CC BY
37
ХИМИЯ
УДК 543.94. 577.15 DOI: 10.24412/2071-6176-2021-2-3-13
БИОЭЛЕКТРОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МЕТИЛОБАКТЕРИЙ В ПРИСУТСТВИИ ИСКУССТВЕННЫХ АКЦЕПТОРОВ ЭЛЕКТРОНОВ - ФЕНАЗИНМЕТАСУЛЬФАТА И 2,6-ДИХЛОРФЕНОЛИНДОФЕНОЛА
М.А. Улитина, С.В. Якимович, Т.А. Карасева
Изучены биоэлектрокаталитические свойства метилобактерий Methylo-rubrum extorquens pCM160: субстратная специфичность, стабильность, кинетические параметры в условиях функционирования амперометрического медиаторного биосенсора. Методом циклической вольтамперометрии показана возможность совместного использования искусственных акцепторов электронов - феназинметасульфата (ФМС) и 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ) в качестве медиаторов электронного транспорта в биосенсоре на основе M. extorquens pCM160, а также электрохимические свойства. Определены основные характеристики - метрологические и аналитические - разработанного биосенсора.
Ключевые слова: метилобактерии, феназинметасульфат, 2,6-дихлорфенолиндофенол, медиаторы электронного транспорта, амперометрический биосенсор, метрологические и аналитические характеристики, биоэлектрокатализ.
Введение
Амперометрические биосенсоры на основе бактериальных клеток, их клеточных структур и выделенных ферментов являются одними из наиболее распространенных приборов биомолекулярной электроники [1, 2]. Ключевым фактором переноса электронов на электрод является мембранная локализация дегидрогеназ, связанных с ферментами дыхательной цепи бактерий. В связи с этим, в качестве биокатализаторов таких систем могут с успехом применяться клетки метилобактерий, которые имеют периплазматическую локализацию дегидрогеназ, основной из которых является метанолдегидрогеназа (МДГ) [3, 4, 5].
На данный момент известно лишь несколько разработанных амперометрических биосенсоров на основе метилобактерий. Так, в работе [6] описан амперометрический биосенсор на основе микроорганизмов M.extorquens pCM160 с использованием 2,5-дибром-п-бензохинона в качестве медиатора электронного транспорта. В работе [7] изучали биоэлектрокаталитическое окисление формальдегида метилобактериями Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4 в присутствии медиатора ферроцена. В работе [8] представлены данные об эффективности окисления метанола клетками метилобактерий в присутствии различных медиаторов электронного транспорта.
В описанных работах в качестве искусственных акцепторов электронов применялись нерастворимые медиаторы, входящие в состав графитовой пасты рабочего электрода биосенсора. Подобная локализация медиатора может снижать стабильность биосенсора за счет токсического действия на биокатализатор - метилобактерии. Известно, что, растворимая медиаторная пара феназинметасульфат (ФМС) и 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) используется для
спектрофотометрического определения активности дегидрогеназ. Их совместная работа обусловлена способностью ДХФИФ восстанавливаться флавопротеиновыми ферментами и, посредством ФМС, в качестве промежуточного переносчика электрона, соединиться с никотинамиднуклеотидсвязанными дегидрогеназами [9, 10]. Данная медиаторная пара ранее не применялась в амперометрических биосенсорах, поэтому изучение биоэлектрокаталитических свойств метилобактерий Methylorubrum extorquens pCM160 в присутствии ДХФИФ и ФМС является актуальной задачей.
Целью работы является изучение биоэлектрокаталитических свойств метилобактерий M. extorquens pCM160 в присутствии искусственных акцепторов электронов - ФМС и ДХФИФ.
Материалы и методы
Микроорганизмы. В данной работе использовали рекомбинантный штамм метилотрофных бактерий Methylorubrum extorquens pCM160 [11].
Культивирование метилобактерий. Микроорганизмы выращивали на минеральной среде Канеда с добавлением метанола (0,5 %/об) и канамицина (0,05 г/л) как описано ранее [12]. Биомассу микроорганизмов отделяли центрифугированием на 5 сутки культивирования при 10000 g в течение 10 минут, дважды промывали 50 мМ калий фосфатным буфером и хранили в морозильной камере при температуре -20°С.
Формирование рабочего электрода. Электрод, содержащий графитовую пудру и парафиновое масло, готовили по известной методике [13], кончик наполняли смесью графитовой пудры «Fluka» (Германия), гидроксиапатита («Bio-Rad», США) и парафинового масла «Fluka» (Германия), которая тщательно растиралась в агатовой ступке.
