центров и катализируют окисление формиата путем гидридного переноса в НАД. Второй класс ферментов - металлозависимые (молибден (Mo)- или вольфрам ^)-содержащие) ФДГ [5]. Mo- или W-содержащие ФДГ выделены из метилотрофов (метанотрофа Methylosinus thrichosporium OB3b (Mo-содержащая ФДГ), метилобактерий Methylorubrum extorquens AM1 (W-содержащая ФДГ) и Methylobacterium sp. RXM (Mo-содержащая ФДГ)) и охарактеризованы [7-9].
Металлозависимые ферменты состоят из нескольких субъединиц (2-4 субъединицы), содержащих ион вольфрама или молибдена в активном центре и дополнительные кофакторы, т.е. железо-серные кластеры [4Fe-4S] и [2Fe-2S], флавинмононуклеотид (ФМН)/флавинадениндинуклеотид (ФАД) или гемы. Активный центр содержит гексакоординированный ион металла в искаженной треугольной призматической геометрии. Две дитиоленовые группы из двух фрагментов молибдоптерина функциони-
руют как лиганды. Кроме того, координационную сферу иона металла дополняет остаток цистеина (Cys) или селеноцистеина (SeCys) и неорганический сульфид, необходимый для активности. Таким образом, на основе ионов металлов (W или Mo) и координированных аминокислотных остатков (Cys или SeCys) можно выделить четыре структурно различных типа активных центров [4].
Другие разновидности ферментов, катализирующие двухэлектро-нное окисление формиата до СО2, у метилотрофов выделены и охарактеризованы не были.
Потенциал окисления формиата до СО2 Е°' = -0,42 В (по отношению к стандартному водородному электроду), а окислительно-восстановительный потенциал НАД/НАДН Е°' = -0,32 В, поэтому НАД-зависимые ФДГ обычно катализируют прямую реакцию (окисление формиата), а не обратную (восстановление углекислого газа в формиат), так как первое является термодинамически благоприятным. Однако, установлено, что две ФДГ Myceliophthora thermophila и Candida boidinii (организмы не являются метилотрофами), способны катализировать реакции обратимо [6, 10].
2. Формиатдегидрогеназы Methylorubrum extorquens AMI
Розовопигментированные факультативные метилотрофы рода Methylobacterium повсеместно распространены в почвенной, воздушной и водной средах. Общей чертой всех видов Methylobacterium является способность расти на одном или нескольких восстановленных соединениях углерода (C1), отличных от метана, в первую очередь метаноле. Потенциал штаммов этого рода для получения биотехнологических продуктов с высокой добавленной стоимостью привлек внимание исследователей. Из всех штаммов Methylobacterium лучше всего изучен штамм Methylorubrum extorquens AM1 (ранее известный как Methyrobacterium extorquens AM1), который служил модельным организмом на протяжении более четырех десятилетий [11].
M. extorquens AM1 обладает четырьмя различными функциональными формиатдегидрогеназами (ФДГ1, ФДГ2, ФДГ3, ФДГ4). Два набора генов ФДГ данной метилобактерии кодируют НАД-связанные формиатдегидрогеназы (ФДГ1 - вольфрамсодержащая, и ФДГ2 - молиб-денсодержащая), третья - цитохромсвязанная ФДГ (ФДГ3), четвертая имеет сходство с предполагаемым молибдоптеринсвязывающим оксидо-редуктазным белком (ФДГ4) [6, 8, 11].
Для выяснения детальной информации о генах и ферментах M. extorquens AM1, участвующих в метаболизме формиата, провели биоинформатический поиск по биологическим базам данных веб-ресурса KEGG (Киотская энциклопедия генов и геномов, https://www.
kegg.jp/kegg/kegg2.html). Результаты поиска и анализа информации представлены в табл. 1.
