Ферментативная деструкция хитозановых пленок под действием неспецифических ферментов Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия Б, 2008, том 50, № 7, с. 1281-1283

УДК 541.64:547.995.12

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ДЕСТРУКЦИЯ ХИТОЗАНОВЫХ ПЛЕНОК ПОД ДЕЙСТВИЕМ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

© 2008 г. Е. И. Кулиш*, В. П. Володина**, Р. Р. Фаткуллина**, С. В. Колесов*, Г. Е. Заиков***

* Башкирский государственный университет 450074 Уфа, ул. Фрунзе, 32 **Институт органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук

450054 Уфа, пр. Октября, 71 ***Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук

119991 Москва, ул. Косыгина, 4 Поступила в редакцию 02.10.2007 г. Принята в печать 03.03.2008 г.

Рассмотрены особенности протекания ферментативной деструкции пленок хитозана, полученных из растворов в уксусной кислоте, под действием неспецифических ферментов - коллагеназы и ли-разы. Обнаружено, что варьирование концентрации кислоты в исходном растворе существенно сказывается на структуре хитозана в сформированной пленке и, как следствие, на степени деструкции пленочных образцов.

Уникальные свойства получаемого из возобновляемого природного сырья природного полисахарида хитозана (совместимость с тканями человека, биоинертность и бактериостатичность, влагопроницаемость, а также и другие свойства) делают его полимером, пригодным для использования в медицинских целях [1]. Среди многочисленных достоинств хитозана - его биоразрушае-мость до обычных для организма веществ. Это определяет возможность использования данного полимера при создании биодеградируемых полимерных носителей в виде пленок [2], например в терапии ожоговых ран. В условиях медицинского применения хитозановых материалов их биодеградация осуществляется под действием неспецифических ферментов (в том числе ферментов, присутствующих на коже, - коллагеназы, гиалу-ронидазы и т.д.). Рассмотрение факта деструкти-рующего влияния на хитозан неспецифических ферментов представляется важной задачей как с научной, так и с практической точки зрения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объектами исследования служили хитозан (ТУ 6-09-05-296-76, фирма "Химмед", Россия), полученный щелочным дезацетилированием крабо-

Е-таП: [email protected] (Кулиш Елена Ивановна).

вого хитина (степень дезацетилирования ~75%, Мц = 1.2 х 105), протеолитический ферментный препарат коллагеназа, получаемый из гепатопан-креаса промысловых видов крабов, и ферментный препарат, выпускаемый под торговой маркой лираза (Государственное унитарное предприятие "Иммунопрепарат", Уфа). Пленки хитозана получали методом полива раствора полимера на поверхность стекла. Массовая концентрация хитозана в исходном растворе составляла 2 г/дл. В качестве растворителя использовали 1%-ную водную уксусную кислоту. Толщину пленок во всех экспериментах поддерживали постоянной и равной 0.1 мм. Пленки сушили при 25°С. В работе провели две серии экспериментов. В одной ферментный препарат, предварительно растворенный в небольшом количестве воды, вносили в раствор хитозана непосредственно перед приготовлением пленки. Содержание ферментного препарата в пленке 0.5-10 мае. % по отношению к массе хитозана. Ферментативную деструкцию хитозановой пленки под действием введенного в пленку фермента изучали вискозиметрическим методом в буферном растворе, состоящем из 0.3 М уксусной кислоты и 0.2 М ацетата натрия, согласно стандартной методике [3]. Ошибка эксперимента не более 5%.

1282 № дл/г

Рис. 1. Зависимость характеристической вязкости хитозана, выделенного из содержащей фермент пленки, от количества с введенной в пленку коллагеназы (1) и лиразы (2).

и др. [Щ дл/г

Рис. 2. Зависимость характеристической вязкости хитозана, выделенного после контактирования хитозановой пленки в течение 1 ч с раствором коллагеназы (7) и лиразы (2), от количества фермента в растворе с.

В другой серии экспериментов хитозановую пленку, не содержащую фермент, помещали на подложку, смоченную раствором ферментного препарата, и выдерживали при 35°С (температуре, имитирующей температуру человеческого тела) в течение определенного времени (до 1 ч). Концентрацию ферментного препарата в растворе, контактирующем с хитозановой пленкой, варьировали от 0.1 до 50 мае. %, по отношению к массе хитозана. Кинетику деструкции оценивали по данным вискозиметрии по падению характеристической вязкости на вискозиметре Уббелоде при 25°С аналогично описанному выше случаю.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Введение фермента коллагеназы в раствор хитозана на стадии приготовления пленок приводит к следующим закономерностям. Как видно из рис. 1 (кривая 1), присутствие в пленке фермента вызывает уменьшение характеристической вязкости хитозана. Это свидетельствует о том, что в процессе формирования пленки под действием введенного в пленку фермента происходит деструкция хитозана. Хорошо видно, что чем больше фермента введено в пленку, тем больше степень деструкции хитозана.

