CC BY
25
УДК 578.832.1:575.113.12:578.52
Ключевые слова: грипп птиц, гемагглютинин, секвенирование, морфология
Key words: avian influenza, hemagglutinin, sequencing, morphology
Абдураимов Е. О., Сандыбаев Н. Т., Зайцев В. Л., Кыдырбаев Ж. К., Кыдырманов А. И., Ишмухаметова Н. Г. , Саятов М. Х.
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ШТАММА А/ГОЛУБАЯ ЧЕРНЕТь/АКТАУ/1455/06 (Н4Ш) ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ И СЕКВЕНИРОВАНИЕ ЕГО ГЕНА ГЕМАГГЛюТИНИНА
MOLECULAR AND BIOLOGICAL CHARACTERIZATION OF INFLUENZA VIRUS, STRAIN A/DUNBIRD/AKTA U/1455/06 (H4N6), AND SEQUENCING OF ITS HEMAGGLUTININ GENE
ДГП «Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности» (НИИПББ) НЦБ РК КН
МОН РК1, п. г. т. Гвардейский, Республика Казахстан
DGE «Research Institute for Biological Safety Problems» of the RK NBC/SC ME&S RK1, Gvardeiskiy,
Republic of Kazakhstan
ДГП «Институт микробиологии и вирусологии» РГП ЦБИ МОН РК2, г. Алма-Ата, Казахстан
DGE «Institute of Microbiology and Virology» RGE BRC ME&S RK2, Almaty, Republic of Kazakhstan Абдураимов Ергали Орынбасарович, заведующий лабораторией1, канд. вет. наук. Тел./факс: +7 727 273-10-69 Abduraimov Yergali O., Head of Laboratory1, Ph.D. in Veterinary Science. Tel./fax: +7 72 7 2 73-10-69 Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич, зам. директора по НИР1, канд. биол. наук. Тел./факс: +7 727 273-10-69 Sandybayev Nurlan T.; Deputy Director in Research1, Ph.D. in Biological Science. Tel./fax: +7 727 273-10-69 Зайцев Валентин Лукъянович, вед. науч. сотрудник1, канд. биол. наук. Тел./факс: +7 727 273-10-69 Zaitsev Valentin L., Leading Researcher1, Ph.D. in Biological Science. Tel./fax: +7 72 7 2 73-10-69 Кыдырбаев Жайлаубай Кыдырбаевич, зав. лабораторией1, канд. вет. наук, доцент. Тел./факс: +7 727 273-10-69 Kydyrbayev Zhailaubay K., Head of Laboratory1, Ph.D. in Veterinary Science, Associate Professor. Tel./fax: +7 727 273-10-69 Кыдырманов Айдын Исагалиевич, вед. науч. сотрудник2, канд. биол. наук. Тел./факс: +7 727 291-82-47
Kydyrmanov Aidyn I., Leading Researcher2, Ph.D. in Biological Science. Tel./fax: +7 72 7 291-82-47 Ишмухаметова Наиля Галивеевна, ст. науч. сотрудник2, канд. биол. наук. Тел./факс: +7 727 291-82-47 Ishmukhametova Nailya G., Senior Researched, Ph.D. in Biological Science. Tel./fax: +7 727 291-82-47 Саятов Марат Хусаинович, гл. науч. сотрудник2, докт. биол. наук, проф., академик НАН РК. Тел./факс: +7 727 291-82-47 Sayatov Marat K., Chief Researcher2, Doctor of Biological Science, Professor, Member of RK National Academy
of Sciences. Tel./fax: +7 727 291-82-47
Аннотация. Представлены результаты определения молекулярно-биологических характеристик, секвенирования гена гемагглютинина и сравнительного анализа с международной базой данных вируса гриппа А/голубая чер-неть/Актау/1455/06 (Н4Ш).
Summary. Results of molecular and biological characterization of the avian influenza virus strain A/dunbird/Aktau/1455/06 (H4N6) as well as of sequencing its hemagglutinin gene and comparative analysis of the obtained data with the world database are presented.
Введение
Вирусы гриппа типа А являются возбудителями наиболее массовой вирусной инфекции, поражающей огромные контингенты людей по всему миру. Помимо эпидемической значимости, другой их характерной особенностью является способность инфицировать широкий круг млекопитающих (свиньи, лошади, киты, тюлени, ондатры) и птиц [8, 11, 12, 7].