В качестве биоматериала для электрода использовали микроорганизмы M.extorquens pCM160. На поверхность электрода иммобилизовали 20 мг биомассы, подсушивали без нагревания в течение 3 мин и досушивали при комнатной температуре 15 минут. Для более прочной иммобилизации клеток использовали диализную мембрану с размером пор 14 кДа («Sigma», США), закрепляя резиновым кольцом.
Электрохимические измерения. Электрохимические измерения проводили при помощи гальванопотенциостата «IPC-Micro», интегрированного с ПК, по установленной методике [13].
Рабочий и хлорсеребряный электроды погружали в электролитическую ячейку объемом 4 мл, содержащую раствор фосфатного буфера с pH=8,0 с добавлением хлорида аммония (15 мМ), и медиаторов электронного транспорта - ФМС (1 М) и ДХФИФ (0,08 М). Измерения выполняли при постоянном потенциале 250 мВ и непрерывном перемешивании (300 об/мин).
За ответ сенсора принимали величину разности силы тока (AI = I -I0) до внесения (I0) и после внесения (I) субстрата в измерительную кювету. В качестве исследуемых растворов использовали метанол и другие субстраты.
Регистрацию циклических вольтамперограмм проводили в трехэлектродной ячейке с помощью вольтамперометрического анализатора «ЭКОТЕСТ-ВА» [13]. Рабочим электродом являлся модифицированный графито-пастовый электрод, вспомогательным -платиновый, а электродом сравнения - хлорсеребряный.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью компьютерных программ SigmaPlot и Microsoft Office Excel.
Результаты и их обсуждение
Изучение электрохимических свойств медиаторной пары ДХФИФ и ФМС методом циклической вольтамперометрии.
Возможность использования веществ с обратимыми окислительно-восстановительными свойствами в качестве медиаторов электронного транспорта между биологическими рецепторами и поверхностью электрода изучают методом вольтамперометрии. Электрохимические свойства медиаторной пары ФМС и ДХФИФ изучали методом циклической вольтамперометрии в трехэлектродной системе для каждого медиатора по отдельности и при их совместном присутствии (рис. 1). В качестве модификатора графитовой пасты рабочего электрода использовался гидроксиапатит (НА), который, как показано ранее улучшает адсорбцию биокатализатора, увеличивая ток в системе, не влияя при этом на окислительно-восстановительные свойства медиаторов [14].
Для графито-пастового электрода в присутствии одного медиатора ДХФИФ пиков окисления и восстановления практически не наблюдалось, что делает невозможным использование данного вещества в качестве единственного переносчика электронов. Вольтамперограммы для электродов в присутствии одного ФМС и при совместном присутствии ФМС и ДХФИФ практически идентичны и имеют классический вид с четкими пиками окисления (анодный пик, около 50 мВ) и восстановления (катодный пик, около -225 мВ). Однако использование ФМС в качестве
единственного медиатора электронного транспорта невыгодно из-за нестабильнности окислительной формы [10].
.............iM-^'H"......i.................'
-400 -350 -300 -250 -200 -150 -100 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400
Потенциал, мВ
Рис.1. Циклические вольтамперограммы (50 мВ/с)
для графито-пастового электрода с иммобилизованными метилобактериями M. extorquenspCM160
Процесс, протекающий при окислении метанола мембранной МДГ, содержащей кофактор PQQ, в присутствии ФМС и ДХФИФ, может быть представлен следующим образом:
Анод: СНзОН + PQQ-МДГ НСОН + PQQH2-M£(r
рддн2-мдг + фмсок. фмсв0с. + pqq-мдг
ФМСвос. + ДХФИФок. ФМСок. + ДХФИФвос.
Катод: AgCl + е" -э- Ag + Cl"
Селективность амперометрического медиаторного биосенсора на основе метилобактерий M. extorquens pCM160 в присутствии ФМС и ДХФИФ. Селективность биосенсорного анализа определяется специфичностью биорецептора, которая напрямую зависит от свойств биоматериала. Субстратную специфичность микроорганизмов оценивали, определив величину откликов сенсора на одну и ту же концентрацию субстрата (рис. 2).
16000
^ 14000
12000
о 10000
£ 8000 и
н 6000 <и
£ 4000
О 2000 0
Субстраты
Рис. 2. Субстратная специфичность микроорганизмов M. extorquens pCM160 в присутствии медиаторов ФМС и ДХФИФ
Окисление спиртов в клетках метилобактерий катализирует фермент МДГ. Известно [15], что МДГ не является высокоспецифичным ферментом и, кроме метанола, фермент способен окислять другие первичные спирты (С1-С5), но незначительно взаимодействует с их вторичными и третичными изомерами.
