CC BY
76
УДК 577.152.119
БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МЕТАНОЛДЕГИДРОГЕНАЗЫ В БЕСКЛЕТОЧНОМ ЭКСТРАКТЕ METHYLOBACTERIUM EXTORQUENS PCM160
А.В. Катыкина, М.А. Улитина, С.П. Баклагина, Т.А. Кузнецова
Изучены свойства метанолдегидрогеназы в бесклеточном экстракте метило-бактерий Methylobacterium extorquens pCM160: активность, специфичность, кинетические параметры, влияние активаторов и ингибиторов, стабильность при хранении. Данные параметры получены посредством спектрофотометрического определения активности фермента с использованием феназинметосульфата и 2,6-дихлорфенолиндофенола в качестве искусственных акцепторов электронов.
Ключевые слова: биокатализатор, метилобактерии, метанолдегидрогеназа, активность фермента.
Введение
Особый метаболизм метилобактерий позволяет использовать их клетки и ферменты в биоаналитике, что является доступной альтернативой дорогостоящим и сложным физико-химическим методам обнаружения [1 -4]. Основным ферментом этих бактерий является периплазматическая пирролохинолинхинон (PQQ)-зависимая метанолдегидрогеназа (МДГ), катализирующая окисление метанола до формальдегида, передавая электроны на специфический кислый цитохром ^ [5, 6]. Известно [7], что in vitro МДГ способна проявлять активность с искусственными акцепторами электронов, такими как феназинметосульфат (ФМС) и феназинэтосульфат (ФЭС), что используется в классическом методе определения активности PQQ-дегидрогеназ [8].
Понимание биокаталитических свойств МДГ является первым и необходимым этапом при разработке новых биосенсорных систем. Для определения области применения, условий эксплуатации и повышения эффективности таких биосенсоров необходимо изучить свойства биокатализатора, а именно: субстратную специфичность, влияние посторонних примесей на активность, условия хранения. В данной работе объектом исследования являлся бесклеточный экстракт метилобактерий, преимущество которого - легкость получения, исключающая трудоемкую стадию выделения чистого фермента МДГ [9, 10]. С другой стороны, по сравнению с целыми клетками метилобактерий, бесклеточный экстракт должен обладать высокой чувствительностью за счет доступности фермента для акцепторов электронов и субстратов.
В связи с этим целью работы является характеристика биокаталитических свойств МДГ из бесклеточного экстракта Methylobacterium extorquens pCM 160.
Материалы и методы
Микроорганизмы. В работе использовали рекомбинантный штамм метилобактерий Methylobacterium extorquens рСМ160 [11].
Условия культивирования. Микроорганизмы выращивали на минеральной среде Канеда, с метанолом в качестве источника углерода и энергии, как описано ранее [12]. Клетки микроорганизмов отделяли центрифугированием на 7-е сутки культивирования при 10000 g в течение 20 минут, дважды промывали 50 мМ калий-фосфатным буфером, рН 7,5 с последующим ресуспендированием в том же буфере.
Получение бесклеточного экстракта. Клеточную суспензию разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе MSE150 (Англия) при охлаждении льдом: 15 циклов по 10 секунд с интервалом 60 секунд. Клеточные мембраны отделяли центрифугированием при 30000 g в течение 30 мин при 4 °С. Полученный бесклеточный экстракт использовали для дальнейших опытов.
Определение активности. Активность МДГ в бесклеточном экстракте определяли спектрофотометрически по стандартной методике, с небольшими модификациями реакционной смеси [9]. При изучении влияния активаторов и ингибиторов на активность фермента заменяли вносимые 300 мкл воды на 300 мкл 0,01М растворов солей. Реакцию активировали внесением экстракта.
Белок в экстрактах определяли методом Лоури, в качестве стандартного белка использовали раствор БСА.
Результаты и их обсуждение
МДГ катализирует реакцию по механизму «пинг-понг» с последовательным восстановлением PQQ метанолом и выделением формальдегида. Кинетические параметры дегидрогеназ определяют с помощью спектрофотометрического анализа, впервые описанного Энтони и Затманом более 50 лет назад, в котором в качестве искусственных первичных акцепторов электронов используют алкилированные феназины, такие как ФЭС или ФМС [8].
