CC BY
30
УДК 578.832.1:578.4
Ключевые слова: грипп А, изолят, гемагглютинин, филогенетика
Key words: influenza A, isolate, hemagglutinin, phylogenetics
Касымбеков Е. Т., Карамендин К. О., Кыдырманов А. И., Хан Е. Я., Асанова С. Е., Даулбаева К. Д., Жуматов К. Х., Саятов М. Х.
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВИРУСА ГРИППА A(H13N6), ВЫДЕЛЕННОГО ОТ КУДРЯВОГО ПЕЛИКАНА (PELECANUS CRISPUS) В РЕГИОНЕ СЕВЕРНОГО КАСПИЯ
PHYLOGENETIC ANALYSIS OF INFLUENZA A VIRUS (H13N6) ISOLATED FROM DALMATIAN PELICAN (PELECANUS CRISPUS) IN THE NORTHERN CASPIAN REGION
РГП «Институт микробиологии и вирусологии» КН МОН РК Адрес: 050010, Республика Казахстан, г. Алматы, ул. Богенбай батыра, 103. Тел./факс: +7 (727) 291-82-47
RGE "Institute of Microbiology and Virology " SC ME&S RK Address: 050010, Republic of Kazakhstan, Almaty, Bogenbai batyr str., 103. Tel./fax: +7 (727) 291-82-47
Касымбеков Ермухаммет Торебекович, мл. научн. сотрудник
Kassymbekov Yermukhammet T., Junior Researcher Карамендин Кобей Омиртаевич, к. в. н., вед. научн. сотрудник Karamendin Kobey O., Ph.D. in Veterinary Science, Leading Researcher Кыдырманов Айдын Исагалиевич, зав. лабораторией, док. вет. наук Kydyrmanov Aidyn I., Doctor of Veterinary Medicine, Head of the Laboratory Хан Елизавета Яковлевна, мл. научн сотрудник / Khan Elizaveta Ya., Junior Researcher Асанова Сауле Естаевна, к. б. н., ст. научн. сотрудник Asanova Saule E., Ph.D. in Biology Science, Senior Researcher Даулбаева Клара Дакишевна, к. б. н., ст. научн. сотрудник Daulbayeva Klara D., Ph.D. in Biology Science, Senior Researcher Жуматов Кайнар Хамзаевич, д. б. н., проф., гл. научн. сотрудник Zhumatov Kainar Kh., Doctor of Biological Sciences, Professor, Principal Researcher Саятов Марат Хусаинович, д. б. н., проф., академик НАН РК, гл. научн. сотрудник Sayatov Marat K., Doctor of Biological Sciences, Professor, Academician of the National Academy of Sciences, Principal Researcher
Аннотация. При вирусологическом исследовании более 100 биопроб от 61 особи диких птиц, собранных на побережье Северного Каспия в 2012 г., выделено 9 гемагглютинирующих агентов (ГАА).
В реакциях торможения гемагглютинации и ингибиции нейраминидазной активности (РТГА и РИНА) с полными наборами диагностических сывороток все агенты идентифицированы как вирусы гиппа А(Н13№). В статье представлены результаты филогенетического анализа вируса гриппа A/кудрявый пеликан/Атырау/5224/12 (H13N6) по генам гемагглютинина (НА) и матриксного (М) белка. Показано, что в ходе эволюции гена гемаг-глютинина вирусов этого подтипа сформировались четыре филогенетические группы: Н13 А, В, С и D. Первая группа сформирована евразийскими вирусами, в которую входит исследуемый изолят A/кудрявый пеликан/Атырау/5224/12 (H13N6). Вторую и третью группу представляют вирусы из американского континента, выделенные в основном от птиц семейства чайковых. Четвертая группа является смешанной американо-евразийской, восходящей к референсному штамму А/чайка/Мериленд/704/1977.
В отличие от НА гена, филогенетический анализ М гена вирусов гриппа А/Н13 выявил их четкое разделение на евразийскую и североамериканскую эволюционные линии.
