CC BY
17
УДК 661.185.1:579.846.33
Крисанова В.А., Клейменова Е.А., Киенская К.И, Буторова И.А.
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БИОПАВ, СИНТЕЗИРУЕМЫХ OCHROBACTRUM CICERI
Крисанова Валерия Александровна - студент 3 курса факультета ФЕН, e-mail: [email protected]; Клейменова Екатерина Андреевна - магистр 1 года обучения факультета ХФТ и БП; Киенская Карина Игоревна - к.х.н., доцент кафедры ТХФиКС; Буторова Ирина Анатольевна - к.б.н., доцент кафедры ТХФиКС.
ФБГОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева», Москва, 125047, Миусская площадь, дом 9.
В статье рассмотрены физико-химические свойства биосурфактантов, синтезируемых штаммом бактерий Ochrobactrum ciceri ВСБ-947 на этиловом спирте как единственном источнике углерода и энергии. БиоПАВ выделены из биомассы экстракцией этилацетатом. Обнаружено, что биоПАВ обладают эмульгирующей активностью. Определено поверхностное натяжение, электропроводность образца микробного ПАВ, сделано предположение о его типе и структуре.
Ключевые слова: биосурфактанты, экстракция, гликолипиды, эмульгирующая активность.
PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES OF BIOSURFACTANTS PRODUCED BY OCHROBACTRUM CICERI
Krisanova V.A., Kleimenova E.A., Kienskaya K.I., Butorova I.A. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia.
The article considers physico-chemical properties of biosurfactants produced by the strain of bacteria Ochrobactrum ciceri VSB-947 on ethanol as a single source of carbon and energy. The biosurfactant was obtained by ethyl acetate extraction from a biomass. It was found that biosurfactant shows an emulsifying activity. The surface tension and electrical conductivity of the microbial surfactant sample were determined. An assumption was made about its type and structure.
Keywords: biosurfactants, extraction, glycolipids, emulsifying activity.
Введение
БиоПАВ (или биосурфактанты) - поверхностно-активные вещества биологического происхождения с выраженными мультифункциональными свойствами. Данные амфифильные соединения вырабатываются микроорганизмами, такими как дрожжи, бактерии и грибы. В настоящее время наблюдается повышенный интерес к биоПАВ, обусловленный их высокой биоразлагаемостью и биосовместимостью, низкой токсичностью, а также возможностью получения из возобновляемых источников. Подобные свойства позволяют рассматривать биосурфактанты в качестве альтернативы синтетическим поверхностно-активным веществам, производимым в химической промышленности. Последние с трудом поддаются биологическому разложению и, следовательно, имеют экологические нормы для их использования. Основным препятствием для широкого практического использования биоПАВ в настоящее время является высокая стоимость их производства. Поиск новых штаммов микроорганизмов, продуцирующих биоПАВ, выбор новых видов сырья для их производства, изучение свойств полученных соединений остается на сегодняшний день актуальной задачей, поскольку открывает возможности для удешевления технологии получения биосурфактантов [1,2,3].
В связи с вышеизложенной целью настоящего исследования явилось установление основных физико-химических характеристик биоПАВ,
синтезируемых штаммом бактерий Ochrobactrum ciceri ВСБ-947 в процессе культивирования на этиловом спирте.
Экспериментальная часть
Объектом исследования являлся штамм бактерий Ochrobactrum ciceri ВСБ-947, предоставленный компанией ООО «Экобио».
Культивирование штамма и выделение из биомассы биоПАВ проводили по ранее разработанной технологической схеме, включающей культивирование штамма на минеральной среде с этанолом при 30°С в течение 7 суток при перемешивании 220 об/мин. Выделение биоПАВ проводили экстракцией этилацетатом при температуре окружающей среды при перемешивании. Перед экстрагированием клетки предварительно отделяли центрифугированием суспензии при 3000 об/мин в течение 5 мин.
Эмульгирующую активность оценивали по величине индекса эмульгирования [4].
ТСХ проводили на пластинках с силикагелем БПиМ иУ 254 в системе растворителей хлороформ -метанол - вода в соотношении 65:15:2. Пластинки проявляли нафтольным реагентом (0,5 г а-нафтола растворяли в 100 мл смеси метанол-вода в соотношении 1:1), после чего проявляли 10% И2804 и нагревали в сушильном шкафу до 110 0С до максимального проявления окраски.
Определение поверхностного натяжения проводили с помощью метода висящей капли Easy Drop на приборе DSA 20Е KRUSS GmbH (Германия).
Определение электропроводности проводили с помощью кондуктометра и кондуктометрической ячейки для измерения водных растворов [5]. Спектр поглощения в УФ области в диапазоне длин волн 200-500 нм снимали на приборе Shimadzu UV-1800.
ИК-спектр записан ИК-Фурье Shimadzu IRAffinity-1S.
