CC BY
12
© Коллектив авторов, 2022
Кузнецова М.С.1, Терещенко В.П.1, Шевченко Ю.А.1, Фишер М.С.1, Курилин В.В.1, Алсаллум А.1, Алрхмун С.1, Акахори Я.2, Шику Х.1' 2, Сенников С.В.1
Фенотипические и функциональные особенности генерированных in vitro TCR-Т-клеток, специфичных к опухоль-ассоциированному антигену NY-ESO-1
1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 630099, г. Новосибирск, Российская Федерация
2 Университет Миэ, г. Цу, Япония
Резюме
Введение. Противоопухолевая активность Т-клеток несет в себе огромный потенциал для развития иммунотерапевтических схем лечения онкологических заболеваний. Новым витком в исследованиях противоопухолевого Т-клеточного иммунитета стала генная модификация, позволяющая получать популяцию клеток с Т-клеточным рецептором (TCR) заданной специфичности из гетерогенного пула Т-лимфоцитов. В настоящей работе с использованием гаммаретровирусного вектора, кодирующего TCR, специфичный к эпитопу опухоль-ассоциированного антигена NY-ESO-1, были получены NY-ESO-1-специфичные TCR-T-клетки, в условиях in vitro исследованы особенности их фенотипа, показана антиген-зависимая и противоопухолевая цитотоксическая активность.
Цель настоящего исследования - изучение фенотипических и функциональных особенностей генерированных in vitro TCR-Т-клеток, специфичных к опухоль-ассоциированному антигену NY-ESO-1.
Материал и методы. Фенотип трансдуцированных клеток исследовали с использованием проточной цитометрии по экспрессии маркеров клеток памяти (CD45RA и CD62L), активации и истощения (CD69, CD95, PD-1, TIM-3). Цитотоксический потенциал полученных клеток оценивали с использованием анализа высвобождения лактатдегидроге-назы в кондиционных средах от культивирования с клетками-мишенями опухолевых линий SK-Mel-37 и NW-Mel-38. Дополнительно после культивирования с клетками-мишенями оценивали экспрессию маркеров клеточной активации и цитотоксичности (4-1BB, CD69, CD40L, FasL) с помощью проточной цитометрии.
Результаты. Трансдуцированные NY-ESO-1-специфичные TCR-T-клетки были представлены преимущественно слабодифференцированными Т-лимфоцитами с высокой жизнеспособностью и по сравнению с нетрансдуцированными Т-лимфоцитами характеризовались сдвигом фенотипа в сторону клеток центральной и эффекторной памяти. Показан антиген-специфичный цитотоксический ответ при культивировании с клетками опухоли, экспрессирующими NY-ESO-1. При культивировании с линией SK-Mel-37 наблюдалось значительное повышение доли клеток, экспрессирующих CD40L и FasL, по сравнению с долей таковых в отсутствие клеток-мишеней, что подтверждает активацию эффекторных свойств трансдуцированных Т-клеток в ответ на антиген.
Заключение. Генерированные in vitro NY-ESO-1-специфичные TCR-T-клетки характеризуются менее дифференцированным фенотипом памяти и высоким уровнем жизнеспособности, обладают цитотоксическим потенциалом в отношении опухолевых линий, экспрессирующих NY-ESO-1.
Ключевые слова: TCR; TCR-T-клетки; NY-ESO-1; субпопуляции Т-клеток памяти; Т-клеточная активация; клеточная цитотоксичность
Для корреспонденции
Сенников Сергей Витальевич -доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии, главный научный сотрудник лаборатории клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: sennikovsv@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
Статья получена 20.07.2022. Принята в печать 26.08.2022.
Для цитирования: Кузнецова М.С., Терещенко В.П., Шевченко Ю.А., Фишер М.С., Курилин В.В., Алсаллум А., Алрхмун С., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Фенотипические и функциональные особенности генерированных in vitro TCR-Т-клеток, специфичных к опухоль-ассоциированному антигену NY-ESO-1. Иммунология. 2022; 43 (5): 536-547. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-536-547
Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 21-6500004). URL: https://rscf.ru/project/21-65-00004/
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Терещенко В.П., Курилин В.В., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В.; сбор и обработка материала - Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Терещенко В.П., Фишер М.С., Алсаллум А., Алрхмун С.; статистическая обработка данных - Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А.; написание текста - Кузнецова М.С.; редактирование - Кузнецова М.С., Сенников С.В.; утверждение окончательного варианта статьи - Сенников С.В.; ответственность за целостность всех частей статьи - Кузнецова М.С.