Столь высокий потенциал вируса гриппа связан с его быстрой эволюцией, обусловленной наличием сегментированной однонитчатой минус информационной РНК.
Сегментированный геном является основой для реассортации генов при смешанных инфекциях, в ходе которых возникает возможность появления новых вариантов вирусов [9]. На сегодняшний день получено много данных о структуре вируса гриппа, его генетической изменчивости, способах экспрессии и репликации генов и взаимодействия с иммунной системой хозяина. Тем не менее, происхождение пандемических вариантов до сих пор остается неясным. Характерная «многохозяинность» возбудителей гриппа, т. е. способность репродуцироваться в организме различных видов млекопитающих
и птиц, а также возможность их межвидового переноса представляются ключевым моментом этого процесса [4].
Последние экологические и филогенетические исследования выявили видоспеци-фические линии вирусных генов и показали, что именно птичий резервуар содержит большинство возможных комбинаций генов вируса гриппа, но только некоторые из них могут циркулировать среди млекопитающих, особенно в человеческой популяции [10].
В литературе имеются отдельные сведения об инфицированности вирусами гриппа диких птиц в Казахстане [5, 6, 1, 3, 2]. Из большого числа известных науке серова-риантов вируса гриппа в республике от птиц были выделены только штаммы с подтипами HA - H1, Н5, H7, H10, Н11 и H13 и NA - N1, N5, N6 и N9.
В этой связи проведение исследований по изучению молекулярно-биологических характеристик и определение структуры гена гемагглютинина изолята вируса гриппа А/голубая чернеть/Актау/1455/06 (H4N6), выделенного в Казахстане в 2006 году, представляет научный интерес.
Материалы и методы
Вирус нарабатывали в развивающихся куриных эмбрионах по стандартной методике. Интравенозный индекс патогенности (ИВИП) вируса определяли на 42-суточных цыплятах внутривенным инфицированием в разведении 10-1 в объеме 0,1 см3.
Для очистки и концентрирования вируса гриппа А/голубая чернеть/Актау/1455/06 (H4N6) использовали метод, включающий этапы ультрацентрифугирования и центрифугирования в ступенчатом градиенте сахарозы. Электронно-микроскопические исследования вирионов проводили методом негативного контрастирования.
Геномную РНК выделяли из очищенных препаратов вируса, используя набор QIAamp Viral RNA Mini Kit, Qiagen. Постановку по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) для наработки секвенированных фрагментов проводили набором One-Step RT-PCR Kit, Qiagen.
Постановку электрофореза белков, подготовку проб и разделение полипептидов
проводили в градиенте 5-20 % ПААГ по стандартной методике. Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия проводили в течение 12-15 часов, а гели окрашивали красителем Coomassie brilliant blue R-250.
Для определения нуклеотидной последовательности гена НА использовали набор перекрывающихся праймеров. Нуклеотидную последовательность гена НА определяли методом прямого секвенирования амплифици-рованных фрагментов с помощью набора Big Dye Terminator version 3.1 на автоматическом секвенаторе ABI 3130x1, Applied Biosystems. Сборку секвенированных фрагментов ДНК проводили программой Sequencher 4.5. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с использованием пакетов программ Vector NTI Suite 10, BioEdit, а также on-line программой BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
Результаты и обсуждение
Исследование показало, что вирус гриппа А/голубая чернеть/Актау/1455/06 (H4N6) обладает высокими репродуктивными свойствами при инкубировании в куриных эмбрионах: накопление вируса составило 7,76 lg ЭИД50/см3. Определение индекса ин-травенозной патогенности показало, что штамм относится к непатогенному типу (ИВИП = 0).
Электронно-микроскопическим методом на фотонегативах определяли размеры ви-рионов, при этом рассчитывали среднюю арифметическую величину и среднее квадратичное отклонение (табл. 1). На основе по-
Размер вирионов, им
Рис. 1. Гистограмма распределения вирионов округлой формы по размерам в популяции штамма А/голубая чернеть/Актау/1455/06 (Н4Ж) вируса гриппа птиц.
Таблица 1.
Результаты статистического анализа размеров вирионов вируса гриппа птиц
Вирус гриппа птиц Количество анализированных вирионов Средняя арифметическая величина, нм Среднее квадратичное отклонение
А/голубая чернеть/ Актау/1455/06 (Н4Ш) 595 134,33 1,27
Таблица 2.