Таблица 1
Формиатдегидрогеназы Methylorubrum extorquens AM1
ФДГ Субъединица Ген Локус-таг Описание
ФДГ1 А fdh1A Mex_1p5032 основная альфа-субъеди-ница вольфрамсодержащей формиатдегидрогеназы
В fdh1B Mex_1p5031 бета-субъединица вольфрамсодержащей формиатдегидрогеназы
ФДГ2 А fdh2A Mex_1p4848 основная альфа-субъеди-ница НАД-зависимой моли-бденсодержащей фор-миатдегидрогеназы
В fdh2B Mex_1p4847 бета-субъединица НАД-зависимой молибденсодер-жащей формиатдегидро-геназы
Г fdh2C Mex_1p4846 гамма-субъединица НАД-зависимой молибденсодер-жащей формиатдегид-рогеназы
А fdh2D Mex_1p4849 дельта-субъединица НАД-зависимой молибденсодер-жащей формиатдегид-рогеназы
ФДГ3 А fdh3A Mex_1p0303 основная субъединица, предшественник альфа-субъединицы формиатде-гидрогеназы
В fdh3B Mex_1p0304 железосерная бета-субъединица формиатдегидрогеназы
Г fdh3C Mex_1p0305 цитохром гамма-субъедини-ца формиатдегидрогеназы
ФДГ4 А fdh4A Mex_1p2094 формиатдегидрогеназа, субъединица А
В fdh4B Mex_1p2093 формиатдегидрогеназа, субъединица B
Результаты биоинформатического поиска также подтверждают, что в геноме M. extorquens AM1 закодированы четыре формиатдегидрогеназы:
1. двухсубъединичная вольфрамсодержащая НАД-связанная ФДГ1;
2. четырёхсубъединичная молибденсодержащая НАД-связанная ФДГ2;
3. трёхсубъединичная цитохром-связанная ФДГ3;
4. ФДГ4, являющаяся двухсубъединичным предполагаемым молибдоптерин-связывающим оксидоредуктазным белком.
Вольфрамсодержащая НАД-зависимая ФДГ1 из M. extorquens AM1
Цитоплазматическая вольфрамсодержащая ФДГ1 из M. extorquens AM1 является единственной вольфрамсодержащей НАД-зависимой ФДГ из метилотрофов, которая была очищена и охарактеризована в 2003 году Маркусом Лаукель с соавторами [8]. Фермент представляет собой гетеродимер из двух субъединиц (А и В) с молекулярной массой 107 и 61 кДа соответственно. Гены, кодирующие две субъединицы ФДГ1, идентифицированы на хромосоме M. extorquens AM1 рядом друг с другом в порядке ФДГ1В, ФДГ1А [5, 12]. Очищенный фермент содержал на моль фермента (на 6,02 1023 молекул фермента) примерно 5 моль негемового железа и кислотно-лабильной серы, 0,6 моль нековалентно связанного ФМН и примерно 1,8 моль вольфрама [8].
Только в 2022 году Кано и его команде удалось определить структуру ФДГ1 с помощью криоэлектронной микроскопии и рентгеновской кристаллографии. Субъединица А M. extorquens АМ1 содержит активный сайт W-Cys с проксимальным кластером [4Fe-4S], два дополнительных кластера [4Fe-4S] и один кластер [2Fe-2S]. Субъединица В содержит сайт связывания для НАД и обладает одним кофактором ФМН, одним кластером [4Fe-4S] и одним кластером [2Fe-2S]. Кластер [4Fe-4S] в субъединице В соединен с кластерами [4Fe-4S] и [2Fe-2S] в субъединице А на расстояниях 14,9 и 10,9 А соответственно. Субъединица В отвечает за катализ окислительно-восстановительной пары НАД+/НАДН в ФДГ1 и поэтому называется диафоразной единицей (рис. 1) [5].
Рис. 1. Структура ФДГ1 из M. extorquens AM1 [3]
Известно, что большинство ФДГ, несущие остаток SeCys в металлическом активном центре, довольно чувствительны к кислороду. В отличии от них ФДГ1 (тип Cys) M. extorquens АМ1 активна даже в аэробных условиях [3]. Таким образом, получение ФДГ, имеющих координированный аминокислотный остаток Cys является более простой задачей по сравнению с получением тех же ферментов, имеющих координированный аминокислотный остаток SeCys, так как данный процесс не требует бескислородных условий.
