CC BY
40
УДК 577.1+547.25
СТАБИЛЬНОСТЬ И КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ ИЗ PENICILLIUM FUNICULOSUM G-15
М. Е. Давыдова,1 В. С. Курова2, М. В. Сухачева1, М. Б. Куплетская1, А. Д. Рябов2, А. И. Нетрусов1
(Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, 1 биологический факультет, химический факультет; е-mail: [email protected])
Изучены свойства глюкозооксидазы (ГО), выделенной из нового штамма плесени Pénicillium funiculosum G-15. Фермент проявляет высокую субстратную специфичность по отношению к D-глюкозе = 3,3 мМ) и сохраняет оптимальную активность в широком диапазоне температур и значений pH. Медиаторная активность комплексов рутения(11) в катализе ГО из P. funiculosum G-15 была сопоставлена с активностью по отношению к ферменту из A. niger.
Для создания биосенсоров и ферментных анализато- уже два десятка лет используют глюкозооксидазу (КФ ров в фундаментальной и клинической медицине вот 1.1.3.4) [1, 2]. Этот фермент с успехом применяют
также в пищевой промышленности в качестве биологического антиоксиданта и консерванта [1, 3, 4].
Известно, что основными продуцентами фермента являются мицелиальные грибы, относящиеся к родам Aspergillus и Pénicillium [5-8]. Практическая значимость глюкозооксидазы (ГО) обусловила необходимость разработки эффективных способов ее получения и поиска новых продуцентов с высокой биосинтетической активностью.
В настоящей работе была выделена внеклеточная глюкозооксидаза из нового штамма P. funiculosum G-15. Она была протестирована на примере системы, включающей в качестве медиаторов электронного переноса комплексы рутения. Были изучены свойства ГО, а также возможность ее использования в создании амперо-метрических биосенсоров.
Экспериментальная часть
Приборы и материалы. В работе использовали штамм-продуцент внеклеточной глюкозооксидазы P. funiculosum G-15, выделенный в 1997 г. М.Б. Куплетс-кой и A.B. Кураковым из испорченной краски [8]. В работе были также использованы ГО из A. niger (Sigma) с активностью 270 ед./мг, пероксидаза хрена (RZ > 3,0) (ICN), D-глюкоза (ICN), бычий сывороточный альбумин (БСА) (Sigma). Очистку белка проводили на сефадекс G-150 (Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Швеция). Компоненты буферных растворов (KH2PO4, Na2HPO4, HCl и NaOH), а также трихлоруксусную кислоту (ТХУ) с чистотой не ниже "ч.д.а.", использовали без дополнительной очистки. При проведении градиентного электрофореза в качестве калибровочных белков использовали MW маркеры (Amersham-Pharmacia, Швеция).
Комплексы рутения типа I были синтезированы А.Ю. Ершовым (С.-Петербургский государственный университет, Россия), а рутенациклы предоставлены Л. Александровой (Carnegie Mellon University, Питтсбург, США). Спектрофотометрические данные были получены на приборах "Хитачи 200-20" (Япония) "Schimadzu" UV-160A (Япония). Электрохимические измерения проводили на потенциостате - гальваностате IPC-4, оснащенном компьютерным интерфейсом (Институт физической химии, РАН, Москва, Россия). Электрохимическая ячейка включала пирографитовый рабочий электрод, насыщенный каломельный электрод сравнения (НКЭ) и платиновый вспомогательный электрод.
Методы. Разработан метод выращивания культуры, выделения и очистки внеклеточной глюкозооксидазы [9]. Экстракцию меланиновых пигментов из культураль-ной жидкости проводили по методике [10]. Содержание белка в ферментных препаратах определяли по методу Брэдфорда [11]. Количество ФАД на молекулу фермента рассчитывали, учитывая его молярный коэффициент экстинкции при 450 нм е = 1,3-10 М- см- .
Молекулярную массу фермента определяли гель-фильтрацией, используя колонку (2,5x100 см) с сефа-дексом G—150 (Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Швеция) в качестве носителя, и элюировали 0,05 М фосфатным буфером (рН 7,0; 22°) со скоростью 18 мл/ч. Для построения калибровочной кривой использовали смесь белков с известной молекулярной массой (гексокиназа, БСА, химотрипсин - 96,6; 67 и 25 кДа соответственно). Молекулярную массу субъединиц глюкозооксидазы рассчитывали по данным градиентного электрофореза в 4-12%-м полиакрил-амидном геле (ПААГ) с 0,1% доде-цилсульфата натрия (ДДС-Na) в присутствии калибровочных белковых маркеров после обработки фермента 0,1 М меркаптэтанолом. Чистоту ферментного препарата определяли по градиентному электрофорезу в 412%-м ПААГе в нативных условиях.