В данной работе определение активности проводили при использовании в качестве переносчиков электронов систему - ФМС+2,6-дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) по следующей схеме:
СН3ОН + PQQ ^ НСОН + PQQH2
PQQH2 + ФМСок. ^ ФМСвос. + PQQ
ФМСвос. + ДХФИФок. ^ ФМСок. + ДХФИФвос.
Влияние активаторов и ингибиторов на активность МДГ в бесклеточном экстракте M. extorquens pCM160
Скорость ферментативной реакции, как и активность фермента, в значительной степени определяется присутствием в среде активаторов и ингибиторов, что может иметь регуляторное значение. В ряде случаев ионы металлов (Са2+, Mg2+, 7п2+, Fe2+) выполняют функции простетических групп ферментов, стабилизируя активный центр фермента, или способствуют присоединению субстрата к активному центру и образованию фермент-субстратного комплекса. Ионы же тяжелых металлов (Си2+, РЬ2+, Hg2+, Cd2+) могут являться неспецифичными ингибиторами и приводить к необратимой денатурации белковой части фермента.
Аналогично другим PQQ-МДГ [8, 9], активность МДГ в бесклеточном экстракте M. extorquens рСМ160 с искусственными акцепторами электронов ФМС и ДХФИФ зависела от присутствия активатора - КН4+. В отсутствии N^0 с метанолом и эндогенным субстратом реакций не наблюдалось. Половина максимальной скорости достигалась при его концентрации 0,6 ± 0,3 мМ.
При изучении влияния ионов металлов на биокаталитические свойства МДГ в бесклеточном экстракте M. extorquens рСМ160 (табл. 1) показано, что незначительное увеличение активности наблюдается при внесении раствора соли Са2+ (на 13 %), что может быть связано с наличием данного иона металла в активном центре фермента [13]. Из литературных данных известно, что ион Са2+, благодаря своим координационным связям с кислородом на карбонильном атоме С5 в молекуле PQQ, стабилизирует его для атаки оксианионом или гидрид-ионом в механизме прямого гидридного переноса [5]. Поэтому добавление раствора данного иона может способствовать лучшей стабилизации активного центра и, как следствие, повышению активности МДГ.
Незначительное снижение активности наблюдается при добавлении растворов солей РЬ2+, 7п2+, Mg2+и Мп2+. Стоит отметить сильное ингибиро-вание фермента катионами Со2+ (на 55%) и полное подавление активности раствором соли Си2+. Случаи сильного ингибирования активности солями меди описаны для разных ферментов [14,15], в том числе и снижение активности МДГ [16].
Специфичность фермента МДГ в бесклеточном экстракте
M. extorquens pCM160
Известно, что МДГ обладает широкой субстратной специфичностью и может окислять множество первичных спиртов, карбоновых кислот, альдегидов с недлинным углеводородным скелетом (метанол, этанол, пропанол, щавелевая кислота, муравьиная кислота, формальдегид и т. д.) [17]. Субстратную специфичность оценили,
определив удельную активность МДГ по отношению к различным субстратам (рис. 1).
Таблица 1
Влияние солей металлов на активность МДГ в бесклеточном экстракте М. ех^щиет рСМ160
Вещество Активность МДГ, %
Контроль 100,00±0,02
103,6±0,9
СаСЬ 113±2
^04*7^0 45,1±0,8
РЬ(СНзСОО)2 93±2
7^04*7^0 90,51±0,07
MgS04x7H20 94±2
М^04*5Н20 91±1
С^04*5Н20 0
Рис. 1. Активность МДГ в бесклеточном экстракте М.ех1ощиет рСМ160 по отношению к различным субстратам
Показано, что МДГ бесклеточного экстракта Ы. extorquens рСМ160 проявляет широкую субстратную специфичность, с наибольшей активностью по отношению к метанолу. Для большинства субстратов определены кинетические параметры ферментативной реакции (табл. 2).
В целом с увеличением длины и разветвленности углеродной цепи спиртов возрастало кажущееся значение КМ фермента, тогда как максимальная скорость реакции изменялась незначительно. Субстратами являлись также формальдегид, глицерин, муравьиная и щавелевая кислоты. Наименьшая КМ характерна для метанола (0,064±0,008мМ), что свидетельствует о высшем сродстве фермента МДГ М extorquens рСМ160 к данному субстрату и согласуется с литературными данными (0,01-0,45 мМ [18]).