Высокий ответ биосенсора на формальдегид может быть связан с неспецифическим окислением гидратированной формы формальдегида МДГ [16], либо с прямым окислением формальдегида до формиата формальдегиддегидрогеназой, которая в большом количестве содержится у всех метилотрофных бактерий.
Высокий ответ биосенсора на муравьиную кислоту может быть связан с окислением формиата до С02 под действием таких ферментов, как мембрансвязанная формиатоксидазы и формиатдегидрогеназа.
Кроме того, биосенсор на основе М. ех^щиет рСМ 160 давал небольшие ответы на некоторые другие субстраты - щавелевую кислоту, нитрометан, глицерин, глюкозу, что связано мультиферментной природой используемого биокатализатора.
Полученный профиль субстратной специфичности сравнивали с ранее зарегистрированными данными для подобной системы в присутствии медиатора ферроцена [17]. Высокие ответы в обеих работах получены на метанол, этанол, бутанол и изоамиловый спирт, что также согласуется с литературными данными [15]. Таким образом, медиаторная пара ДХФИФ и ФМС значительно не изменяет профиль субстратной специфичности метилобактерий М. ех^щиет рСМ160 в условиях электрокаталитичсеского окисления субстратов.
Операционная стабильность амперометрического
медиаторного биосенсора на основе метилобактерий М. extorquens рСМ160 в присутствии ФМС и ДХФИФ. Операционная стабильность сенсора демонстрирует устойчивость ответа сенсора на одну и ту же концентрацию субстрата. Данную характеристику определяли с использованием метанола в качестве субстрата. Для количественной оценки операционной стабильности сенсоров использовали относительное стандартное отклонение Sr (ответы сенсора на модельный раствор 12,8 мМ метанола в кювете), которое составило 6 %. Среднее значение ответов биосенсора - 8300 ± 300 нА.
Кинетические параметры биокатализатора - метилобактерий М. ех^щиет рСМ160 в присутствии ФМС и ДХФИФ. Полученные экспериментально зависимости генеририруемого тока Д1 при варьировании концентрации метанола в кювете (рис. 3) для амперометрического медиаторного биосенсора на основе метилобактерий в присутствии растворимых медиаторов ФМС и ДХФИФ аппроксимировали (табл. 1) к уравнениям Михаэлиса - Ментен и Хилла [18]:
г? _ Утах X [Л ф
где 11 - начальная скорость при концентрации субстрата :,тах - максимальная скорость; Км - константа Михаэлиса-Ментен; И - коэффициент Хилла.
Полученные параметры свидетельствуют о лучшей корреляции зависимости с уравнением (2) ^2=0,9562), что объясняется использованием иммобилизованного биокатализатора - бактериальных клеток, а не чистого фермента в условиях гомогенного ферментативного катализа. Кинетические свойства биокатализатора, полученные при аппроксимации зависимостей разными уравнениями похожи, хотя прослеживается некоторое различие в параметрах, в частности в Км. Кажущаяся КМ к метанолу ниже (0,55±0,05 мМ) при обработке зависимости уравнением (1), максимальные скорости биоэлектрокаталитического окисления метанола клетками М. ех^щиет рСМ160 находятся на одном уровне.
16000
14000 -
12000 -
Ц 10000 -
<в о.
§ 8000 -
х
01
Н 6000 -
о со
5 4000 -
2000 -0 -
0 5 10 15 20 25
Концентрация метанола,ммоль/л
Рис. 3. Зависимость ответов амперометрического медиаторного биосенсора на основе метилобактерий М. ех^щиет рСМ160 в присутствии ФМС и ДХФИФ от концентрации субстрата
Таблица 1
Параметры уравнений Михаэлиса-Ментен и Хилла_
Параметр Михаэлис-Ментен Хилл
Vmax, нА 12500 ±300 15000 ±1000
Км, мМ 0,55 ± 0,05 0,9 ± 0,3
2 R 0,9400 0,9562
h — 0,63 ± 0,08
Для снижения ошибок анализа использовали линейный участок калибровочной зависимости, который аппроксимировали уравнением прямой (Р=0,95; п=8): у=(7400±600)-х+(2000±200), R=0,9609. Коэффициент чувствительности определяли как тангенс угла наклона линейного участка калибровочной зависимости, а предел обнаружения рассчитывали по формуле (3):
где £ - коэффициент чувствительности; s0 - стандартное отклонение аналитического сигнала фона [11].