Формы и размеры вирусных частиц
Вирус гриппа птиц Формы вирусных частиц
Округлые Удлиненные, червеобразные Грушевидные Дефектные
% размер, нм % размер, нм % размер, нм %
А/голубая чернеть/ Актау/1455/06 (Н4Ш) 90,7 100-200 7,3 длина 200-450 ширина 100-125 1,0 350-450 1,0
Таблица 3.
Количественное содержание и молекулярные массы белков вируса гриппа птиц
Полосы Молекулярная масса, кДа
Маркер стандартных масс А/голубая чернеть/Актау/1455/06 (Н4Ж)
1 97,40 83,148
2 55,40 79,714
3 36,50 73,264
4 20,10 57,483
5 53,067
6 49,538
7 44,106
8 37,941
9 26,818
10 22,201
лученных данных строили гистограммы распределения вирионов по размерам (рис. 1).
При определении в популяции штамма однородных групп вирусных частиц были получены результаты, представленные в таблице 2. Электронная микрофотография ви-рионов показана на рисунке 2.
В результате электронно-микроскопических исследований вируса гриппа птиц А/голубая чернеть/Актау/1455/06 (Н4Ш) установлены морфологические признаки ви-рионов, среди которых преобладают вирусные частицы округлой формы. Внешняя оболочка (мембрана) выглядит как осветленная зона. На поверхности четко видны проекции гемагглютинина. Размер удлиненных вирионов приблизительно в 2-2,5 раза больше
Рис. 2. Электронная микрофотография очищенного и концентрированного препарата вируса гриппа птиц А/голубая чернеть/Актау/1455/06 (Н4Ы6). Ув. х100000.
размера округлых. Длина их достигает 200450 нм. Затем ставили электрофорез для определения количества и молекулярной массы полипептидов. Анализ электрофореграмм
проводили с использованием компьютерной программы «LabWork» (табл. 3).
С целью амплификации фрагментов кДНК гена гемагглютинина вируса гриппа птиц конструировали сегментспецифические прай-меры, их дизайн осуществляли при помощи компьютерных программ, основными из которых являются Oligo 6 и Vector NTI Suite 9. В результате проведенных исследований по подбору сегментспецифических праймеров на сегмент гемагглютинина были сконструированы две пары праймеров (табл. 4).
Для наработки ПЦР продуктов использовали одношаговый обратно-транскриптазный ПЦР набор, позволяющий в один этап нарабатывать специфические ПЦР продукты. Амплификацию ПЦР продуктов проводили при следующих температурно-временных режимах: 50 °С - 30 мин.
94 °С - 2 мин.
94 °С - 20 сек. ] 56 °С - 30 сек. } 30 циклов 72 °С - 4 мин. ) 72 °С - 7 мин.
> afclEFtull 495.1 I Influenza A Vitus (4/duck/SouKh Africa/123 ЗА/20(34 (Н4НВ | ) а г.jus пс 4 hemagglutinin (НА) gene, partial cds Lenijth-1631
Score = 621 bits (336),, Expect » 6e-175 Identities = 363/376 £S»e ), Gaps = 2/376 (04) 3trand=Plus/Plus
accctg-t-gatatgcatgggacatcatgctgtc-gccaatgggactatggtaaagaccct 97 1 I I II I I ] I I i I H I [ I 1 I I I И I I Ш M I I l Ш II I I I I H I I I t I I I I I H II ACCCTGCTGGATATG CATGGGACATCATGrTGTGGC С AAT GGGACTATG GT AAA G А ГТСТ 61
CACTGATGATCAAGTGGAAGTGGTCACTGCACAAGAACTGGTGGAATCACAGAACCTCCC 157 I I 1 II II I I II 1 I 1 I I I 1 I I I ! I I I I I II I I I I I I I I! ! I I I I I I I I N I I I I I ¡1 I II CACTGATGATC AAGTGGAAGTGGTCACTGCACAAGAACTAGTGGAATCAC AGAACCTTCC 121
cgaactatgctcgagtcctctaaGactagtcgatggtcagacctgtgacatcatcaatgc. гп