Ферментативную активность ГО определяли по скорости пероксидазного окисления о-дианизидина, согласно стандартной методике [12].
При измерении диапазона рабочей температуры фермента реакционную смесь, содержащую 100 мг/мл D-глюкозы, инкубировали при температурах от 20 до 70° в течение 20 мин. Для определения температурной стабильности и влияния рН на термо стабильность глю-козооксидазы исследуемый фермент инкубировали в буферных растворах с рН 5,6; 7,0 и 8,6 в течение 1 ч при температуре от 20 до 70°. Пробы отбирали через каждые 15 мин и измеряли активность фермента описанным выше методом.
Для определения влияния ионов металлов на активность глюкозооксидазы в реакционную смесь, содержащую изучаемый фермент, добавляли соли в концентрации 1 мМ. После инкубирования в течение 5 мин измеряли активность фермента. За 100% принимали активность фермента в контрольной смеси, не содержащей добавок.
Медиаторную активность комплексов рутения (II) при электрокатализе глюкозооксидазой изучали методом циклической вольтамперометрии (ЦВА). Рабочие растворы комплексов рутения(11) с концентрацией 0,4 мМ готовили растворением навески комплекса в соответствующем объеме 0,01 М фосфатного буфера (pH 7,0; 22°) с добавлением не более 5% MeOH. Исходный 1 М раствор D-глюкозы получали растворением навески глюкозы в фосфатном буфере и выдерживанием раствора при комнатной температуре в течение 24 ч для полной мутаротации D-глюкозы. Раствор глюкозооксидазы в дистиллированной воде (1,3 мМ) хранили при -20°. Раствор комплекса помещали в термостатируемую при 25° электрохимическую ячейку объемом 8 мл и в течение 30 мин продували аргоном, затем добавляли раствор фермента, концентрация которого в ячейке составляла 5 мкМ, и регистрировали циклические вольтамперо-граммы при скорости развертки потенциала от 2 до
100 мВ/с в диапазоне потенциалов 0-1 В. Затем проводили тот же эксперимент после добавления свежего раствора Б-глюкозы, концентрация которой в ячейке составляла 100 мМ. Полученные данные обрабатывали по методу Бурдильона [13].
Обсуждение результатов
Молекулярная масса глюкозооксидазы из Р. ^тш-losum, определенная гель-фильтрацией и методом градиентного электрофореза в 4-12% ПААГе в нативных условиях, составляла 140±10 кДа. На электрофорезе в полиакриламидном геле с 0,1% ДДС-№ после обработки фермента меркаптэтанолом наблюдали одну полосу, подвижность которой соответствовала молекулярной массе 70 кДа. По всей видимости, фермент состоит из двух идентичных субъединиц.
Глюкозооксидаза из Р. funiculosum характеризуется высокой субстратной специфичностью к Б-глюкозе (Км = 3,3 мМ; рН 7,0; 25°).
Первоначальная активность фермента (100%), при 25° не меняется в диапазоне рН от 6,0 до 8,6 (рис. 1, а), а при повышении температуры от 25 до 55° падает не больше, чем на 20% и достигает максимума при 30° (рис. 1, б).
Инкубирование глюкозооксидазы при 30° в течение 1 ч не влияет на ее стабильность в широком диапазоне значений рН от 4,0 до 8,6 (рис. 2).
