CC BY
405
УДК 615.322:582.628:581.45].07:543
ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЛИСТЬЕВ ГРЕЦКОГО ОРЕХА КАК ИСТОЧНИКА АНТИОКСИДАНТНОГО СРЕДСТВА
© Ж.В. Дайронас , С.А. Кулешова, И.В. Пшукова
Пятигорская государственная фармацевтическая академия Росздрава, пр. Калинина, 11, Пятигорск, 357532 (Россия) e-mail: [email protected]
Приведены сведения об изучении состава листьев грецкого ореха (Juglans regia L.), произрастающего в окрестностях Кавказских Минеральных Вод, и разработке сухого экстракта на его основе. Установлено, что сухой экстракт из листьев данного растения обладает антиоксидантной активностью и относится к практически нетоксичным веществам.
Ключевые слова: орех, Juglans regia L., биологически активные соединения.
Введение
Орех грецкий (Juglans regia L.) относится к семейству ореховые (Juglandaceae). В Россию грецкий орех был ввезен более 9 в. назад из Греции. Постепенно он расселился в Крыму и стал широко культивироваться как декоративное растение на Северном Кавказе, в Закавказье, Украине, Молдове.
Медицинское применение грецкого ореха как древней культуры имеет давнюю историю, причем использовали все части растения: плоды, зеленые околоплодники, листья, кору ветвей и корней. Листья ореха употребляли в виде настоев и отваров при лечении гнойных и грибковых поражений кожи, легочных и других форм туберкулеза, сахарного диабета, при заболеваниях слизистой рта и горла, малокровии, авитаминозе и др. [1].
Химический состав листьев ореха грецкого хорошо изучен и представлен различными классами соединений, обладающих гидрофильными свойствами: витаминами С, РР, дубильными веществами (производные пирогаллола), флавоноидами (югланин, авикулярин, гиперозид, 3-арабинозид кверцетина, 3-арабинозид кемпферола) [1, 2].
Экспериментально установлено, что флавоноиды из листьев в опытах на животных оказывают гипотензивное, спазмолитическое и противовоспалительное действие [3].
В России листья ореха грецкого находят применение только в народной медицине, а при использовании в гомеопатической практике делается ссылка на нормативные документы зарубежных стран. Сотрудниками ВИЛАР разработана настойка гомеопатическая матричная из высушенных и свежих листьев ореха грецкого, стандартизацию которой предлагается вести по содержанию дубильных веществ (в пересчете на галловую кислоту), флавоноидов (в пересчете на гиперозид), нафтохинонов (в пересчете на юглон) [4].
Цели работы - фитохимическое изучение листьев ореха грецкого на содержание различных классов биологически активных соединений (БАС) и оценка токсико-фармакологических свойств спиртового экстракта.
Экспериментальная часть
В качестве исходного сырья использовали листья ореха грецкого, заготовленные в окрестностях Кавказских Минеральных Вод, в июне, когда они еще не достигли окончательного развития и обладали бальзамическим запахом. При заготовке сырья отделяли простые листочки от центрального черешка.
Для изучения состава фенольных соединений использовали хроматографический метод. 5,0 г измельченных до размера частиц 1-2 мм сухих листьев ореха грецкого экстрагировали спиртом этиловым 70% до полного истощения сырья. Объединенные извлечения упаривали под вакуумом до водного остатка, охлаждали, фильтровали. Фильтрат использовали для жидкостной экстракции органическими растворителями: этилаце-
* Автор, с которым следует вести переписку.
татом и бутанолом-1. Водный остаток спиртоводных извлечений переносили в делительную воронку и взбалтывали с равными объемами хлороформа. После разделения слоев органический растворитель отделяли. Указанную процедуру проводили 7-8 раз, хлороформные извлечения объединяли. После экстракции хлороформом водный остаток нагревали на водяной бане для удаления хлороформа, охлаждали и обрабатывали этилацетатом. Водный остаток, полученный экстракцией этилацетатом, нагревали на водяной бане для удаления последнего, охлаждали и обрабатывали бутанолом-1. Извлечения упаривали в вакууме до смолообразного остатка и использовали для осуществления хроматографического анализа.
Наличие флавоноидов и фенолкарбоновых кислот определяли в этилацетатных фракциях и водном остатке извлечения из листьев ореха грецкого с помощью характерных качественных реакций. Этилацетатную фракцию хроматографировали на бумаге с последующим использованием специфических реактивов для проявления фла-воноидов. Хроматограммы просматривали в УФ-свете до и после обработки хромогенными реактивами [2, 5, 6].
В водных извлечениях сырья определяли органические кислоты и аминокислоты методом тонкослойной хроматографии на пластинках «БИи/о1», а также проводили качественный анализ сапонинов, дубильных веществ, углеводов [7].
