CC BY
47УДК 579.222.2+579.26
ВЫДЕЛЕНИЕ БИОСУРФАКТАНТОВ ИЗ СУПЕРАТАНТА ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ DIETZIA MARIS МВ3, DIETZIA MARIS U.2.1
А.Я. Ягофарова1, К.Т. Муканова1, А.А. Наурызова1, Н.Б. Молдагулова1, Ж.К. Масалимов1,2 , Е.М. Раманкулов1
Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан КН МОН РК, гАстана, ул.Валиханова 13/1, 010000, [email protected],РК, 2Евразийский национальный университет им. Л.Н. Гумилева, гАстана, ул.Мунайтпасова 5, 010000, РК
Показана способность штаммов Dietzia maris U.2.1 и Dietzia maris MB3 изменять поверхностное натяжение нефтяной пленки. Приведены результаты по выделению биосурфактантов из штаммов продуцентов, и их ИК - спектры. Количественное определение содержания биосур-фактанов проводили спектрофотометрическим методом.
ВВЕДЕНИЕ
Вещества, являющиеся составной частью бактерий, способные снижать поверхностное натяжение и обладающие эмульгирующей активность относятся к биосурфактантам. Большинство природных биосурфактантов (БиоПАВ) молекулы, содержащие несколько различных структур: липопротеиды, гликолипиды, остатки высших карбоновых и фосфоли-пиды[1].
Современные исследования показали, что биоПАВ обладают значительными преимуществами по сравнению с синтетическими поверхностно - активными веществами - это высокая степень биодеградации, низкая токсичность, возможность их получения из дешевого и возобновляемого источника. Поэтому в настоящее время большое внимание уделяется получению и применению био-сурфактантов при бурении скважин нефтепроводов и добыче нефти, получении смазочных материалов, биоремедиа-ции загрязненных районов, при получении пищевых продуктов, в здравоохранении.
Авторы рассматривали получение биосурфактантов из различных штаммов [2]. Было исследована способность бактериального штамма Rhodococccus ruber УКМ Ас-288 продуцировать кле-точно-связанные биосурфактанты.
Выделение биосурфактантов проводили различными растворителями. Рассматривалась зависимость степени экстракции биоПАВ от различных растворителей. Количество выделенных биоПАВ рассчитывали математически.
Для получения биосурфактантов используют бактерии, выделенные из нефтезагрязненных почв. В работе [3] исследовали низкомолекулярный сур-фактант, полученный из бактерии Serratia sp. НС-Р1 загрязненных нефтью почвенных образцов. Выделение биосур-фактантов проводили ацетоном. Количественное содержание определяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ).
Исследователями [1, 4] были получены биоПАВ из штаммов Serratia marces-cens NSK-1, Pseudomonas sp, выделение последних проводили экстракцией из супернатанта смесью экстрагентов. Измерен сухой вес биосурфактантов, исследована способность снижать поверхностное натяжение, исследованы различные источники углеводородов для роста микроорганизмов, эмульгирующая активность, биохимические характеристики, токсичность, получены ИК спектры.
Также для получения штаммов продуцентов биосурфактантов используют нефтезагрязненную сточную и морскую
воду. Выделение биосурфактантов рам-нолипидов из штамма Renibacterium salmonarium 27BN описано в работе [5], при этом рамнолипиды определяли ТСХ и методом ИК - спектроскопии. Авторами Maneerat S., Phetrong K. были выделены восемь продуцентов биосурфактантов из нефтезагрязненной морской воды [6]. Из них было отобрано три штамма и исследованы изменения эмульгирующей активности в зависимости от изменения температуры, влияние pH, концентрации различных солей.
В настоящей работе показаны результаты выделения биосурфактан-тов продуцируемые штаммами микроорганизмов Dietzia maris U.2.1 и Dietzia maris MB3.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
В качестве исходного материала использовали штаммы нефтеокисляю-щих микроорганизмов Dietzia maris U.2.1 и MB3.