Аналогичное падение характеристической вязкости имеет место и в том случае, когда сформированную без фермента хитозановую пленку помещали на влажную подложку, смоченную рас-

твором коллагеназы (рис. 2, кривая 1). При этом наблюдаются следующие закономерности.

Во-первых, резкое падение характеристической вязкости наблюдается только в первые 10-15 мин контакта пленки с ферментом. Дальнейшее увеличение времени проведения ферментативной деструкции практически не сказывается на значениях характеристической вязкости хитозана. Во-вторых, при повышении концентрации коллагеназы в растворе, в контакте с которым находится пленка, увеличиваются степень падения характеристической вязкости и соответственно ММ хитозана. При значительной концентрации фермента в растворе биодеструкция хитозановой пленки в течение 1 ч приводит к падению ММ хитозана в ~2 раза.

В принципе, протеолитический фермент не должен вызывать деструкцию хитозана, являющегося полисахаридом. Однако препарат колла-геназа представляет собой комплекс ферментов. Этот комплекс обнаруживает высокую гликози-дазную активность. Таким образом, более вероятным объяснением ферментативной деструкции хитозановых пленок в присутствии коллагеназы представляется воздействие ферментов с глико-зидазной активностью на хитозан. Например, ферментом, сопутствующим коллагеназе, является гиалуронидаза, которая, очевидно, может расщеплять гликозидную связь не только в гиалу-роновой кислоте, но и в самом хитозане.

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ДЕСТРУКЦИЯ ХИТОЗАНОВЫХ ПЛЕНОК

1283

С целью проверки данной гипотезы был использован другой ферментативный препарат -лираза, представляющий собой группу ферментов под общим названием гиалуронидаза, катализирующих реакции гидролитического расщепления и деполимеризации основного компонента соединительной ткани гиалуроновой кислоты. Из рис. 1 и 2 (кривые 2) следует, что наблюдаемые закономерности ферментативной деструкции хи-тозана в присутствии лиразы аналогичны тем, что имели место при использовании в качестве фермента коллагеназы; это позволяет утверждать, что собственно деструкция макромолекул хитозана происходит именно под действием гиа-луронидаз как действующих начал обоих используемых ферментов.

Тот факт, что закономерности ферментативной деструкции, наблюдаемые в присутствии двух указанных ферментов, совпадают и качественно, и количественно, можно вероятно объяснить тем, что доступность фермента для взаимодействия с хитозаном невелика, особенно если учесть высокую степень кристалличности хитозана и полимерную природу ферментов. Очевидно, гликози-дазы могут воздействовать только на доступные ей звенья хитозана. Дальнейшее увеличение концентрации фермента или времени контакта плен-

ки с ферментом доступность звеньев не изменяет. В результате этого характеристическая вязкость хитозана меняется не монотонно, а достигает определенного предела, после чего перестает изменяться.

Таким образом, обнаруженный факт падения характеристической вязкости хитозана, полученного в виде пленок из уксуснокислого раствора, под действием ферментных препаратов коллаге-наза и лираза как при введении фермента непосредственно в пленку, так и при контакте пленки с подложкой, содержащей раствор ферментного комплекса, может быть обусловлен тем, что ферментативная деструкция хитозана происходит под действием гликозидаз, находящихся в ферментных препаратах.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Muzzarelli RA. Chitin. Oxford: Pergamon Press, 1977.

2. Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. М.: Наука, 2002.

3. Рафиков С.Р., Будтов В.П., Монаков Ю.Б. Введение в физико-химию растворов полимеров. М.: Наука, 1978.

Enzymatic Degradation of Chitosan Films under the Action of Nonspecific Enzymes

E. I. Kulish», V. P. Volodina", R. R. Fatkullina", S. V. Kolesov», and G. E. Zaikov*

a Bashkortostan State University, ul. Frunze 32, Ufa, 450074 Bashkortostan, Russia

b Institute of Organic Chemistry, Ufa Scientific Center, Russian Academy of Sciences, pr. Oktyabrya 71, Ufa, 450054 Bashkortostan, Russia

c Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, ul. Kosygina 4, Moscow, 119991 Russia

e-mail: [email protected]

Abstract—The features of the enzymatic degradation process mediated by the nonspecific enzymes collage-nase and Lyrase are discussed for chitosan films prepared from acetic acid solutions. It was shown that variations in the acid concentration in the initial solution have a substantial effect on both the structure of chitosan in the film formed and the degree of degradation of film samples.