Summary. When virological analysis of more than 100 samples collected on the coast of the Caspian Sea from 61 wild birds in 2012, nine haemagglutinating agents were obtained. In hemagglutination and neuraminidase inhibition assays with a set of diagnostic reference sera, all agents were identified as influenza A viruses of H13N6 subtype. This article presents the results of phylogenetic analysis of the haemagglutinin and matrix genes of the influenza virus A/Dalmatian Pelican/Atyrau/5224/12 (H13N6). It has been shown that during evolutional process HA gene of H13 subtype viruses were divided into four groups. The first group is formed by Eurasian viruses, which includes the isolate A/Dalmatian Pelican/Atyrau/5224/12 (H13N6). Second and third groups are viruses of the American continent, mainly isolated from birds of Laridae family. The fourth group is a mixed American-Eurasian one, ascending to the reference strain A/Gull/Maryland/704/1977.
Unlike the HA gene, phylogenetic analysis of the M gene of influenza A/H13 viruses revealed their defined separation to Eurasian and North American evolutionary lineages.
Введение
Вирусы гриппа А классифицируются на основе антигенных свойств поверхностных гликопротеидов: НА и NA. В настоящее время от птиц более чем 136 видов изолированы и идентифицированы вирусы с 16 подтипами НА и 9 - NA в различных комбинациях: Н1Ш, И3ГО, Н5Ш и т. д. [7].
Дикие птицы, относящиеся к отрядам пластинчатоклювых (утки, гуси, лебеди) и ржанкообразных (кулики, чайки, крачки), образуют естественный резервуар вирусов гриппа А в природе, из которого может происходить трансмиссия к другим хозяевам [8]. Несмотря на широко проводимые мониторинговые исследования, роль популяций хозяев в определении генетической структуры вируса гриппа птиц остается невыясненной, как и значение многих видов диких водоплавающих птиц в экологии и эпидемиологии вируса гриппа А.
Большое видовое разнообразие птиц водных и околоводных экологических комплексов и природные места их обитания определяют регион Северного Каспия как одну из ключевых точек при изучении меж-популяционных взаимосвязей вирусов гриппа диких птиц.
С 2002 по 2011 гг. в результате эколого-вирусологических исследований в дельте р. Урал, северной и восточной частях Каспийского моря выделено 70 изолятов вируса гриппа А [4].
Целью данного исследования явилось изучение генетических взаимоотношений вируса гриппа А/кудрявый пеликан/Аты-рау/5224/12 (Н13№) по НА и М генам с другими вирусами этого подтипа.
Материалы и методы
Биологические образцы собирали стерильными ватными тампонами в криопро-бирки со средой 199, содержащей комплекс антибиотиков и бычий сывороточный альбумин в конечной концентрации 0,5 %.
Изоляцию вируса проводили путем инокуляции каждой пробы в аллантоисную полость 10-11-дневных куриных эмбрионов с последующей инкубацией при температуре 37 °С в течение 48 ч. Аллантоисную жид-
кость на наличие вируса проверяли в реакции гемагглютинации (РГА) микрометодом с использованием O,75 % суспензии куриных эритроцитов.
Выделение РНК проводили с использованием набора QIAamp Viral RNA Mini kit (Qiagen GmbH, Hilden) в соответствии с рекомендациями производителя. РНК экстрагировали из 14O мкл клинических образцов и элюировали в окончательном объеме 5O мкл.
Принадлежность гемагглютинирующих агентов ГАА к ортомиксовирусам устанавливали при помощи обратной транс-крипции-полимеразной цепной реакции с праймером к M гену вируса гриппа А при следующих параметрах: обратная транскрипция при 48 °С 45 мин., начальная 2 мин. денатурация при 95 °С и амплификация в 3O циклов, включающая денатурацию (94 °С, 3O сек.), отжиг праймеров (в градиенте температур 55 °С, 3O сек.) и удлинение цепи (72 °С, 3O сек.) с последующей окончательной элонгацией при 72 °С, 1O мин.
Электрофорез проводили в 2 % растворе агарозы (Sigma, США) в трис-ацетатном буфере при напряжении 88V (8 вольт/см) на аппарате Biostep (Великобритания).
Антигенную формулу изолятов вируса гриппа А определяли в РТГА и РИНА с использованием наборов поликлональных и моноспецифических диагностических сывороток к 16 подтипам НА и 9 подтипам NA согласно рекомендациям ВОЗ и МЭБ [9].