3. Биоэлектрохимический синтез формиата из углекислого газа
при участии ФДГ
Синтез полезных веществ является развивающимся направлением «зелёной» химии. В нём активно применяется биоэлектрокатализ, что обобщено в одном из основных обзоров по этому направлению исследований [12]. В своем обзоре мы уделили особое внимание анализу информации по биоэлектрохимическому синтезу формиата из углекислого газа при участии формиатдегидрогеназ метилобактерии M. extorquens AM1 (в частности ФДГ1).
3.1. Медиаторный биолектрокатализ
Для сопряжения ферментативной и электродной реакций можно использовать две стратегии. Первая стратегия представляет собой
непрямое сопряжение активного центра фермента с электродом при участии небольших окислительно-восстановительных партнеров в качестве медиаторов - медиаторный биоэлектрокатализ. Эту стратегию разрабатывали Кано и его команда [10, 13, 14].
В 2016 году учёные сосредоточились на НАД-связанной вольфрамсодержащей формиатдегидрогеназе из M. extorquens AM1. Использовать пару НАД+/НАДН в качестве медиатора в биоэлектрокаталитической системе сложно, так как электрохимическая реакция этой редокс-пары на электродах требует очень высоких перенапряжений. В работе [10] авторы продемонстрировали, что ФДГ1 реагирует с несколькими искусственными медиаторами (метилвиологен, бензилвиологен и ализариновый красный С), которые используют в качестве доноров электронов для восстановления CO2 в формиат. Причём благодаря низкому окислительно-восстановительному потенциалу оптимальным является метилвиологен (MB). Следует отметить, фермент и медиаторы использовались в растворимой (неиммобилизованной) форме.
В последствии Кано с коллегами работали с иммобилизованными на электродах ферментом и медиаторами. Так, ФДГ1 иммобилизовали на стеклоуглеродном электроде, модифицированном электропроводящим чёрным углеродным порошком Ketjen Black (KB) для эффективной иммобилизации фермента [13]. Утилизация СО2 наблюдалась при предельной плотности тока около 15 мАсм-2 с полуволновым потенциалом (Em) на 0,04 отрицательнее, чем Е°'СО2 (Em = Е°'СО2 - 0,04В) при рН 6,6 и 60 °C в присутствии МВ (который также был иммобилизован на электроде).
В работе [14] ФДГ1 Methylorubrum extorquens AM1 абсорбировали на газодиффузионном электроде, модифицированном KB. В качестве медиатора использовали дибромид-1,1'-триметилен-2,2 '-бипиридиния. Команда Кано добилась плотности катодного тока около 20 мА см-2 в мягких условиях (нейтральный pH, атмосферное давление и комнатная температура).
Таким образом, в этих работах было показано, что ФДГ1 M. extorquens AM1 является мощным биоэлектрокатализатором электрохимических взаимопревращений между формиатом и углекислым газом в реакциях, протекающих по механизму медиаторного переноса электродов. Однако получение высокоактивной ФДГ является сложным процессом. Кроме того, очищенные ферменты часто нестабильны в небиологических условиях, и их долговременная стабильность невысока. Учитывая это, команда Кано разработала стабильный способ иммобилизации целых бактерий M. extorquens AM1 на электродах, способных участвовать в биоэлектрокатализе. Покоящиеся клетки помещали в водную дисперсию МУНТ и оставляли до полного высыхания на электродах. Полученный таким образом биоэлектрод в присутствии
метилвиологена проявлял активность по восстановлению углекислого газа при плотности электрического тока 0,8±0,1 мАсм-2 в мягких условиях (рН 7,0, атмосферное давление и 37 °С) [15].
