CC BY
10
УДК: 577.1+457.25
ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В ОКИСЛЕНИИ (+) И (-) [RU(PHPY)(PHEN)2]PF6 ПЕРОКСИДОМ ВОДОРОДА В ПРИСУТСТВИИ ПЕРОКСИДАЗЫ ИЗ КОРНЕЙ ХРЕНА Е.В. Иванова, А.Д. Рябов
(Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, кафедра химической энзимологии; email: ivanka@enzyme.chem.msu.ru)
С использованием ионобменной хроматографии циклометаллический комплекс рутения [Ru(phpy)(phen)2]PF6, где (phpy = 2-фенилпиридин, phen = 1,10-фенантро-лин) был разделен на L- и D-октаэдрические изомеры. Выделенные изомеры были охарактеризованы с использованием УФ-видимой и КД-спектроскопии. Была изучена кинетика окисления [Ru(phpy)(phen)2]PF6 пероксидом водорода в присутствии пероксидазы из корней хрена в интервале pH 5-9.
Превосходные окислительно-восстановительные свойства полипиридильных соединений рутения [1] хорошо известны. Комбинация иона рутения с ароматическим лигандным окружением привела к образованию высокообратимой молекулы с окислительно-восстановительным потенциалом, близким к биологическому. Использованная в данной работе группа субстратов представляет собой новый класс рутеноорганических соединений - циклометаллированные производные 2-фенил-пиридина [1], содержащие ковалентную связь металл-углерод (рис. 1).
Наличие ковалентной связи рутений-углерод значительно понижает редокс-потенциал и обеспечивает жесткость структуре комплекса [1]. Пониженный ре-
Рис. 1. Структурное строение [Ru(phpy)(phen)2]PF6
докс-потенциал практически полностью исключает вероятность протекания побочных редокс процессов [2]. Жесткая структура молекулы медиатора снижает энергетические затраты медиатора на реорганизацию сольват-ной оболочки, сопутствующие изменению заряда металла [2]. За счет последнего свойства рутенациклы превращаются в высокоэффективные переносчики электронов в катализе оксидоредуктазами [1].
Механизм переноса электрона в катализе оксидоредуктазами мало известен. В рамках данной работы предполагалось исследовать природу слабых взаимодействий в механизме переноса электрона с активного центра фермента на рутениевый субстрат. Рутенацикличес-кие соединения [Ru(phpy)(LL)2]PF6, где phpy - 2-фенилпиридин, а LL - 2,2'-бипиридин или 1,10-фенантролин, была разделены на Л и Д оптические изомеры (рис. 2.). Была исследована способность пероксидазы узнавать конфигурацию рутениевого субстрата.
Экспериментальная часть
Реагенты. Комплексы [Ru(phpy)(LL)2]PF6, где phpy -2-фенилпиридин, а LL - 1,10-фенантролин, были синтезированы, как описано ранее [1].
Кроме того, в работе использовали следующие реагенты: носитель "Сефадекс SP C-25" ("Фармасия", Швеция), "Дауэкс 1-Х2 (AG 1-42)" ("Serva", Герма -
рассчитывали из полной кинетическом кривои по уравнению (1)
A(t) = Л^ + (A0 - A^)xe .
(1)
Рис. 2. Пространственное строение оптических L- и D-изомеров [Ru(phpy)(phen)2]PF6
ния); элюент готовили нейтрализацией раствора 50 мМ о'о'-дибензоилвинной кислоты ("Флюка") двумя моль/экв. NaOH ("Ла Хема"); хлороформ ("Хим-мед", "ос.ч."); ацетонитрил ("Химмед", "ос.ч."); KPF6 ("Флюка"); NaH2PO42H2O, K2HPO4 - компоненты буферных растворов ("Реахим", "ч.д.а.") использовали без предварительной очистки; перекись водорода ( "Реахим", "ч.д.а.", 30%); пероксидаза из корней хрена (ПХ) ("Sigma", RZ = 2,8).