Для секвенирования кДНК использовали метод дидеоксисеквенирования по Сенгеру. Секвенирование ДНК проводили на автоматическом 96-капиллярном секвенаторе Genetic Analyser 373O xl, Applied Biosystems согласно инструкции.
Выравнивание секвенированных последовательностей нуклеотидов генов вирусов гриппа А с таковыми американской и евразийской линий проводили по компьютерной программе BioEdit. Филогенетический анализ и построение древ выполнены с помощью программы MEGA версии 5 методом «присоединения соседей» со значениями Bootstrap на основе 1OOO повторов.
Результаты и обсуждение
В июле 2012 г. во время гнездования и линьки на побережье северной части Каспийского моря собрана 101 биопроба (свежие пометы, трахеальные и клоакальные смывы) от 61 особи диких птиц пяти видов, относящихся к семействам РеЫсатЛле, АпаЫ^в, Laridae (табл. 1).
Как видно из таблицы, восемь ГАА изолированы от черноголовых хохотунов и один -от кудрявого пеликана.
При электрофоретическом анализе продуктов ПЦР к М гену вирусов гриппа А ожидаемые 279 пар оснований обнаружены во всех девяти пробах, что позволило отнести их к вирусу гриппа А.
В результате первичного заражения куриных эмбрионов и двух последовательных пассажей из 101 биопробы изолировано девять ГАА с титрами 1 : 64 - 1 : 2048.
Результаты РТГА показали, что гемагглю-тинирующая активность изолятов вируса гриппа подавлялась иммунными сыворотками к вирусам А/озерная чайка/Швеция/1/99 (Н13К6), А/черноголовый хохотун/Аты-рау/742/04 (Н13Ш), А/черноголовый хо-хотун/Атырау/2966/08 (Н13К6) в титрах от 1 : 16 - 1 : 32 до гомологичного. С сыворотками к вирусам подтипов Н1-Н12, Н14-Н16 получены отрицательные результаты. Полученные данные позволили отнести каспийские изоляты к вирусам гриппа А/Н13.
В РИНА ферментативная активность всех изолятов вируса гриппа А/Н13 подавлялась только иммунной сывороткой к КА подтипа N6.
Таким образом, с помощью набора диагностических иммунных сывороток в РТГА и РИНА все изоляты от диких птиц идентифицированы как Н13К6. В соответствии с номенклатурой ВОЗ они получили обозначения: А/черноголовый хохо-тун/Атырау/5191, 5199, 5203...5206, 5209, 5210/12(Н13К6), А/кудрявый пеликан/Аты-рау/5224/12 (Н13К6).
Вирус гриппа А с подтипом НА Н13 впервые изолирован в 1977 г. в Северной Америке [13]. По результатам дальнейших исследований высказано предположение о его экологической связи исключительно с чайковыми птицами [12]. Однако в 2000 г. вирус этого подтипа выделен от огарей, широконосок, чирков-свистунков в Тункинской котловине, расположенной южнее оз. Байкал (Республика Бурятия), в 2003 г. - от больших бакланов на острове Малый Жемчужный в северо-западной части акватория Каспийского море [3].
В 2002-2007 гг. в Республике Казахстан на побережье Северного и Восточного Каспия вирусы с подтипом НА Н13 изолированы от ржанкообразных (черноголовых хохотунов, серебристых чаек, чеграв); в 2008 г., помимо чайковых птиц, они изолированы от лебедя-
Таблица 1.
Характеристика биологических образцов, собранных от диких птиц в 2012 г. в казахстанской акватории Каспийского моря, и выделяемость гемагглютинирующих агентов
Отряд Семейство Вид Количество:
особей образцов ГАА
Пеликанообразные- Пеликановые - Кудрявый пеликан 14 28 1
Pelecaniformes Pelecanidae (Pelecanus crispus)
Гусеобразные - Утиные - Лебедь-шипун 17 34 0
Anseriformes anatidae (Cygnus olor)
Черноголовый хохотун 28 32 8
(larus ichthyaetus)
Ржанкообразные - Чайковые - Серебристая чайка (larus 1 5 0
Charadriiformes Laridae argentatus)
Чеграва 3 2 0
(Hydroprogne caspia)
Всего: 61 101 9
шипуна, большой поганки, кваквы, серой вороны и красноносого нырка [2].