3.2. Прямой биоэлектрокатализ
Второй стратегией является прямое сопряжение фермента с электродом - биоэлектрокатализ с прямым переносом электронов (прямой биоэлектрокатализ). Для организации прямого переноса электронов необходима особая подготовка электродов и ферментов для иммобилизации, так как прямой перенос возможен только на небольшом расстоянии (до 30 А) между ними. Следует отметить, что с увеличением расстояния между активным центром фермента и электродом константа скорости экспоненциально уменьшается [5].
При использовании планарных электродов не удаётся обеспечить прямой перенос электронов на активный центр ФДГ, но при использовании мезопористых углеродных электродов это становится возможным. Эффект кривизны мезопористых структур, по-видимому, увеличивает количество молекул ферментов с ориентацией, пригодной для электрохимического взаимодействия. Однако адсорбция на электроде, модифицированном КВ, протекает медленно, а плотность каталитического тока остается низкой. Скорее всего, размер мезопор слишком мал, чтобы эффективно удерживать ФДГ1. Вероятнее всего, в сопряжении с мезопористым электродом участвует один из железо-серных кластеров, расположенных вблизи поверхности фермента [17].
Другой возможный механизм связан с функционированием флавинмононуклеотидного кофактора (ФМН). Нековалентно связанный ФМН диссоциирует от некоторых молекул ФДГ1 и адсорбируется на мезопористом электроде, образуя симметричную поверхностную окислительно-восстановительную пару. Несмотря на то, что адсорбированный ФМН не может участвовать в биоэлектрокатализе с опосредованным переносом электронов, диссоциированный ФМН в растворе работает как медиатор для CO2-восстановления на мезопористых электродах [16].
Второй механизм подтверждается исследованиями по переносу электронов в системах, содержащих электроды с покрытием КВ и наночастицами золота (Аи№), обработанных 4-меркаптопиридином [19]. Прямое взаимодействие между ферментом и электродом в такой системе было лучше, что указывает на то, что пиридиновый фрагмент на AuNPs усиливает межфазный перенос электронов [17].
Заключение
Формиатдегидрогеназы метилобактерий и метанотрофов позволяют фиксировать первый по распространённости парниковый газ (углекислый газ (CO2)), который является основной причиной современного глобального потепления. Однако, только ФДГ метилобактерии Methylorubrum extorquens AM1 были использованы как катализаторы превращения углекислого газ в формиат. Перспективным является поиск ФДГ других метилотрофов, их очистка и характеристика, позволяющие понять перспективы дальнейших исследований данных ферментов в биоэлектрокатализе. Технологии ферментативного восстановления двуокиси углерода могут быть использованы для получения органических соединений, которые являются химическим сырьем в синтезе ценных веществ или возобновляемым источником энергии в биотопливных элементах.
Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта ректора ТулГУ для обучающихся по образовательным программам высшего образования - программам магистратуры, № БТ/23/05/ГРР_М.
Список литературы
1. Троценко, Ю.А., Торгонская М.Л. Аэробные метилотрофы -перспективные объекты современной биотехнологии // Журнал Сибирского федерального университета. Биология, 2018. Т. 5. № 3. С. 243279.
2. Aerobic methylobacteria as promising objects of modern biotechnology (Review) / N.V. Doronina, L. Toronskava, D.N. Fedorov [et al]. // Applied Biochemistry and Microbiology, 2015. V. 51. P. 125-134.
3. Vorholt J.A. Cofactor-dependent pathways of formaldehyde oxidation in methylotrophicbacteria // Arch. Microbiol, 2002. V. 178. P. 239-249.
4. Chistoserdova L., Lidstrom M.E. Aerobic methylotrophic prokaryotes // The prokaryotes. Springer New York, 2006. P. 618-634.
5. Structure and function relationship of formate dehydrogenases: an overview of recent progress / A. Kobayashi, M. Taketa, K. Sowa [et al.] // IUCrJ, 2023. V. 10. № 5. P. 544-554.
6. Identification of a fourth formate dehydrogenase in Methylobacterium extorquens AM1 and confirmation of the essential role of formate oxidation in methylotrophy / L. Chistoserdova, G.J. Crowther, J.A. Vorholt [et al.] // J. Bacteriol, 2007. Т. 189. № 24. С. 9076-9081.