IIIIIIIMI НИИ! I II II I I И I I I I I I I I I I I 1 I 1 I И l МИШИН GGAACTATGCCCGAGTCCCCTAAGACTAGTCGATCGCCAGAcrTCTGATATCATCAATGC. 181
AGCCTTAGGAA GC-CC AGGATGTOAC С GTTTGAAT GGTG CTG AATGGG AC АТПТС ATAGA 277 I I I II И I I H I I I I I I I I M I I I I ! I I I H I I I И I I II И I I ! И I I II 11 I I II I I AGCCTTA GGAAGC С СAG GATGTGAC CA7TTGAATOGTGITTGAATGGGACATTTTC ATA G A 241
AAGGC С С AATGC AGTGGAC AC'TGCTATC С ATTC GATGTGC С AGACTATC AKAGC CTGAG 337 ! I I t I И I I И И И I I I I И I I I И I I I И I I ¡ПИНИИ I | И f I И I II II AAGGC С С AAT С CAGTGGACAC TTGCTATC С ATTTGATGTGC С AGATTATC A&AGC CTAAG 301
GAC-C ATACTTGC С AAC AATGGG AAATTC GAATTC ATTGCTGAAG AATTC С AATC.GAGC AC 397
i и i и ii i и i и и 1111111 и m 1111! i ttii< 11 и и i m и i и и 1111
GAGC ATACTTG С С AAC AATGG G AAATTC G AATTC АТТ GC TGAAGAATTC С AATGGAGC А С 361
С GTGAA GC AAAATGGT 413 И Ш I И I II И Ш С GTGAA GC AAAATGGT 377
Query 40
Sbjct 2
Oue су 90
Sbjct 62
Ouery 156
Sbjct 122
Query 218
Sbjct 182
Ouery 270
Sbjet 242
Query 336
Sbjct 302
Query 398
Sbjct 362
> аы ¡р^рэаг. 1i FLAHAH4U? precursor, complete cd» Length 1695
Influenza A virus (А/1>иск/Czechoslovakia/So(H-WsJ) gene Eor hemagglutinin
Score - 542 bits (293), Expect = be-151 Identities <= 376/416 ¡90*), Gaps - 6/416 (14) Str and-Plus/Plus
TCTGCTTGTTG С AGAGA GCTCTT ГТС - AAA CTAC AC AG G - AAC CCTGTG AT ATG С ATGG G I Ii1 I I I И I I И I И I I I I I И I I И И I II I I I I II I I I t I I I И I I I I I I TCTGCTC ATAGC AGAGAACTCTTCC С AAAACT AC AC AGGAAAC С CTGTGATATGC AT GGG
Query 1
Sbjct 24
Query 59
SbJCC 34
Ouery lis
Sbjct 143
Query 17?
Sbjct 202
Query 237
Sb3ct 262
Quecy 297
Sbjet 322
Query 357
3b]ct 392
S3
ACATCATGCTGTGGCCAATGGGACTATGJTAAAGACCCTC A-CTGATGATC AAGTGGAAG 117 П II I И И I И I И I I II I 111! I I II I I I И I I IHI I I И I II I II I II I II II ACATC ATGCTGTGGC С AAT GGGACTATGGTAAA GACCCT-A C'C С CATC АТС AAGTGGAAG 142
TGGTC ACTGC AC AAGAACTGGTGG AATC A CAGAA С CTC С С GGAA С TATGCTC - GAGTC CT 176
и 111 и и 11 и и и и и i |П 1111 и 11 и 11 и i s 1111 и in hi
TGGTC ACTGC AC A GGAACTGGTA G AATC AC AAAATCTC С С GGAACTATG -ТСС GAG С С CT 201
CTAAGACTASTC GATGGTCAGA CCTGTG AC AT С АТС AAT 0 GA G С CTTAG GAAGCCCAGGA 236
II I I I I I I I I II II И I И I I I 11 I HII I I III I I 111 II II I I I И I И CTGAGACTAGTTGACGGC CAGAC CTGTGATATCATCAATGGAGCATTGGGGAGCCCAGGG 261
TGTGACC GTTTGAATG GTGCTGAATG D C.ACATTTTi: ATftGAAAGG CCCAATGCAGTGGAC 296
III INI I H I II II I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I II.....IHI III
tgtgaccatttgaatggtgcagaatgggacgttttcatagagaggcccaatgcagtagac 321
acttgctatccattcgatgtgccagactatcagagcctgaggagcatacttgccaacaat sss
111 I ! I I И I I I I I 111 III HI И II I И I I I II II I I И I I 11 И I И I П I ACTTG СТАТС С ATTTGATGTGC CAGAGTAC С AG AGTCTG AGAAGC АТАСТС GCC AAC AAT 381
gggaaattcoaattcattgctgaagaattccaatggascaccgtgaagсaaaatgg 412 и I I I 111 I И I I I 1 I I I I I I I I I II I I И I И II 1 It! 1 I I I I И I I 1 I I 11 GGGAAATTC GAATTC ATTGC С G AAGAATTC С AATGGAAC AC GG TGAA GC AAAATGG 437
Рис. 3. Сравнительный анализ секвенированного гемагглютинина вируса гриппа птиц штамма А/голубая чернеть/ Актау/1455/06 (Н4Ж) в международной базе данных.