В GenBank зарегистрированы сведения о вирусах гриппа с подтипом HA Н13, выделенных от индюка (Миннесота, 1990), уток (Сибирь, 1998.; Хоккайдо, 2012), белых гусей (Аляска, 2006) [10]. Впервые в Евразии (в казахстанской части Каспийского моря) вирус с НА-Н13 и NA-N6 выделен от кудрявого пеликана.
В водно-болотных ландшафтах РК гнездятся около 2 тысяч пар кудрявых пеликанов, занесенных в Красную книгу. Наибольшая их численность сохранилась на оз. Балхаш и в дельте р. Или. На побережье Каспия в дельте р. Урал обитает до 150 пар [1]. Птицы гнездятся как в смешанных колониях с розовым пеликаном и большим бакланом, так и самостоятельными колониями и отдельными парами.
В литературе имеются данные по изоляции вирусов гриппа А(Н3№) от розового пеликана (Pelecanus onocrotalus) в Замбии в 2006 г. и А(Н13№) от американских белых пеликанов (Pelecanus erythrorhynchos) в Миннесоте в 2007-2008 гг. [6, 11].
С целью выявления эволюционных взаимоотношений был проведен молекулярный анализ генов НА казахстанского изолята и вирусов гриппа А/Н13 из международной базы данных Genbank. Показано, что в ходе эволюции вирусов этого подтипа сформировались четыре филогенетические группы: Н13 А, В, С и D. Первая группа (Н13А) была представлена евразийскими вирусами, в которую входит и исследуемый изолят A/ кудрявый пеликан/Атырау/5224/12 (H13N6). Интересно отметить, что в этой евразийской группе оказался и изолят от американского белого пеликана [5]. Вторую и третью группу составили вирусы c американского континента, выделенные в основном от птиц семейства чайковых. Четвертая группа является смешанной американо-евразийской, восходящей к референсному штамму А/чай-ка/Мериленд/704/1977 (рис. 1).
В указанную филогенетическую группу вместе с прототипом A/gull/ Maryland/704/1977 также входят казахстанские изоляты 2002-2008 гг. [5], что свиде-
тельствует о глобальном характере переноса этих вирусов и возможности рекомбинации их генов.
Штамм A/кудрявый пеликан/Атырау/5224/12 по гену НА отличается от вирусов А/Н13, выделенных от чаек и водоплавающих птиц в дельте р. Урал (казахстанская часть Прикаспия) в 2002-2011 гг., несмотря на то, что эти виды разделяют один ареал обитания. Результаты генетической характеристики НА генов свидетельствует об одновременной циркуляции вирусов гриппа A(H13N6) двух различных генотипов в популяциях чайковых, утиных и пеликановых птиц.
Дополнительно был проведен филогенетический анализ консервативного М гена вирусов А/Н13, который выявил разделение их на евразийскую и североамериканскую эволюционные линии.
Полученные данные показывают, что американская линия состоит из вирусов, выделенных исключительно в Западном полушарии, тогда как вирусы евразийской линии филогенетически восходят к референсному штамму, циркулировавшему в США. Кроме того, эта линия включает в себя кластер вирусов американского происхождения A/shorebird/Delaware/221/2006(H13N9) и A/shorebird/Delaware/195/2006(m6N3) середины 2000-х гг. Эти данные согласуются с ранними работами о межконтинентальных обменах генами между вирусами, циркулирующими в Западном и Восточном полушариях [9].
Как видно из представленного древа на рисунке 2, по М гену вирус A/кудрявый пеликан/Атырау/5224/12 относится к евразийской линии и проявляет близкое родство с изолятами А/черноголовый хохотун/Аты-рау/2966/08 (H13N6) и А/серебристая чайка/ Атырау/2216/07 (H16N3), что указывает на их общее географическое происхождение и свидетельствует о продолжающейся эволюции вирусов А/Н13 в регионе Северного Каспия (рис. 2).
