Ферментативная деструкция хитозановых пленок под действием коллагеназы Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия Б, 2006, том 48, № 9, с. 1721-1724

УДК 541.64.547.995

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ДЕСТРУКЦИЯ ХИТОЗАНОВЫХ ПЛЕНОК ПОД ДЕЙСТВИЕМ КОЛЛАГЕНАЗЫ © 2006 г. Е. И. Кулиш*, В. П. Володина**, С. В. Колесов*, Г. Е. Заиков***

* Башкирский государственный университет 450074 Уфа, ул. Фрунзе, 32 **Институт органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук

450054 Уфа, пр. Октября, 71 *** Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук

119991 Москва, ул. Косыгина, 4 Поступила в редакцию 20.02.2006 г. Принята в печать 28.04.2006 г.

Рассмотрены особенности протекания ферментативной деструкции образцов хитозана, полученных в виде пленок из растворов в уксусной кислоте, под действием неспецифического фермента -коллагеназы. Варьирование концентрации кислоты в исходном растворе существенно сказывается на структуре хитозана в сформированной пленке и, как следствие, на степени деструкции пленочных образцов. Добавки поливинилового спирта при формировании хитозановой пленки приводят к увеличению степени ферментативной деструкции последней.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время отмечается повышенный интерес специалистов к препаратам на основе хитина ракообразных, его производным и возможностям их использования в различных областях медицины. Одним из достоинств хитозана является его биоразрушаемость в организме. Это определяет возможность использования хитозана и его производных при создании биодеградируе-мых полимерных носителей фармацевтических препаратов в виде пленок [1]. В условиях медицинского применения хитозановых материалов их биодеградация осуществляется под действием неспецифических ферментов (например, пепсина, лидазы, коллагеназы и т.д.). В связи с этим рассмотрение факта возможного деструктирующего влияния на хитозан неспецифического фермента представляется важной задачей, как с научной, так и с практической точки зрения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объектом исследования использовали образец хитозана производства фирмы "Химмед", Россия (ТУ 6-09-05-296-76), полученный щелочным деацетилированием крабового хитина, со степенью деацетилирования ~75% и с Мц = 12.0 х

E-mail: [email protected] (Кулиш Елена Ивановна).

х 104 и ПВС марки 16/1 (ГОСТ 10779-78) сМц = = 2.5 х 104. В качестве фермента применяли кол-лагеназу, взятую в количестве 4 мае. % по отношению к полимеру. Пленки хитозана, а также его смесей с ПВС из растворов в уксусной кислоте различной концентрации получали методом полива на стеклянную подложку. Массовая концентрация полимеров в исходном растворе составляла 2 г/дл. Концентрацию уксусной кислоты варьировали от 1 до 70 мае. %. Толщина пленок во всех экспериментах была постоянная - 0.1 мм. Для моделирования возможного процесса деструкции пленочного образца хитозана на раневой поверхности пленку помещали на подложку, смоченную раствором коллагеназы, и выдерживали при температуре 35°С в течение определенного времени. Кинетику деструкции исследовали методом вискозиметрии в буферном растворе, состоящим из 0.3 М уксусной кислоты и 0.2 М ацетата натрия.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Использованная в работе методика вискози-метрической оценки степени изменения ММ позволяет установить факт протекания деструкции по уменьшению вязкости растворов хитозана под действием коллагеназы в зависимости от продолжительности выдержки в нем пленочного образ-

1722

КУЛИШ и др.

Время, мин

Рис. 1. Зависимость характеристической вязкости растворов хитозана, полученных из пленочных образцов, сформированных из 1% (1) и 10%-ной уксусной кислоты (2), от продолжительности контакта с коллагеназой.

ца. Полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что в пленках хитозана под действием коллагеназы проходит ферментативная деструкция, несмотря на то, что данный фермент является неспецифичным по отношению к хито-зану и интенсивность взаимодействия последнего с коллагеназой (особенно учитывая его высокую кристалличность), очевидно, невелика. Поскольку специфичное действие коллагеназы на коллаген состоит в статистическом расщеплении белковых молекул, можно предположить, что и в случае хитозана деструкция макроцепей протекает по закону случая. Обращает на себя внимание факт, что при ферментолизе хитозановой пленки изменение характеристической вязкости во времени носит неравномерный характер - основное падение вязкости (в среднем на 30-40% от исходного значения) происходит за первые 30 мин, а далее изменение характеристической вязкости раствора, полученного из пленочных образцов, крайне незначительно (рис. 1). Кроме того, значение характеристической вязкости хитозана, определенное путем растворения пленочного образца, прошедшего стадию формования из раствора в уксусной кислоте и не подвергнутого ферментативной деструкции, не совпадает со значением характеристической вязкости исходного хитозана. Данный факт позволяет предположить протека-

ние структурных перестроек, которые происходят в растворе и сохраняются в пленке.