Штамм Ochrobactrum ciceri ВСБ-947 природный, выделен из нефтешламов в Ханты-Мансийском АО, идентифицирован в Национальном биоресурсном центре. Заключение о непатогенности получено в Московской испытательной лаборатории ФГБУ ЦНМВЛ.
На плотной питательной среде бактерии образуют слизистые колонии, что дает основание предполагать о способности штамма синтезировать ПАВ (рис.1). На питательной среде с сафранином рост штамма сопровождается обесцвечиванием красителя вокруг колоний, свидетельствующим об анионной природе синтезируемого ПАВ (рис.2).
Рис.1. Культуральные признаки колоний Ochrobactrum ciceri ВСБ-947
Рис.2 Рост Ochrobactrum ciceri ВСБ-947 на питательной среде с сафранином
При культивировании штамма Ochrobactrum ciceri ВСБ-947 на минеральной среде с этанолом величина Е24% в полученной суспензии составила 65%, что свидетельствует о высокой эмульгирующей активности и перспективности использования штамма в качестве продуцента биоПАВ. При этом образованная эмульсия была достаточно устойчива и не разрушалась в течение 30 суток.
Поскольку бактерии Ochrobactrum ciceri относятся к той же физиологической группе бактерий, что и бактерии p.Pseudomonas, для которых основным видом биоПАВ являются гликолипиды, а именно рамнолипиды, в качестве подвижной фазы для ТСХ использовали систему, которая часто используется для разделения данной группы гликолипидов.
линия фронта о) 01
о-
Rt = 0,49
линия старта
U'ivrlnirthlrai)
Рис.3 ТСХ и УФ-спектр поглощения образца биоПАВ
X» ЗОЮ
Рис.4 ИК-спектр образца биоПАВ
В результате исследований было установлено, что в полученном образце биоПАВ присутствует единственное вещество с Rf = 0,49, близкое к рамнолипидам. На УФ-спектре поглощения биоПАВ, снятом в диапазоне длин волн 200-500 нм, обнаруживается один пик (рис. 3), соответствующий определенной хромофорной группе соединения. Полученный ИК- спектр свидетельствует о наличии связей, характерных для рамнолипидов (рис. 4).
Для полученного образца биоПАВ были получены изотерма поверхностного натяжения и определены значения удельной электропроводности кондуктометрическим методом (рис. 5,6).
75 70 65 60 55 50 45 40
V (?,мДж/1 V u2
fw
\
4 4 \ TfTfTV T
4 \ \ ! - 1
\ \
\ \ \ 4 г 1 C, IV lacc.
О ОД 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 Рис.5 Изотерма поверхностного натяжения экстракта ПАВ, выделенного из клеточной массы бактерий Ochrobactrum ciceri ВСБ-947
180 160 140 120 100 80 60 40 20 О
M*Ci A'
/
C„ M acc.
О 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1
Рис.6 Зависимость электропроводности от концентрации экстракта ПАВ бактерий Ochrobactrum ciceri ВСБ-947
Как видно из изотермы в области концентраций биоПАВ от 0 до 1% масс. отмечалось снижение поверхностного натяжения с 72,53 до 53,56 мДж/м2, что явно свидетельствует о том, что вещество обладает поверхностно-активными свойствами. По графику электропроводности видно, что в точке 0,15 % масс. происходит излом, который свидетельствует об ассоциации молекул ПАВ, второй излом
показывает достижение ККМ в концентрации экстракта 0,7% масс.
Заключение
Таким образом, полученные результаты исследований открывают возможности для получения ПАВ гликолипидной природы на основе штамма бактерий Ochrobactrum ciceri ВСБ-947 при культивировании на этиловом спирте.
Список литературы
1. И.Н.Гоготов, С.В. Белоножкин, Р.С. Ходаков, А.Н. Шкидченко Биосурфактанты: продуценты, свойства и практическое использование. Материалы 3-ьй Международной конференции —Международное сотрудничество в биотехнологии: ожидания и реальность!. -Пущино: ИЦ —Биоресурсы и экология!. -2006.-С. 104-111.
2. Пирог Т.П., Шевчук Т.А., Волошина И.Н., Карпенко Е.В. Образование поверхностно-активных веществ при росте штамма Rhodococcus erythropolis штамм ЭК-1 на гидрофильных и гидрофобных субстратах // Прикл.биохим. и микробиол., 2004, Т.40.С.544-550.
3. Куюкина М.С. Биосурфактанты актинобактерий рода Rhodococcus: индуцированный биосинтез, свойства, применение.03.00.07 Микробиология. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук.
4. Cooper D.G. and Goldenberg B.G. Surface-active agents from two Bacillus species. Appl Environ Microbiol. 1987. V. 53. № 2. P. 7.
5. Nazarov V.V., Grodsky A.S., Shabanova N.A., Gavrilova N.N., Belova I.A., Zhilina O.V., Kienskaya K.I., Krivoshchepov A.F. (2019). Colloidal chemistry. Workshop and problem book: study guide. SPb, Russia: EBS "Lan".