Выводы
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что в каспийском ре-
Рис. 1. Филогенетические взаимоотношения между генами НА казахстанских вирусов гриппа А/Н13 с вирусами этого подтипа из GenBank.
гионе, где сосредоточены многие миграционные потоки диких птиц, наблюдается активный генетический обмен между вирусами гриппа разных филогенетических линий.
Список литературы
1. Березовиков, Н. Н. Орнитокомплексы дельты р. Урал / Н. Н. Березовиков, А. П. Гисцов // Селевиния, 1999. - № 12. - С. 198-199.
2. Кыдырманов, А. И. Экология и эволюция вирусов гриппа А циркулирующих в популяциях диких птиц в Республике Казахстан (2002-2009 гг.) : авто-реф. ... докт. вет. наук / Кыдырманов А. И. - Алматы, 2010. - 49 с.
3. Львов, Д. К. Изоляция вирусов гриппа А от диких птиц и ондатры в западной части Восточно-Азиатского миграционного русла / Д. К. Львов, О. З. Горин, С. С. Ям-никова и др. // Вопр. вирусол. - 2001. - № 4. - С. 35-39.
4. Саятов, М. Х. Мониторинг вирусов гриппа А, экологически связанных с дикими птицами в Казахстане / М. Х. Саятов, А. И. Кыдырманов, К. Х. Жума-тов и др. // Доклады НАН РК. 2011. - № 4. - С. 42-47.
5. Ямникова, С. С. Вирусы гриппа А/Н13 и А/Н16 - различные линии одного предшественника / С. С. Ямникова, А. С. Гамбарян, В. А. Аристова и др. // Вопр. вирусол. - 2009. - № 4. - С. 10-17.
6. A revision of the system of nomenclature for influenza viruses: a WHO memorandum // Bull. WHO. -1980. - Vol. 58. - P. 585-591.
Рис. 2. Филогенетические взаимоотношения М генов казахстанских вирусов гриппа А/Н13 с вирусами этого подтипа из GenBank.
7. Fouchier, R. M. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls / R. M. Fouchier, V Munster, A. Wallensten et al. // J. Virol. - 2005. - Vol. 79. -№ 5. - P. 2814-2822.
8. Hinshaw, V. S. Antigenic and genetic characterization of a novel hemagglutinin subtype of influenza A viruses from gulls / V S. Hinshaw, G. M. Air, P. Gibbs et al. // J. Virol. - 1982. - Vol. 42. - P. 865-872.
9. Karamendin, K. Phylogenetic analysis of avian influenza viruses of H11 subtype isolated in Kazakhstan / K. Karamendin, A. Kydyrmanov, K. Zhumatov, S. Asanova, N. Ishmukhametova, M. Sayatov. - Virus Genes. - 04/2011. - 43 (1). - P. 46-54.
10. Lebarbenchon, C. Influenza A Viruses in American White Pelican (Pelecanus erythrorhynchos) / C. Lebar-
benchon, S. Sreevatsan, M. A. Ramakrishnan, et al. // J. Wildlife Diseas. - 2010. - Vol. 46 (4). - P. 1284-1289.
11. Olsen, B. Global patterns of influenza A virus in wild birds / B. Olsen, V. J. Munster, A. Wallensten et al. // Science. - 2006. - Vol. 312. - P. 384-388.
12. Simulundu, E. Characterization of H3N6 avian influenza virus isolated from a wild white pelican in Zambia / E. Simulundu, A. S. Mweene, D. Tomabechi, B. M. Hang'ombe, A. Ishii, Y. Suzuki, I. Nakamura, H. Sawa, C. Sugimoto, K. Ito, H. Kida, L. Saiwana, A. akada // Arch. Virol. - 2009. - Vol. 154. - P. 1 5171522. DOI: 10.1007/s00705-009-0467-9.
13. Taxonomy Browser [Электронный ресурс]. -http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/ wwwtax. cgi?mode=Undef&id= 11320&lvl=3 &keep= 1&s rchmode=1&unlock - visited on 26.04.2013.
Новостная рассылка Института Ветеринарной Биологии: www.subscribe.ru/catalog/home.pets.invetbio