Известно [2], что концентрация уксусной кислоты существенно сказывается на степени прото-нирования аминогрупп хитозана а и вязкости растворов хитозана. Эквимольное соотношение уксусная кислота: хитозан обеспечивает достижение величин а, не превышающих 0.5-0.7. Соответственно растворы хитозана в разбавленной уксусной кислоте (1-2 мае. %) характеризуются невысокой вязкостью и компактной формой макромолекул хитозана. Лишь при 7-10-кратном мольном избытке уксусной кислоты (10%-ная уксусная кислота) по отношению к хитозану степень про-тонирования аминогрупп становится равной единице. Повышение концентрации уксусной кислоты от 1 до 10% сопровождается возрастанием характеристической вязкости раствора. При увеличении концентрации кислоты выше 10% наблюдается снижение характеристической вязкости, связанное с повышением ионной силы раствора, экранированием аминогрупп полимера и компактизацией его макромолекул. Кроме влияния на степень протонирования хитозана, необходимо учесть тот факт, что растворы с различным содержанием уксусной кислоты являются растворителями разного термодинамического качества по отношению к хитозану. Известно, что растворы 70%-ной уксусной кислоты характеризуются наибольшим сродством к хитозану [3]. Кроме того, для растворов хитозана в 70%-ной уксусной кислоте отмечается высокая степень структурирования вследствие высокой степени структурирования самого растворителя и из-за образования большого числа межмолекулярных водородных связей. Как следствие, абсолютная вязкость достигает своего максимума именно для растворов хитозана в 70%-ной уксусной кислоте. Столь существенное различие в структуре исходных растворов сохраняется, очевидно, и в структуре пленок, сформированных из растворов. Зависимость характеристической вязкости растворов, полученных из пленочных образцов, от концентрации кислоты, из которой была сформирована пленка, имеет сложную форму (рис. 2). Наименьшая вязкость - у растворов, полученныхе из пленок, сформированных из 1%-ной уксусной кислоты. Максимального значения достигает характеристическая вязкость раствора хитозана из пленок, сформированных из 10 и 70%-ной уксусной кис-

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ДЕСТРУКЦИЯ ХИТОЗАНОВЫХ ПЛЕНОК

1723

лоты. Следовательно, структура хитозана, которую он имел в исходном растворе, во многом сохраняется и в пленках, полученных из этих растворов. Такая большая разница в значениях характеристической вязкости позволяет предположить, что использование уксусной кислоты различной концентрации для формирования пленок обеспечивает разную плотность.

В связи с этим существует принципиальная возможность, варьируя структуру полученного из раствора пленочного материала, регулировать доступность звеньев хитозана для взаимодействия с ферментом в процессе деструкции, и, следовательно, регулировать его скорость.

По данным вискозиметрических измерений можно оценить не только относительное уменьшение характеристической вязкости, но и ММ хитозана, пользуясь уравнением Марка-Куна-Хау-винка для растворов хитозана в используемом ацетатном буфере ([т|] = 1.38 х 1СИМ0-85) (табл. 1).

Добавление к хитозану другого водорастворимого полимера - ПВС значительно улучшает физико-механические свойства композиции и позволяет получать тонкие, прочные, эластичные и прозрачные пленки [4, 5]. Более того, как отмечается в работе [6], независимо от концентрации используемой кислоты в исходном растворе, в сформированной пленке хитозан-ПВС увеличивается размер макромолекул по сравнению с аддитивными значениями. Данный факт, очевидно, обусловлен интерполимерным взаимодействием, т.е. образованием гетероагрегатов хитозан-ПВС, которые, как известно, характеризуются пониженной плотностью упаковки и большими размерами. Таким образом, введение второго полимера, очевидно, изменяет надмолекулярную структуру исходной пленки, что находит свое отражение при ферментативной деструкции хитозана в полимерной композиции.