Приборы. Спектрофотометрические измерения проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-160A с термостатом CPS-240A. Спектры кругового дихроизма были измерены на приборе "Jasco J-715" Измерения значений оптического отклонения проводили на Autopol II, (Rudolf research analytical).
Разделение стереоизомеров [Ru(phpy)(phen)2IPF6.
Разделение рутения(11) осуществлялось хроматогра-фически [3] на колонке с ионообменным носителем "Сефадекс SP C-25", уравновешенной 50 мМ o'o'-дибензоилтартратом натрия (pH 8,0). Слежение за прохождением и полнотой разделения ярко окрашенных фракций велось визуально. Выделение стерео-изомеров проводили экстрагированием равным объемом хлороформа. Дополнительную очистку выделенных изомеров от o'o' - дибензоилтартрата натрия проводили хроматографически на анионообменном носителе "Дауэкс 1-Х2 (AG 1-42)" элюентом следующего состава: 70% 1 М водного раствора KPF6 и 30% ацетонитрила.
Кинетические измерения
За скоростью реакции следили спектрофотометричес-ки по убыванию оптической плотности в интервале длин волн 470-490 нм, соответствующих поглощению Ru(II) [4]. Для исследования стереоселективности ферментативного окисления соединений рутения(11) перок-сидом водорода в присутствии пероксидазы из корней хрена к буферному раствору, содержащему стереоизо-мер рутения(11) в концентрации 5x10 5 М, добавляли перекись водорода так, чтобы концентрация пероксида водорода в кювете составляла 2x10 4 М. Реакцию инициировали добавлением раствора пероксидазы из корней хрена. Концентрация ПХ в кювете составляла 3x10-9 М. Значения наблюдаемых констант скорости
Результаты и обсуждение
Выделение и характеристика стереоизомеров [.Яи(рНру)(ЬЬ)^РЕ67. Состоящий из трехмерно сшитых молекул ^-глюкозы, сефадекс БР С-25 обычно используют для гель-фильтрации [5] при разделении белков. Этот носитель обладает элементом хиральности. В сочетании с оптически активным о 'о '-дибензоил тартратом натрия в качестве элюента эта система обладает способностью эффективно разделять стреоизомеры полипиридильных комплексов переходных металлов [3].
При рН > 7,0 носитель, модифицированный -0-СН2-СН2-СН2-Б03 , проявляет анионообменные свойства [5] и легко связывает внешнесферные лиганды комплексов. Строение использованного в работе [Яи(рЬру)(рЬеп)2]РР6 (рис. 1) [1] сходно со строением полипиридильных комплексов рутения, использованных в работе [3].
Эффективная длина разделяющей колонки для [Яи(рЬру)(рЬеп)2]РР6 составляла 15 см. Такая эффективность разделения по сравнению с их полипиридильными аналогами [3] может достигаться за счет того, что растворимость [Яи(рЬру)(рЬеп)2]РР6 ниже растворимости [Яи(рЬеп)3]РР6, и связывание с носителем эффективнее.
Выделенные стереоизомеры были охарактеризованы спектрально. Электронные спектры 1 и 2 фракций на примере [Яи(рЬру)(рЬеп)2]РР6 представлены на рис. 3. Характеристические пики стереоизомеров совпадали друг с другом и хорошо соотносились со спектрами кругового дихроизма рис. 4. Из-за сильного поглощения рутенациклических соединений в видимой области оптическое отклонение соответствующих фракций удалось оценить только качественно. Первая выделенная фракция имела знак (+), а вторая (-).
Представленные данные хорошо согласуются с литературными. При соотнесении полученных данных с [3]
Рис. 3. Спектры кругового дихроизма оптических изомеров [Яи(рЬру)(рЬеп)2]РР6. Метанольный раствор, [Яи], М: 1 - 3,8х10-5; (+); 2 - 2,5х10-5 (-)
Рис. 4. Электронные спектры октаэдрических изомеров [Ru(phpy)(phen)2]PF6. Метанольный раствор,
[Ru11], М: 1 -3,8х10-5 (+), 2 -
2,5x10 (-)
0,016-
0,012 -
0,008 -
0,004 -
фермента на рутениевый субстрат в природных системах, а также разделения влияния стерических затруднений, унаследованных от конфигурации составляющих белок Ь-а-аминокислот, и селективности, связанной с участием различных кислотных остатков в связывании рутениевого субстрата в активном центре фермента, было исследовано влияние рН на стереоселективность реакций, катализируемых ПХ. Реакция, катализируемая ПХ, описывается уравнением (2):
2Run + H2O2 + 2H+ ^ 2RuIII+H2O.