Для получения экзогенных метаболитов микроорганизмы культивировали на агаризованной среде при температуре 30оС. Для получения биомассы углеводо-родокисляющих микроорганизмов их выращивали на питательном бульоне при температуре 37 оС в течение пяти суток на перемешивающим устройстве Stuart S 150.
Для определения наличия биосур-фактантов в чашки Петри с диаметром 15 см помещали 20 мл дистиллированной воды, затем 1мкл сырой нефти на поверхность воды. На поверхность нефти (желательно в центр) добавляли 100 мкл супернатанта, выбранной культуры микроорганизмов. Диаметр образовавшейся чистой зоны измеряли через 30сек.
Непосредственно перед экстракцией культуральную жидкость с бактериями осождали центрифугированием на центрифуге Эппендорф 5110 (Германия) при 3 тыс об/мин в течение 15 минут, при ком-
натной температуре. Выделение экзогенных метаболитов проводили двукратной экстракцией из супернатанта при pH=1,6-2. pH раствора устанавливали 1М HCl и измеряли иономером Consort C830. Органическую фазу собирали в приемники и упаривали. Наличие белого цвета указывает на присутствие сурфактан-тов в данном экстракте. Затем полученный экстракт разбавляли растворителем.
Регистрацию ИК - спектров проводили на ИК Фурье - спектрометре Perkin Elmer Spectrum BX
Определение количественного содержания биосурфактантов проводили с использованием метиленового синего спектрофотометрическим методом. Образец помешали в делительную воронку, устанавливали pH раствора, используя индикатор фенолфталеин, 3 % раствор H2O2 и фосфатно-буферный раствор, прибавляли 1 мл метиленового синего. Экстрагировали двумя порциями хлороформа по 2 мл, если при экстракции наблюдается образование эмульсии, добавляли 1 мл изопропилового спирта. Экстракт собирали в приемнике, фильтруя через воронку со стекловатой.
Растворы H O и фосфатно-буфер-ный раствор, раствор метиленового синего готовили на деионизованной воде, которую получали на бидистилляторе Santorius arium 611DI.
Измерение оптической плотности проводили при 652 нм на спектрофотометре APEL PД-303UV, в качестве холостого раствора использовали растворитель. Содержание сурфактантов рассчитывают по калибровочной кривой, полученной с использованием стандартов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для определения наличия ПАВ и био-сурфактантов на поверхность нефти в различные чашки Петри добавляли по 100 мкл воды, культуральной жидкости,
синтетического ПАВ и супернатанты болитов ^2.1 и 1^3. Общие результаты с штаммов продуцентов экзогенных мета- контрольным образцом представлены в
таблице 1.
Таблица 1 - Определение наличие экзогенных метаболитов в супернатанте
Название Образование зоны Диаметр образовавшейся зоны
контроль ii ii и и
вода и и и и
культур.жид. 0,2см
синтетический ПАВ 3см
Dietzia maris МВ3 4см
Dietzia maris U.2.1 2см
Из таблицы видно, что в контроле и в случае образца с водой чистая зона на поверхности нефтяной пленки не образовалась. Диаметр образовавшейся чистой зоны культуральной жидкости не превышает 0,2 см. При добавлении синтетического ПАВ и штамма Dietzia maris U.2.1 диаметр образовавшейся чистой зоны составляет 3 и 2 см соответственно, наибольший диаметр образовавшейся чистой поверхности 4 см наблюдался в случае штамм Dietzia maris МВ3.
Методом ИК - спектроскопии были исследованы биосурфактанты, выделен-
ные из Dietzia maris MB3 и U2.1. (рисунок 1, 2). ИК - спектры характеризуются наличием характерных для гликолипи-дов функциональных групп.
На спектрах биоПАВ наблюдается наличие широкой полосы валентных колебаний функциональных групп алифатических C-H связей в области 2956, 2927 и 2856 см-1 и при 1452 и 1460 см-1. Полосы валентных колебаний карбонильных групп наблюдаются в области 1706-1690 см-1. В области 1000-1075 и 1251, 1252 см-1 лежат валентные колебания связей сложноэфирной группы С-О-С.