Отметим, что в выбранных условиях ПВС ферментативной деструкции не подвергается. Об этом свидетельствует факт постоянства его относительной и характеристической вязкости в течение длительного времени. Однако введение ПВС не остается индифферентным для процесса деструкции хитозана. Если в контакт с ферментом вступают образцы хитозан-ПВС, полученные в виде пленок из 1%-ного раствора в уксусной кислоте, ферментолиз хитозановых звеньев при всех

[Л], дл/г

[СН3СООН], г/дл

Рис. 2. Зависимость характеристической вязкости растворов хитозана, полученных из неде-структированных пленочных образцов, от концентрации уксусной кислоты в исходном растворе.

изученных соотношениях полимеров в смеси происходит в большей мере, чем в случае индивидуального хитозана (табл. 2).

Факт увеличения степени ферментативной деструкции при введении в пленку хитозана ПВС, который сам деструкции не подвергается, может быть объяснен только с позиции образования смешанных агрегатов хитозан-ПВС с пониженной плотностью упаковки. Доступность хитозана для взаимодействия с коллагеназой в таких рыхло упакованных агрегатах больше, чем в случае го-моагрегатов хитозан-хитозан с высокой плотностью упаковки, а соответственно выше и степень деструкции хитозана.

Таким образом, процесс ферментативной деструкции пленочных образцов хитозана оказыва-

Таблица 1. Изменение ММ и [т|] пленочных образцов хитозана, полученных из исходных растворов с различным содержанием уксусной кислоты после выдержки их в растворе коллагеназы в течение 1 ч (ММ исходного хитозана 1.26 х 105, [т|] = 3.0 дл/г))

[СН3СООН], мае. % А[т|], дл/г АМЦ х КГ3

1 1.03 36

5 1.28 47

10 1.33 49

15 1.15 28

20 1.08 38

50 1.12 40

70 1.59 60

1724

КУЛИШ и др.

Таблица 2. Изменение ММ и [Г|] пленочных образцов хитозан-ПВС, полученных из растворов в 1%-ной уксусной кислоте после выдержки их в растворе коллагеназы в течение 1 ч (ММ исходного хитозана 1.26 х 105, [т|] = 3.0 дл/г)

[ПВС] в смеси, мае. % Д[Г|], дл/г ДМЛ х 10"3

0 1.03 36

20 1.32 48

40 1.35 50

60 1.35 50

80 1.40 52

ется чувствительным к надмолекулярной структуре полимера, которая в свою очередь определяется его структурой в исходном растворе, из которого готовятся пленки. Это позволяет формировать хитозановые покрытия с регулируемой биоразрушаемостью.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Muzzarelly R. Chitin. London: Pergamon Press, 1977.

2. Вихорева Г.А., Роговина С.З., Пчелко О.М., Галъ-брайх Л.С. // Высокомолек. соед. Б. 2001. Т. 43. № 6. С. 1079.

3. Агеев Е.П., Вихорева Г.А., Матушкина H.H., Пчелко О.М., Гальбрайх JI.C. // Высокомолек. соед. А. 2000. Т. 42. № 2. С. 333.

4. Мухина В.Р., Пастухова Н.В., Семчиков Ю.Д., Смирнова ЛЛ., Кирьянов К.В., Жерненков М.Н. // Высокомолек. соед. А. 2001. Т. 43. № 10. С. 1797.

5. Николаев А.Ф., Прокопов A.A., Шульгина Э.С., Голенишева С.А., КлубиковаЛ.Е., Мусихин В.А. Ц Пласт.массы. 1987. № 11. С. 40.

6. Кулиш Е.И., Колесов С.В. // Журн. прикл. химии. 2005. №9. С. 1511.

Enzymatic Degradation of Chitosan Films by Collagenase

E. L Kulish", V. P. Volodina*, S. V. Kolesov", and G. E. Zaikov*

a Bashkortostan State University, id. Frunze 32, Ufa, 450074 Bashkortostan, Russia b Institute of Organic Chemistry, Ufa Scientific Center, Russian Academy of Sciences, pr. Oktyabrya 71, Ufa, 450054 Bashkortostan, Russia c Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, ul. Kosygina 4, Moscow, 119991 Russia e-mail: [email protected]

Abstract—Special features of enzymatic degradation of chitosan samples prepared as films from solutions in acetic acid, under the action of collagenase as a nonspecific enzyme are considered. Variations in acid concentration in the casting solution had a substantial effect on the chitosan structure in the formed film and, as a consequence, on the degree of degradation of film samples. The addition of poly(vinyl alcohol) upon the formation of a chitosan film led to an increase in the extent of enzymatic degradation of the film.