Таблица 4.
Характеристики сегментспецифических праймеров на ген гемагглютинина
№ Последовательность (5'-3') позиция на геноме T , °С m' T, °С a7 GC, % ПЦР продукт
1 AA AAT AGT GCT TCT TCT TGC 7 60,1 51,5 35,0 898
TTA TCG CCC CTA TTG GAG TT 885 66,9 45,0
2 TCA AGA AAG GGG ACT CAA CA 818 66,7 53,7 45,0 826
ATG ATT GCC AGT GCT AGG 1625 66,7 52,6
Предварительные данные секвенирования подвергали компьютерной обработке (программа Sequencher 4.0) с целью удаления ошибочных последовательностей и заполнения образовавшихся брешей. Результаты секвенирования позволили определить ну-клеотидную последовательность гена ге-магглютинина вируса гриппа птиц штамма А/голубая чернеть/Актау/1455/06 (H4N6). Дальнейший анализ секвенированного сегмента гемагглютинина проводили on-line программой BLAST на сайте National Center for Biotechnology Information (http://www. ncbi.nlm.nih.gov) с целью определения наиболее близкородственных штаммов вирусов по исследуемому гену (рис. 3).
Анализ результатов показал, что нуклео-тидная последовательность гена гемаг-
глютинина на 96 % идентична фрагменту гена гемагглютинина штамма A/Duck/South Africa/1233A/2004 (H4N8) и на 90 % - фрагменту гена гемагглютинина штамма A/Duck/ Czechoslovakia/56 (H4N6). Филогенетический анализ последовательности гена гемаг-глютинина представлен на рисунке 4.
Филогенетический анализ последовательности гена гемагглютинина вируса гриппа птиц штамма А/голубая чернеть/ Актау/1455/06 (H4N6) показал, что исследуемый штамм с антигенной формулой Н4 выделяется отдельной ветвью. Наиболее близко располагаются группы штаммов, представителями которых являются A/duck/South Africa/1233A/2004 (H4N8), A/teal/Germany/wv153k/01-1, A/duck/
Czecho-slovakia/56 (H4N6).
Рис. 4. Филогенетический анализ последовательности гена гемагглютинина вируса гриппа птиц штамма А/голубая чернеть/Актау/1455/06 (Н4Ш).
Выводы
Проведенные исследования показали, что вирус гриппа А/голубая чернеть/ Актау/1455/06 (H4N6) обладает высокими репродуктивными свойствами при инкубировании в куриных эмбрионах. Определение индекса интравенозной патогенности показало, что штамм относится к непатогенному типу (ИВИП = 0). Результаты электронно-микроскопических исследований позволили установить морфологические признаки вири-онов. Определены молекулярные массы белков и их количественное содержание, установлена оптимальная схема выделения РНК. Сконструированы сегментспецифические праймеры и амплифицированы фрагменты кДНК, определен электрофоретический профиль амплифицированных сегментов. Анализ нуклеотидной последовательности гена гемагглютинина вируса гриппа А/голубая чернеть/Актау/1455/06 (H4N6) показал 96 % идентичность фрагменту гена гемагглютини-на штамма A/Duck/South Africa/1233A/2004 (H4N8) и 90 % идентичность фрагменту гена гемагглютинина штамма A/Duck/ Czechoslovakia/56 (H4N6).
Список литературы
1. Даулбаева, К. Д. Характеристика вирусов гриппа А, выделенных от домашних уток в Казахской ССР / К. Д. Даулбаева, Т. Б. Шайхинова, С. С. Ямникова, М. Х. Саятов и др. // Известия АН КазССР. Серия биология. - 1990. - № 1. - С. 60-64.
2. Ишмухаметова, Н. Г. Изучение биологических свойств и антигенных взаимосвязей казахстанских штаммов вируса гриппа А с гемагглютинином Н13 / Н. Г. Ишмухаметова, С. Е. Асанова, А. И. Кыдырма-нов // Известия МОН РК. Серия биология и медицина. - 2004. - № 4. - С. 60-68.