При инкубировании в буфере с рН 5,6 фермент сохраняет первоначальную активность при 50° в течение 1 ч, а при 60° - в течение 15 мин, тогда как в буфер-
3
я
л
4
I
о о
О
100 -| 80 -60 -40 -20 -0
♦ ♦ ♦ ♦
6 7 рН
9 10 11
3
к
-а
4 <и
Ё о о
£ о
100
80
Л" т 60
О
о « 40
1 20
а
0
20 40 60 80 Температура, 0С
Рис. 1. Оптимум рН (а) и диапазон рабочей температуры (б) глюкозооксидазы из Р. /итси1сяит 0-15
Л
н о о
и «
« Л
к
-а
Ч <и
Ё о о и н О
100 80 60 40 20 0
6 7 рН
9 10 11
Рис. 2. Влияние рН на стабильность глюкозооксидазы Р. /итси1ояит 0-15 в точке температурного оптимума
л н о о
и «
« н
и
Л
ч <и
н «
о о и н
о
80 -60 -40 20 Н 0
30 40 50 60 Температура, °С
70
Рис. 3. Влияние температуры на стабильность глюкозооксидазы Р. итсиОит 0-15 при рН: 1 - 8,6; 2 - 7,0; 3 - 5,6
ном растворе с рН 8,6 его активность быстро падает до 50% от первоначальной в диапазоне температур от 40 до 50°. При дальнейшем нагревании в щелочном буфере фермент быстро инактивируется (рис. 3).
Исследуемая глюкозооксидаза устойчива по отношению ко многим ионам металлов за исключением меди(11) и цинка(11) (табл. 1).
Высокая температурная и рН стабильность новой глюкозооксидазы и ее устойчивость к изученным ионам металлов делает ее перспективной для использования в биосенсорах для анализов в медицине и пищевой технологии.
В качестве модели амперометрического биосенсора на основе ГО из Р funiculosum нами была изучена методом ЦВА система, состоящая из фермента и комплексов рутения(П) двух типов (рис. 4):
I - [Яи(Ш)2(Х)1-2] (Ш = 2,2'-бипиридил или 1,10-фе-нантролин; X = С1-, С032-, (N0)0);
II - [Яи(С№)^)(8о1у)2](РР6) или [Яи(С№)^)2](РР6), где CN = ^^диметилбензиламин или 2-фенилпиридин. Ранее было показано [14-16], что рутениевые комплексы обоих типов проявили высокую медиаторную активность в катализе глюкозооксидазой из А. niger. Согласно теории [17], из-за большей жесткости координационной
а
б
Т а б л и ц а 1
Влияние ионов металлов и хелатирующих агентов на активность внеклеточной глюкозооксидазы из Р. /итеи^иш
в-15
Добавка, 1 мМ Относительная активность ГО, %
Контроль 100
№С1, NN02, К1 100
М2(804)з, БеС1з, Ып804 100
^04, СОС12 96
Си804 70
гп804 25
Т а б л и ц а 2
Медиаторная активность комплексов рутения(Ш) в катализе глюкозооксидазой из А. niger и Р. /итеи^иш
Комплекс в растворе кз, М-1с-1
ГО А. niger ГО Р. ^тс^отт
[Яи(Ъру)2 (И20)С1]2+ (0,71±0,10)х105 (1,00±0,00)х105
[Ки(рИеп)2С0з]+ (0,80±0,01)х105 (0,80±0,01)х105
[Ки(Ьру)2(№Э2)(Ы20)]2+ (0,70±0,01)х105 (1,10±0,01)х105
[Ки(р11ру)(р11еп)2]2+ (7,5±0,3)х106 (8,7±0,1)х103
[Ки(ашЬа)(Ъру)(ру)2]2+ (1,8±0,1)х106 (3,0±0,1)х105
[Ки((1тЬа)(Ьру)(МеС№)2] 2+ (2,0±0,1)х106 (4,0±0,0)х105
[Ки(рЬру)(рЬеп)(МеС№Ы 2+ (1,7±0,1)х106 (3,0±0,0)х105
[Ки(рЬру)(Ме2Ьру)(МеС№Ы2+ (2,5±0,1)х106 (4,0±0,1)х105
сферы размеры окисленной и восстановленной формы рутенациклов претерпевают меньшие изменения, что повышает их константы скорости самообмена и, как следствие, их медиаторные константы скорости [18]. Для фермента из А. niger теория подтверждается экспериментом (табл. 2). Однако в случае фермента из пеницилло-вого штамма был получен неожиданный эффект: медиа-торные константы скорости в случае комплексов второго типа оказались на два порядка ниже, чем для ГО из А. niger, в то время как для комплексов первого типа значительной разницы не наблюдалось.