Таблица 2
Субстратная специфичность МДГ из бесклеточного экстракта
M. extorquens pCM160
Субстрат Кажущиеся КМ, мМ Активность,%
Метанол 0,064±0,008 1,2±0,1
Этанол 0,23±0,05 83
Бутанол-1 0,5±0,1 83
Бзопропанол 0,5±0,4 50
Трет-бутанол 0,7±0,3 36
Муравьиная 0,2±0,1 47
Щавелевая 1,0±0,4 36
Стабильность МДГ в бесклеточном экстракте М. extorquens рСМ160 при хранении.
Для изучения стабильности МДГ были подготовлены 2 образца бесклеточного экстракта Ы. extorquens рСМ160, хранение которых проводили двумя способами - при +4 °С и -20 °С. При этом провели мониторинг изменения активности фермента МДГ (рис. 2).
*-*—
; --4 с
I
-Ч _
\ —- 20 С
- '■♦-1-♦-1-1-1-1-
0 10 20 30 40 50 60
время хранения, сут
Рис. 2. Удельная активность МДГ в бесклеточном экстракте M. extorquens pCM160 при хранении
Эксперименты показали, что образец бесклеточного экстракта М. ех^щиет pCM160, хранившийся при -20 °С, за 60 суток потерял 26 % активности, что позволяет использовать данный биоматериал для дальнейших измерений. Хранение экстракта при +4 °С не позволяет использовать биоматериал в биосенсорном анализе в долгосрочной перспективе, т. к. за 6 суток активность фермента снизилась на 90 %.
Выводы
Анализ влияния активаторов показал, что активность МДГ в бесклеточном экстракте M extorquens рСМ160 абсолютно зависит от присутствия N^4+ и повышается на 13 % при внесение раствора соли Са2+. Незначительное изменение активности наблюдается при добавлении растворов солей №+, РЬ2+, 7п2+, Mg2+и Мп2+. При проведении биосенсорных анализов с использованием бесклеточного экстракта Ы. extorquens рСМ160 в качестве биокатализатора следует избегать присутствия солей Со2+ и Си2+ из-за сильного ингибирования фермента (на 55 % и 100 %, соответственно).
При изучении субстратной специфичности подтверждена зависимость уменьшения удельной активности МДГ в бесклеточном экстракте Ы. extorquens рСМ160 с увеличением длины и разветвленности углеводородного радикала. Половина максимальной скорости ферментативной реакции достигается при концентрации метанола 0,064±0,008 мМ, что свидетельствует о высоком сродстве фермента МДГ к данному субстрату.
Чтобы избежать потерь активности фермента в бесклеточном экстракте M. extorquens pCM160, его хранение необходимо осуществлять при - 20 °C и ниже.
Таким образом, бесклеточный экстракт M. extorquens pCM160 при соблюдении определенных условий может служить эффективным биокатализатором биосенсора.
Работа выполнена при финансовой поддержке проекта государственного задания МИНОБРНАУКИ (FEWG-2020-008 «Направленное формирование нано / био интерфейсов с переносом заряда в биоэлектрохимических системах»).
Список литературы
1. Aerobic methylobacteria as promising objects of modern biotechnology (Review) / N.V. Doronina, M.L. Torgonskaya, D.N. Fedorov [et al] // Applied Biochemistry and Microbiology. 2015. Vol. 51. № 2. P. 125-134.
2. Chistoserdova L. Applications of methylotrophs: can single carbon be harnessed for biotechnology? // Current opinion in biotechnology. 2018 V. 50. P. 189-194.
3. Synthetic methylotrophy: A practical solution for methanol-based biomanufacturing / Y. Wang, L. Fan, P. Tuyishime [et al] // Trends in Biotechnology. 2020. V 38. № 6. P. 650-666.
4. Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Хмеленина В.Н. Биология и биотехнология аэробных метилотрофов: учебное пособие. Тула: Изд-во ТулГУ, 2010. 227 c.
5. Anthony C., Williams P. The structure and mechanism of methanol dehydrogenase // Biochim. Biophys. Acta. 2003. V. 1647. P. 18-23.
6. The crystal structure of methanol dehydrogenase, a quinoprotein from the marine methylotrophic bacterium Methylophaga aminisulfidivorans MP / T.P. Cao, J.M. Choi, S.W. Kim [et al] // J Microbiol. 2018. V. 56. № 4. P. 246-254.