3. Кыдырманов, А. И. Изоляция вируса гриппа А от чайковых птиц в Казахстанском секторе Каспийского моря / А. И. Кыдырманов, С. Е. Асанова, Н. Г. Ишмухаметова // Мат. II Междунар. Вет. Конгресса «Исследования и результаты» : внеоч. выпуск Вестника Казахского Нац. Аграр. Ун-та. - 2003. -С. 73-76.
4. Львов, Д. К. Грипп остается непредсказуемой инфекцией / Д. К. Львов, А. Н. Слепушкин, С. С. Ямникова, Е. И. Бурцева // Вопр. вирусол. - 1998. -№ 2. - С. 141-144.
5. Саятов, М. Х. Циркуляция вирусов гриппа А среди перелетных птиц на юге и юго-востоке Казахстана / М. Х. Саятов, Р. У Бейсембаева, К. Д. Даулбаева / Мат. III объед. съезда гиг., эпидемиол., микробиол. и инфекц. Казахстана : тез. докл. - Алма-Ата, 1980. -т. III. - С. 138.
6. Саятов, М. Х. Изучение вирусов гриппа, выделенных от диких птиц / М. Х. Саятов, Р. У Бейсембаева, Д. К. Львов // Вопр. вирусол. - 1981. - № 4. -
C. 466-471.
7. Banks, J. Characterization of an avian influenza A virus isolated from a human - Is an intermediate host necessary for the emergence of pandemic influenza viruses? / J. Banks, E. Speidel, D. J. Alexander // Arch Virol. - 1998. - V 143. - No. 4. - P. 781-787.
8. Easterday, B. C. Diseases of Poultry. 22. Influenza / B. C. Easterday, V. S. Hinshaw, D. A. Halvorson / Eds.
D.W. Calnek et al. - 1997. - P. 583-605.
9. Ito, T. Molecular basis for the generation in pigs of influenza A virus with pandemic potential / T. Ito, J. N. Couceiro, S. Kelm // J. Virol. - 1998. - V. 72. -P. 7367-7377.
10. Makarova, N. V Transmission of Eurasian avian H2 influenza virus to shorebirds in North America / N. V. Makarova, N. V Kaverin, S. Krauss // J. Gen. Virol. -1999. - V. 80. - P. 3167-3171.
11. Scholtissek, С. Molecular epidemiology of influenza / С. Scholtissek // Arch. Virol. Suppl. - 1997. -V. 13. - P. 99-103.
12. Webster, R. G. Influenza virus: transmission between species and relevance to emergence of the next human pandemic / R. G. Webster // Arch. Virol. Suppl. -1997. - V. 13. - P. 105-113.
| АРТРОГЛИКАН (ARTROGLYCAN)
§ хондропротектор нового поколения, геронтологический препарат для собак, кошек, хорей, крыс
Выпускается в форме таблеток по 0,7 г. В состав препарата входят: глюкозамина гидрохлорид (100 мг); хонроитина сульфат (200 мг); витамин Е (20 мг); селенометионин (50 мкг); органическая форма кальция (10 мг)
Показания: дегенеративные заболевания суставов и позвоночника, первичный артроз, межпозвонковый остеохондроз, остеоартрит, остеоартроз, спондилёз, остеопороз, дисплазия суставов. Для улучшения качества жизни собак, кошек, крыс и хорьков старшей возрастной группы
Заказ в Санкт-Петербурге (у производителя): ООО «Биоцентр «ЧИН», т. + 7 921 745-34-64; почтовый адрес: 197101, Санкт-Петербург, ул. Чапаева, д. 16а; bookchin@ mail.ru; сайт: www.invetbio.ru; в Москве: ООО «АС-Маркет», т. (498) 696-00-10; ООО «ЗооВетКом», т. +7 926 369-70-55; ЗАО «ВетИмпэкс», т. (495) 786-97-81, 786-97-82; ООО «ВЕТМАРКЕТ», т. (495) 777-60-81, 777-61-06; ООО «Торговый Дом «Гама-Маркет», т. (499) 190-72-41; в Екатеринбурге: ЗАО «Уралбиовет», т. (343) 345-34-34, 345-34-37, 345-34-38;
в Тюмени: ЗАО «Айболит», т. (3452) 33-58-65, 33-97-81