Аналитические и метрологические характеристики сенсора. В
работе определили аналитические и метрологические характеристики амперометрического медиаторного биосенсора на основе метилобактерий М. ех^щиет рСМ160 в присутствии растворимой медиаторной пары ФМС и ДХФИФ. Данные сравнивали с ранее полученными для подобной системы в присутствии медиатора ферроцена (табл.2).
Таблица 2
Аналитические и метрологические характеристики сенсора на основе
метилобактерий М. ехШциет рСМ160
Характеристика биосенсора ДХФИФ и ФМС Ферроцен [12]
Коэффициент чувствительности, нАхдм3/ммоль 7400 ± 600 1600± 500
Предел обнаружения, ммоль/дм3 0,05 0,023
Нижняя граница определяемых концентраций, ммоль/дм3 0,2 ± 0,1 0,06 ± 0,01
Повторяемость, отклонение от среднего значения за 15 измерений, % 6 13
Верхняя граница линейного диапа-
зона определяемых концентраций 0,9 ± 0,3 0,97 ± 0,09
(Км), ммоль/дм3
Время отклика, с 240 60-120
Время измерения, мин 10 5
Таким образом, использование клеток М. ех^щиеж рСМ160 в качестве биокатализатора облегчает проведение анализа вследствие отсутствия стадии выделения и очистки фермента. Чувствительность данного биосенсора выше почти в 5 раз, а предел обнаружения (0,05 ммоль/дм3) примерно равен пределу обнаружения в присутствии медиатора ферроцена. Анализ повторяемости откликов биосенсора на одну и ту же концентрацию субстрата подтверждает ранее выдвинутое предположение о лучше стабильности биокатализатора в присутствии растворимых медиаторов ФМС и ДХФИФ.
Выводы
Изучены медиаторные свойства медиаторной пары ДХФИФ и ФМС методом циклической вольтамперометрии. Данные искусственные акцепторы электронов хорошо проводят ток, что позволяет их использовать совместно в качестве медиаторов для амперометрического биосенсора на основе метилобактерий.
Изучена субстратная специфичность метилобактерий М. ех^щиет рСМ160 в присутствие медиаторов электронного транспорта - ФМС и
ДХФИФ. Наиболее высокие ответы наблюдались на метанол, этанол, бутанол и формальдегид, зарегистрированы ответы на муравьиную кислоту, щавелевую кислоту, нитрометан, глицерин и глюкозу.
Определены характеристики биосенсора на основе метилобактерий M.extorquens pCM160 в присутствии медиаторной пары ДХФИФ и ФМС при использовании метанола в качестве субстрата. Данный сенсор обладает высокой чувствительностью (7400±600 нА*дм3/ммоль) и стабильностью (Sr = 6 %), что выгодно отличает его от аналогов.
Работа выполнена при финансовой поддержке проекта государственного задания МИНОБРНАУКИ (FEWG-2020-0008 «Направленное формирование нано/био интерфейсов с переносом заряда в биоэлектрохимических системах»).
Список литературы
1. Дзядевич С.В. Амперометрические биосенсоры. Основные принципы работы и особенности датчиков разных генераций // Биополимеры и клетка. 2002. Т. 18. № 1. С. 13-25.
2. Троценко Ю.А. Аэробные метилотрофы - перспективные объекты современной биотехнологии // Журнал Сибирского федерального университета. Биология. 2012. Т. 5. № 3. С. 243-279.
3. Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Торгонская М.Л. Аэробные метилобактерии. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2010. 325 с.
4. Methylobacterium extorquens: methylotrophy and biotechnological applications / A.M. Ochsner, F. Sonntag, M. Buchhaupt [et al.] // Appl Microbiol Biotechnol. 2015. Р. 34-517.
5. Features of Aerobic Methanotrophs: News and Views / V.N. Khmele-nina, S.Y. But, O.N. Rozova [et al.] // Metabolic Curr Issues Mol Biol. 2019. P. 85-100.
6. Кузнецова Т.А., Туленинова М.А. Исследование медиаторных свойств 2,5-дибром-п-бензохинона в амперометрическом биосенсоре на основе метилобактерий. // Известия ТулГУ. Естественные науки. 2016. №2-3. С. 64-69.
7. Биоэлектрокаталитическое окисление формальдегида метилобак-териями Methylobacterium dichloromethanicum ДМ4 в присутствии медиатора электронного транспорта - ферроцена / Т.А. Кузнецова, О.Н. Понамо-рева, А.С. Решетников [и др.] // Известия ТулГУ. Естественные науки. 2012. №1. С. 10.