10,9
^С-О-С
Uc-H
Рисунок 1 - ИК спектры гликолипидов биосурфактантов, полученных
из культуры Dietzia maris MB3
102 100
93 96
94 92
ИГ 90
3+ 32 30 73 76
7+
73,1
ЩС-0-С
Ос-н
38«,4 360 0 3200 3300 2400 2000 1300 1600 1400 1200 1 000 846^4
ап-1
Рисунок 2 - ИК спектры гликолипидов биосурфактантов, полученных
из культуры Dietzia maris U 2.1.
Спектрофотометрический метод с красителем метиленовым синим использовали для количественного определения биосурфактантов.
Предварительно была построена калибровочная кривая на стандартных растворах синтетического поверхностно
- активного вещества. Образцы суперна-тантов штаммов Dietzia maris U 2.1. и MB3 продуцентов биосурфактантов проводили через все стадии пробоподготовки, как и калибровочные растворы. Результаты количественного определения био-сурфактантов приведены в таблице 2.
Таблица 2- Количественное определение биоПАВ методом спектрофотометрии
Название штамма А С, мг/л
Dietzia maris U 2.1 1,273 2,159±0,010
Dietzia maris MB3 0,378 0,533±0,012
Данные таблицы 2 свидетельствуют о том, что штамм Dietzia maris U2.1 продуцирует большее количество биосурфактантов, чем Dietzia maris Mb3.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, полученные результаты показывают, что штаммы, получен-
ные из нефтезагрязненной почвы Западно-Казахстанской области Dietzia maris U 2.1 и MB3, способны продуцировать биосурфактанты, относящиеся к группе гликолипидов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
1. Anyanwu С. U., Obi S.K.C., Okolo B.N. Lipopeptide Biosurfactant Production by Serratia marcescens NSK Strain Isolated from Petrolium-contaminated Soil // J. Appl. Sci. Res. 2011. №3. P. 79-87.
2. Корпенко E.B., Прыстай M.B., Макитра Р.Г., Пальчикова Е.Я. Оптимизация процесса экстракции биосурфактантов, синтезированных бактериями рода Phodo-coccus// Жур. орган, химия. 2011. Т. 2. С. 124-128.
3. Комлева Е.В., Шараева А.А., Петухова Н.И. Выделение и исследование свойств низкомолекулярного сурфактанта бактерий Serratia sp. НС-PI // Башкир, хим. жур. 2009. Т.16. №4. С. 65-67.
4. Anandaraj В., Thivakaran P. Isolation and production of biosurfactant producing organisms from oil spilled soil// Biosci.Tech. 2010.Vol.l. №3. P. 120-126.
5. Christova N., Tuleva В., Lalchev Z., Jordanova A., Jordanov B. Rhamnolipid biosurfactants produced by renibacterium salmoninarum 27 BN during growth on n-hexadecane // Zeitschrift fuer Naturforschung. Section С Biosciences. 2004. №59. P. 70-74.
6. Maneerat S., Phetrong K. Isolation of biosurfactant - producing marine bacteria and characteristics of selected biosurfactant// SongklanakarinJ. Sci. Technol. 2007. Vol.29. №3. P. 781-790.
TYIHH
Dietzia maris U.2.1 и Dietzia maris МВЗ штамдарыньщ мунай цабьщшасыньщ бетю тартылу-ын езгертетш rçaôùieTi керсетшдь 0нд1ру1ш-штамдардан биосурфактанттарды белш алу нэти-желер1 жэне олардьщ ИК - спектрлер1 келтчрыген.Биосурфактанттардьщ сандык; цурамы спек-трофотометрл1к ад1спен аньщталды.
SUMMARY
Ability of strains Dietzia maris U.2.1 and Dietzia maris MB3 for changing of oil film surface tension was shown. The results of biosurfactants isolation and their IR - spectra were shown. Quantitative determination of biosurfactants was conducted with spectrophotometric method.