Осуществлена оценка листьев ореха грецкого на количественное содержание БАС [8-10].
Для нахождения оптимальных условий получения жидкого экстракта из листьев ореха грецкого определены коэффициенты поглощения сырья, выбраны оптимальная степень измельченности сырья и время экстракции. Нормирование качества экстракта жидкого проводили согласно требованиям ГФ XI издания по содержанию сухих веществ, тяжелых металлов, спирта и влаги, сумме тритерпеновых сапонинов в пересчете на урсоловую кислоту. Из экстракта жидкого путем удаления экстрагента в вакуум-сушильном шкафу при температуре 50-65 °С был получен экстракт сухой.
Таблица 1. Результаты идентификации биологически активных соединений в листьях ореха грецкого методом хроматографии
Определяемый класс БАС Система растворителей Детектирование Результат
Флавоноиды 30%-ная уксусная кислота пары аммиака, спиртовый раствор калия гидроксида, 2%о-ный мета-нольный раствор циркония хлорок-сида Свечение пятен желтого, темно-желтого, зеленого, оранжевого, буро-желтого и темно-коричневого цвета
Фенолкарбоно-вые кислоты 2%-ная уксусная кислота пары аммиака, 0,5%о-ный спиртовый раствор бромкрезолового зеленого, 1%о-ный спиртовый раствор хлорида железа (III), диазотированный п-нитроанилин Свечение пятен зеленовато-голубого цвета
Органические смесь 95%-ного спирта 0,1%-ный спиртовый раствор бром- ярко-желтые пятна
кислоты этилового и концентрированного раствора аммиака (16 : 4,5) крезолового зеленого на голубом фоне
Аминокислоты н-бутанол-муравьиная кислота-вода (4 : 1 : 1) 2%-ный спиртовый раствор нингидрина сине-фиолетовые и краснофиолетовые пятна
Таблица 2. Количественное содержание биологически активных соединений в листьях ореха грецкого
Класс БАС Найдено в среднем, Х, % Метод количественного определения Метрологические характеристики
Б Бх Дх 8%
Флавоноиды 1,73 Дифференциальная 0,0276 0,0113 0,0289 1,67
(на кверцетин) спектрофотометрия
Органические 3,44 Титриметрия 0,0283 0,0115 0,0297 0,86
кислоты (на яблочную кислоту)
Аскорбиновая 0,33 Титриметрия 0,0041 0,0017 0,0043 1,30
кислота
Дубильные 3,81 Титриметрия 0,0344 0,0141 0,0361 0,95
вещества
Полисахариды 1,67 Гравиметрия 0,0105 0,0043 0,0110 0,66
Сапонины 4,7 Спектрофотометрия 0,0579 0,0236 0,0607 1,29
(на урсоловую кислоту)
Изучение некоторых фармакологических свойств сухого экстракта листьев ореха грецкого. Эксперименты проводили in vivo на белых мышах и in vitro по стандартным методикам [11, 12, 13]. Изучали острую токсичность и антиоксидантную активность сухого экстракта листьев ореха грецкого.
Острую токсичность изучали методом Кёрбера. За состоянием мышей наблюдали в течение двух недель [12]. Выживаемость животных отражена в таблице 3.
Таким образом, изучаемый сухой экстракт листьев ореха грецкого является безопасным средством и может быть отнесен к 4-му классу токсичности.
Антиоксидантную активность (АОА) сухого экстракта листьев ореха грецкого изучали методом, основанным на способности полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) образовывать под влиянием кислорода воздуха продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ), которые в реакции с тиобарбитуровой кислотой дают красное окрашивание. АОА оценивали в процентах по степени окраски по отношению к контролю. Препаратом сравнения служил дибунол.
Опыты на in vitro показали, что сухой экстракт листьев ореха грецкого в дозе 50 мг/л снижает количество продуктов ПОЛ в инкубационной смеси на 27,6%, в дозе 200 мг/л - на 60,8% в сравнении с контролем (табл. 4). Увеличение дозы экстракта (400 мг/л и более) не приводит к дальнейшему снижению окраски. По отношению к дибунолу сухой экстракт листьев ореха грецкого в дозах 200, 400 мг/л достоверно уменьшает образование продуктов ПОЛ на 21,6%.
Таким образом, сухой экстракт листьев ореха грецкого обладает антиоксидантным действием.
Таблица 3. Определение ЬБ50 сухого экстракта листьев ореха грецкого (п=6)
Доза, мг/кг 5000 5500 6000 6500 7000
Выжило 6 5 3 1 0
Погибло 0 1 3 5 6
Z 1 2 2 1
D 500 500 500 500
DZ 500 1000 1000 500
LD50 = LD100-XDZ/n= 7000-3000/6 = 6500 мг/кг.