(2)
рН
Рис. 5. рН-зависимости активности ПХ в катализе реакции окисления [Яи(рЬру)(рЬеп)2]РР6 перекисью водорода (7); зависимость стереоселективности ПХ от рН (2). [Яи] = 5х10-5 М [Н202] = 2Х10-4 М, [ПХ] = 3х10-9 М, 50 мМ фосфатный буфер, ? = 25°
выделенным изомерам были приписаны абсолютные конфигурации: Л и Д первой (+) и второй (-) фракции соответственно (рис. 2).
Влияние рН на стереоселективность окисления оптических изомеров рутения (II) пероксидом водорода в присутствии ПХ. С целью выявления детального механизма переноса электрона с активного центра
Скорость реакции окисления (+) и (—) изомеров [Ru(phpy)(phen)2]PF6 пероксидом водорода в присутствии ПХ была измерена при различных pH в интервале от 5,0 до 9,0. Зависимость фактора стереоселективности (отношения наблюдаемых констант скорости ¿A/M) от pH представлена на рис. 5. В интервале pH от 5,0 до 7,0 скорость окисления [Ru(phpy)(phen)2]PF6 не зависела от конфигурации изомера. При значениях pH выше 7,0 более предпочтительной оказывалась Л -конфигурация (+)[Ru(phpy)(phen)2]PF6. Значение фактора равно 1 в интервале pH от 5,0 до 7,0 и быстро возрастает до 2,5 при pH выше 7,0. Что примечательно, фактор энантиоселективности возрастает в том же интервале pH, когда значения абсолютных скоростей реакции окисления Ru(II) значительно снижаются, т.е. стереоселективность тем выше, чем ниже активность фермента. Это говорит в пользу того, что для эффективного участия в катализе ПХ, рутениевые комплексы не связываются с активным центром пероксидазы. Стереоселективность, наблюдаемая при высоких значениях pH, может быть вызвана нативной селективностью, обусловленной хи-ральностью элементов строения белка - аминокислот.
Вид зависимости фактора стереоселективности от pH имеет вид, схожий с найденной ранее для планарно-хи-ральных ферроценов [6], но чувствительность ПХ к окта-эдрической хиральности выше, чем к планарной.
Выделены RuII(phpy)(phen)2]PF6 - оптические изомеры Л и Д. Охарактеризованы по сопоставлению полученных данных с литературными выделенным октаэдрическим изомерам приписаны абсолютные конфигурации. Установлена pH зависимость стереоселективности окисления [Ru(phpy)(phen)2]PF6 пероксидом водорода в присутствии ПХ. Стереоселективность наблюдалась при pH > 8,0.
к
к, / кд
с
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ryabov A. D., Sukharev V. S., Alexandrova L. et al. II Inorg. Chem.
2001. 40. P. 6529.
2. Marcus V. R. A. II Angew. Chem. 1993. 8. P. 1161.
3. Fletcher N. C., Junk P. C., Reitsma D. A. et al. II J. Chem. Soc.
Dalton Trans. 1998. P. 133.
4. Ryabov A. D., Firsova Y. N., Goral V. N. et al. // Inorganic reaction
Mechanisms. 2001. P. 343.
5. Dawson R. M. C., Elliott D. C., Elliot W. et al. Data for Biochemical
Research. Oxford, 1986.
6. Ryabov A. D, Firsova Y. N., Goral V. N. et al. // Chem. Eur. J. 1998.
4. P. 806.
Поступила в редакцию 25.10.02