Этот факт мы попытались объяснить с точки зрения специфических взаимодействий фермента и координационной сферы комплексов рутения. Например, наиболее
тип II
Рис. 4. Схема комплексов рутения(11) типов I и II
объемный и гидрофобный среди рассмотренных комплексов [Яи(рЬру)(рЬеп)2]2+ при окислении рутения должен характеризоваться наименьшей энергией реорганизации и, следовательно, наибольшей константой электронного переноса. В табл. 2 показано, что его константа к3, достигающая в случае фермента из А. niger величины порядка 10' М- с , для фермента из Р. /ытсы-losum уменьшается на три порядка. По-видимому, в последнем случае строение белка таково, что стеричес-кие затруднения и гидрофобность комплекса нивелируют эффект высоких скоростей самообмена молекулы медиатора и его электростатического притяжения к белку. Комплексы первого типа с меньшей по объму и более мягкой координационной сферой проявили себя менее активными медиаторами обеих ГО, но вместе с тем оказались толерантны к предполагаемой разнице структуры ферментов.
На основе литературных данных [19] была рассмотрена возможность влияния электростатических взаимодействий белка и медиатора. Мы предположили, что причина может заключаться в разнице зарядов белковых глобул. Изоэлектрофокусирование, проведенное для ГО из Р. funiculosum, показало, что препарат содержит две формы с р1 4.0, которая совпадает с р1 глюкозооксидазы из А. niger (5.5). Присутствие второй формы понижает в условиях эксперимента долю заряженной ГО в растворе. Вследствие этого, вероятно, снижается влияние электростатического взаимодействия медиатора и фермента на скорость электронного переноса в целом, и возрастает значение гидрофобных взаимодействий медиатора с апо-ферментом, а также геометрии молекулы рутениевого комплекса.
В заключение стоит отметить, что полученная из нового штамма плесени глюкозооксидаза обладает рядом
технических характеристик (повышенной температурной и рН стабильностью), расширяющих область ее применения в биотехнологии. Различие скоростей электрокаталитического окисления Б-глюкозы с учас-
тием комплексов рутения(11) и глюкозооксидазы из разных видов плесени указывает, по-видимому, на то, что структуры активных центров этих ферментов отличаются друг от друга.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Godfrey T., West S. (ed.). Industrial enzymology. 2nded. N.Y., 1996.
2. Wilson R., Turner A. P. F. // Biosens. Bioelectr. 1992. 7. C. 165.
3. Воробьева Л.И. Техническая микробиология. М., 1987.
4. Кретович В.Л. Введение в энзимологию. М., 1986.
5. Гулый М. Ф., Билот В. И., Пидопличко Н. М. Фермент глюкозо-
оксидаза и его применение. Киев, 1964.
6. Абалихина Т. А., Морозкин А. Д., Богданов В. П. // Биохимия.
1971. 36. C. 191.
7. Акулова В. Ф., Вайткявичюс Р. К., Куртинайтене Б. С. // При-
кладная биохимия и микробиология. 1978. 14. C. 377.
8. Куплетская М. Б., Кураков А. В. // Прикладная биохимия и мик-
робиология. 1999. 35. С. 160.
9. Давыдова М. Е. Глюкозооксидаза из P. funiculosum G-15: полу-
чение, свойства и перспективы практического применения. Дипломная работа. M., 2002.
10. Звягинцев Д. Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. M., 1987.
11. BradfordM. A. // Anal. Biochem. 1976. 72. C. 248.
12. Kenston A. S. // Abstracts of papers. 129th National meeting of the American Chemical Society, Dallas, TX, paper 31C, American Chemical Society. Washington, DC. 1956.
13. Bourdillon C., Demaille C., Moiroux J. // J. Am. Chem. Soc. 1993.
115. P. 2.
14. Ryabov A. D., Firsova Yu. N., Goral V. N., Sukharev V. S. // Inorganic Reaction Mechanisms. 2000. P. 1.
15. Курова В. С., Ершов А. Ю., Рябов А. Д. // Изв. РАН. Серия химическая. 2001. 10. C. 1766.
16. Ryabov A. D., Sukharev V. S., Alexandrova L., Le Lagadec R., PfefferM. // Inorg. Chem. 2001. 40. P. 6530.
17. Dubs R. V., Gahan L. R., Sargeson A. M. // Inorg. Chem. 1983. 22. P. 2523.
18. Marcus R. A., Sutin N. // Biochim. Biophys. Acta. 1985. 811. P. 265.
19. Zakeeruddin S. M., Fraser D. M., Nazeeruddin M.-K., GrutzelM. // J. Electroanal. Chem. 1993. 359. P. 125.
Поступила в редакцию 25.10.02