Таблица 4. Изучение антиоксидантной активности сухого экстракта листьев ореха грецкого
Исследуемый объект Экстинкция, X (532 нм) Д % к контролю Д % к дибунолу
Контроль (вода) 0,250±0,001 - -
Сухой экстракт листьев ореха грецкого 50 мг/л 200 мг/л 400 мг/л 0,181±0,001*# 0,098±0,001*# 0,098±0,001*# -27,6 -60,8 -60,8 +44,8 -21,6 -21,6
Дибунол 350 мг/л 0,125±0,001* -50,0 -
Примечание: * изменения достоверны по отношению к контролю, р<0,001; # изменения достоверны по отношению к дибунолу, р<0,001.
Обсуждение результатов
В результате проведённых исследований установлено, что листья грецкого ореха (Juglans regia L.), произрастающего на Северном Кавказе, содержат фенольные соединения: флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества. Хроматографически доказано наличие в листьях растения не менее 5 флаво-ноидов (с достоверными образцами идентифицированы кверцетин, кемпферол, гиперозид), 3-фенол-карбоновых кислот (с достоверными образцами идентифицированы кофейная, галловая).
Установлено, что листья грецкого ореха также содержат органические кислоты (лимонную, янтарную, яблочную, аскорбиновую), полисахариды и сапонины.
Наибольший выход экстрактивных веществ из листьев наблюдается при использовании 50%-ного этилового спирта (32,7%), при показателях влажности сырья 10,5%, общей золы - 10,3%, золы, нерастворимой в 10%-ной HCl, - 0,86%.
Полученный нами сухой экстракт представляет собой порошок темно-коричневого цвета, вкус вяжущий, содержание влаги - 2,9%, тритерпеновых сапонинов - 11,2%. Содержание тяжелых металлов соответствует требованиям ГФ XI.
Сухой экстракт из листьев ореха грецкого относится к веществам 4-го класса токсичности, т.е. является практически безопасным для человека средством. Фармакологические исследования показали, что изучаемый экстракт обладает выраженной антиоксидантной активностью.
Выводы
1. Проведен фитохимический анализ листьев ореха грецкого, выявлено содержание основных БАС.
2. На основе предлагаемого сырья разработан сухой экстракт, обладающий антиоксидантной активностью и являющийся безопасным лекарственным средством.
Список литературы
1. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Magnoliaceae-Limoniaceae. Л., 1984. 460 с.
2. Бандюкова В.А., Оганесян Э.Т., Лисевецкая Л.И., Сидельникова В.И., Шинкаренко А.Л. Некоторые итоги изучения химического состава растений Северного Кавказа // Фенольные соединения и их биологические функции. М., 1968. С. 95-100.
3. Шинкаренко А.Л., Соколов С.Д., Дороднева В.И. Химическое и фармакологическое изучение флавоноидных комплексов из листьев грецкого и черного ореха // Вопросы курортологии, фармации, фармакологии. Пятигорск, 1967. С. 365-366.
4. Еникеева Р.А. Исследование по фармакогностическому изучению и стандартизации сырья и препаратов ореха грецкого (Juglans regia L.): автореф. дис. ... канд. фармац. наук. М., 2008. 21 с.
5. Бандюкова В.А., Шинкаренко А.Л., Казаков А.Л. Методы исследования природных флавоноидов. Пятигорск, 1977. 72 с.
6. Бандюкова В.А. Фенолокислоты растений, их эфиры и гликозиды // Химия природных соединений. 1983. №3. С. 263-273.
7. Химический анализ лекарственных растений / под ред. Н.И. Гринкевич, Л.Н. Сафронович. М., 1983. 176 с.
8. Горбунова Т.А., Даргаева Т.Д. Стандартизация сухого сока каланхоэ // Ресурсоведческое и фитохимическое изучение лекарственной флоры СССР. М., 1991. С. 190-195.
9. Беликов В.В., Шрайбер М.С. Методы анализа флавоноидных соединений // Фармация. 1970. №1. С. 68-72.
10. Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. 11-е изд. М., 1989. Вып. 2. 400 с.
11. Благородов С.Г., Шепелев А.П., Дмитриевская Н.А., Черновская Л.Н., Коблик А.В., Суздалев К.Ф., Холодова Н.В., Кузнецов Е.В., Брень Ш.В., Цхададзе К.А., Брень В.А. Методика определения антиокислительной активности химических соединений // Химико-фармацевтический журнал. 1987. №3. С. 292-294.
12. Сернов Л.Н., Гацура В.В. Элементы экспериментальной фармакологии. М., 2000. 352 с.
13. Фисенко В.П. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М., 2000. С. 114-119.
Поступило в редакцию 18 июня 2009 г.