7. Jollie D.R., Lipscomb J.D. Formate dehydrogenase from Methylosinus trichosporium OB3b. Purification and spectroscopic characterization of the co-factors // J Biol Chem, 1991. № 15.
8. The tungsten-containing formate dehydrogenase from Methylobacterium extorquens AM1: Purification and properties / M. Laukel, L. Chistoserdova, M.E. Lidstrom [et al.] // Eur. J. Biochem, 2003. V. 270. № 2. P. 325-333.
9. The formate dehydrogenase isolated from the aerobe Methylobacterium sp. RXM is a molybdenum-containing protein / R.O. Duarte, A.R. Reis, F. Girio [et al.] // Biochem Bi-ophys Res Commun, 1997. V. 230. № 1.
10. Interconversion between formate and hydrogen carbonate by tungsten-containing formate dehydrogenase-catalyzed mediated bioelectrocatalysis / K. Sakai, Bo-C. Hsieh, A. Maruyama [et al.] // Sens. Bio-Sensing Res., 2015. V. 5. P. 90-96.
11. Methylobacterium genome sequences: A reference blueprint to investigate microbial metabolism of C1 compounds from natural and industrial sources / S. Vuilleumier, L. Chistoserdova, M.-C. Lee [et al.] // PLoS One, 2009. V. 4. № 5.
12. Masa J., Schuhmann W. Electrocatalysis and bioelectrocatalysis -Distinction without a difference // Nano Energy, 2016. № 29. P. 466-475.
13. Bioelectrocatalytic formate oxidation and carbon dioxide reduction at high current density and low overpotential with tungsten-containing formate dehydrogenase and mediators / K. Sakai, Y. Kitazumi, O. Shirai [et al.] // Electrochemistry Communications, 2016. V. 65. P. 31-34.
14. Efficient bioelectrocatalytic CO2 reduction on gas-diffusion-type biocathode with tungsten-containing formate dehydrogenase / K. Sakai, Y. Kitazumi, O. Shirai [et al.] // Electrochemistry Communications, 2016. V. 73. P. 85-88.
15. Carbon-nanotube-caged microbial electrodes for bioelectrocatalysis / H. Xia, K. Sakai, Y. Kitazumi [et al.] // Enzyme and Microbial Technology, 2018. V. 117. P. 41-44.
16. Direct electron transfer-type bioelectrocatalytic interconversion of carbon dioxide/formate and NAD/NADH redox couples with tungsten-containing formate dehydrogenase+ / K. Sakai, Y. Sugimoto, Y. Kitazumi [et al.] // Electrochimica Acta, 2017. V. 228. P. 537-544.
17. Direct electron transfer-type four-way bioelectrocatalysis of CO2/formate and NAD/NADH redox couples by tungsten-containing formate dehydrogenase adsorbed on gold nanoparticle-embedded mesoporous carbon electrodes modified with 4-mercaptopyridine+ / K. Sakai, Y. Sugimoto, Y. Kitazumi [et al]. // Electrochimica Acta, 2017. V. 84. P. 75-79.
Потапова Дарья Сергеевна, студент, darya_0102@bk.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет
FORMATE DEHYDROGENASES OFMETHYLOTROPHS AND THEIR APPLICATIONINBIOELECTROCATALYSIS (MINI-REVIEW)
D.S. Potapova
Several types of formate dehydrogenases of methylobacteria and methanotrophs en-zymatically convert formate into carbon dioxide, and under artificial conditions can catalyze this reaction reversibly. The reversibility of this process in the presence of electronic transport mediators indicates the prospects of technologies involving these enzymes in the bioelectochemical synthesis of formate and utilization of greenhouse carbon dioxide.
Key words: methylotrophs, methylobacteria, Methylorubrum extorquens AM1, formate dehydrogenase, bioelectrocatalysis, carbon dioxide, formate
Potapova Darya Sergeevna, student, darya_0102@bk.ru, Russia, Tula, Tula State University