8. Кузнецова Т.А., Понаморева О.Н., Алферов В.А. Эффективность биоэлектрокаталитического окисления метанола клетками метилотрофных
бактерий в присутствии медиаторов электронного транспорта // Известия ТулГУ. Естественные науки. 2013. №1. С. 222-232.
9. Day, D.J. Methanol dehydrogenase from Methylobacterium extor-quens AMI / D.J. Day and C. Anthony // Methods Enzymol. 1990. V. 188. P. 210-216.
10. Understanding the chemistry of the artificial electron acceptors PES, PMS, DCPIP and Wurster's Blue in methanol dehydrogenase assays / B. Jahn, N.S.W. Jonasson, H. Hu [et al.] // J Biol Inorg Chem. 2020. V. 25. № 2. P. 199212.
11. Кузнецова Т.А., Троценко Ю.А. Конструирование рекомбинант-ной плазмиды для экспрессии гена метанолдегидрогеназы // Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов: сборник трудов конференции. М.: Макс Пресс, 2014. С. 137.
12. Кузнецова Т.А. Биокаталитические свойства клеток Methylobacterium extorquens дикого и рекомбинантного штаммов // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2017. № 4. C. 3-10.
13. Свойства модифицированных амперометрических биосенсоров на основе метанолдегидрогеназы и клеток Methylobacteriumnodulans / Т.А. Кузнецова, А.П. Бесчастный, С.В. Алфёров [и др.] // Прикл. биохим. мик-робиол. 2013. №6. С. 6.
14. Hydroxyapatite nanoarray-based cyanide biosensor / S. Wang, Y. Lei, Y. Zhang [et al.] // Analytical biochemistry. 2010. I. 2. P. 191-197.
15. Cloning, expression, and sequence analysis of the Bacillus methanol-icus C1 methanol dehydrogenase gene / G.E. deVries, N. Arfman, Р. Terpstra [et al.] // Journal of Bacteriology. 1992. V. 174. I. 16. P. 5353-5346.
16. Criterion for Hill equation validity for description of biosensor calibration curves / B.I. Kurganov, A.V. Lobanov, I.A. Borisov [et al.] // Analitica Chimica Acta. 2011. V. 427. P. 11-19.
17. Катыкина АВ., Белякова Т. А., Кузнецова Т.А. Биокатализаторы, полученные из рекомбинантного штамма метилобактерий, как основа ам-перометрического медиаторного биосенсора // Экотоксикология-2018. Тула, 2018. С. 30-32.
18. Основы аналитической химии. В 2 т. Т. 1. Задачи и вопросы: учебное пособие для вузов / под ред. Ю.А. Золотова. М.: Высш. школа, 2012. 384 с.
Улитина Мария Андреевна, магистрант, ulitina. maria98@mail. ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Якимович София Владимировна, студентка, sonya. yakimovich'a mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Карасева Татьяна Александровна, канд. хим. наук, доц., tatulyakuz@,mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет
BIOELECTROCATALYTIC PROPETIES OF METHYLOBACTERIA IN THE PRESENCE OF ARTIFICIAL ELECTRON ACCEPTORS PHENAZINE METHASULFATE AND 2,6-DICHLOROPHENOLINDOPHENOL
M.A. Ulitina, S.V. Yakimovich, T.A. Karaseva
The bioelectrocatalytic properties of Methylorubrum extorquens pCM160 were studied: substrate specificity, stability, kinetic parameters under the conditions of functioning of an amperometric mediator biosensor. The possibility ofjoint use of artificial electron acceptors - phenazine methasulfate and 2,6 - dichlorophenolindophenol as mediators of electron transport in a biosensor based on M. extorquens pCM160, as well as electrochemical properties, is shown by the method of cyclic voltammetry. The main characteristics, metrological and analytical, of the developed biosensor are determined.
Key words: methylobacteria, phenazine metasulfate, 2,6-dichlorophenolindophenol, electronic transport mediators, amperometric biosensor, metrological and analytical characteristics, bioelectrocatalysis.
Ulitina Maria Andreevna, undergraduate, ulitina. maria98@mail. ru, Russia, Tula, Tula State University,
Yakimovich Sofia Vladimirovna, student, sonya. yakimovich@mail. ru, Russia, Tula, Tula State University,
Karaseva Tatiana Alexandrovna, candidate of chemical sciences, associate professor, tatulyakiiz'a mail. ru, Russia, Tula, Tula State University