7. Understanding the chemistry of the artificial electron acceptors PES, PMS, DCPIP and Wurster's Blue in methanol dehydrogenase assays / B. Jahn, N.S.W. Jonasson, H. Hu [et al] // J Biol Inorg Chem. 2020. V. 25. № 2. P. 199-212.
8. Anthony С., Zatman L.J. The microbial oxidation of methanol // Biochem. J. 1964. V.92. P.614-621.
9. Очистка и характеристика метанолдегидрогеназы ризосферного фитосимбионта Methylobacterium nodulans / Т.А. Кузнецова, А.П. Бесчастный, О.Н. Понаморева [и др.] // Прикл. биохим. микробиол. 2012. Т. 48. № 6. С. 606 - 611.
10. Waturangi D., Marko N., Suhartono M.T. Purification of methanol dehydrogenase from mouth methylotrophic bacteria of tropical region // Malaysian Journal of Microbiology. 2011. V. 7. № 4. P. 226-229.
11. Кузнецова Т.А., Троценко Ю.А. Конструирование рекомби-нантной плазмиды для экспрессии гена метанолдегидрогеназы // Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов: сборник трудов конференции. М.: Макс Пресс, 2014. С. 137.
12. Кузнецова Т.А. Биокаталитические свойства клеток Methylo-bacterium extorquens дикого и рекомбинантного штаммов // Известия Тул-ГУ. Естественные науки. 2017. № 4. C. 3-10.
13. The atomic resolution structure of methanol dehydrogenase from Methylobacterium extorquens / P.A. Williams, L. Coates, F. Mohammed [et al] // Acta Cryst. 2005. V.61. P. 75-79.
14. Effects of copper on wild and tolerant strains of the lichen photobi-ont Trebouxia erici (Chlorophyta) and possible tolerance mechanisms / M. Backor, D. Fahselt, R.D. Davidson [et al] // Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 2003. V. 45. P. 159-167.
15. Faixova Z., Faix S. Influence of metal ions on ruminal enzyme activities // ActaVeterinaria Brno. 2002. V. 71. P. 451-455.
16. Purification and properties of methanol dehydrogenase from Methylosinus sp. WI 14 / S. Grosse, C. Voigt, K.-D. Wendlandt [et al] // J. Basic Microbiol. 1998. V. 38. № 3. P. 189-196.
17. A systems biology approach uncovers cellular strategies used by Methylobacterium extorquens AM1 during the switch from multi- to singlecarbon growth / E. Skovran, G.J. Crowther, X. Guo [et al] // PLoS ONE. 2010. V. 5. № 11. P 1-16.
18. BRENDA - The Comprehensive Enzyme Information System // Information on EC 1.1.2.7 - methanol dehydrogenase (cytochrome c): [сайт]. URL: https://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=1.1.2.7 (дата обращения 7.05.2020).
Катыкина Анна Валерьевна, магистрант, kireeva-anya'a mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Улитина Мария Андреевна, студент, ulitina. maria98@mail. ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Баклагина София Петровна, студент, sofiabaklagina'agmail. com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Кузнецова Татьяна Александровна, канд. хим. наук, доц., tatulyakuz@,mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет
BIOCATALYTIC PROPERTIES OF METHANOLDEHYDROGENASE FROM CELL-FREE EXTRACT OF METHLOBACTERIUM
EXTORQUENS PCM160
A.V. Katykina, M.A. Ulitina, S.P. Baklagina, T.A. Kuznetsova
The experiment was aimed at studying the properties of methanol dehydrogenase in a cell-free extract methylobacteria Methylobacterium extorquens pCM160: activity, peculiarity, kinetic parameters, the influence of activators and inhibitors, the stability of keeping. These properties were defined by means of spectrophotometry determination activity of the ferment with the help of phenazinmethosulfate and 2,6-dichlorphenolindophenol as the artificial acceptors of electrons.
Key words: biocatalyst, methylobacteria, methanol dehydrogenase, the activity of the
ferment.
Katykina Anna Valerievna, graduate student, kireeva-anya'a mail.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Ulitina Maria Andreevna, student, ulitina. maria98@mail. ru, Russia, Tula, Tula State University,
Baklagina Sofia Petrovna, student, sofiahaklaginaai gmail. com, Russia, Tula, Tula State University,
Kuznetsova Tatiana Alexandrovna, candidate of chemical sciences, associate professor, department of chemistry, tatiilvakiizaimail. ru, Russia, Tula, Tula State University