Kuznetsova M.S.1, Tereshchenko V.P.1, Shevchenko J.A.1, Fisher M.S.1, Kurilin V.V.1, Alsalloum A.1, Alrhmoun S.1, Akahori Y.2, Shiku H.1 2, Sennikov S.V.1
Phenotypic and functional features of in vitro generated TCR-T cells specific for the tumor-associated antigen NY-ESO-1
1 Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology of the Ministry of Science and High Education of Russian Federation, 630099, Novosibirsk, Russian Federation
2 Mie University, Tsu City, Japan
Abstract
Introduction. The antitumor activity of T cells holds great potential for the development of immunotherapeutic schemes for the treatment of oncological diseases. Gene modification has become a new milestone in studies of antitumor T-cell immunity, which makes it possible to obtain a population of cells with a T cell receptor (TCR) of a given specificity from a heterogeneous pool of T lymphocytes. In this work, using a gammaretrovirus vector encoding a TCR specific for the epitope of the tumor-associated NY-ESO-1 antigen, NY-ESO-1 specific TCR-T cells were obtained, the features of their phenotype were studied in vitro, and the antigen-dependent activation and antitumor cytotoxic activity.
Aim of the study - to research the phenotypic and functional features of in vitro generated TCR-T lymphocytes for the tumor-associated antigen NY-ESO-1.
Material and methods. The phenotype of transduced cells was studied using flow cytometry by expression of markers of memory cells (CD45RA and CD62L), activation and depletion (CD69, CD95, PD-1, TIM-3). The cytotoxic potential of the obtained cells was assessed using the analysis of the release of lactate dehydrogenase in conditioned media from cultivation with target cells of tumor lines SK-Mel-37 and NW-Mel-38. Additionally, after cultivation with target cells, the expression of markers of cell activation and cytotoxicity (4-1BB, CD69, CD40L, FasL) was assessed using flow cytometry.
Results. Transduced NY-ESO-1-specific TCR-T cells were predominantly poorly differentiated T-lymphocytes with high viability and were characterized by a phenotype shift towards central and effector memory cells compared to non-transduced T-lymphocytes. Shown antigen-specific cytotoxic response to cultivation with tumor cells positive for the expression of NY-ESO-1. When cultured with the SK-Mel-37 line, a significant increase in the proportion of cells expressing CD40L and FasL was observed compared to the proportion in the absence of target cells, which confirms the activation of the effector properties of the transduced T cells in response to the antigen.
Conclusion. In vitro generated NY-ESO-1-specific TCR-T cells are characterized by a poorly differentiated memory phenotype and a high level of viability, and have a cytotoxic potential against tumor lines expressing NY-ESO-1.
For correspondence
Sergey V. Sennikov -MD, PhD, Professor, Head of Molecular Immunology Lab., Chief Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., FSBSIRIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: sennikovsv@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
Keywords: TCR; TCR-T cells; NY-ESO-1; memory T cell subsets; T cell activation; cellular cytotoxicity
Received 20.07.2022. Accepted 26.08.2022.
For citation: Kuznetsova M.S., Tereshchenko V.P., Shevchenko J.A., Fisher M.S., Kurilin V.V., Alsalloum A., Alrhmoun S., Akahori Y., Shiku H., Sennikov S.V. Phenotypic and functional features of in vitro generated TCR-T lymphocytes specific for the tumor-associated antigen NY-ESO-1. Immunologiya. 2022; 43 (5): 536-47. DOI: https:// doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-536-547 (in Russian)
Funding. The study was supported by the grant of the Russian Science Foundation (project No. 21-65-00004). URL: https://rscf.ru/project/21-65-00004/
Conflict of interests. Authors declare no conflict of interests.
Authors' contributions. The concept and design of the study - Kuznetsova M.S., Shevchenko J.A., Teresh-chenko V.P., Kurilin V.V., Akahori Y., Shiku H., Sennikov S.V.; data collection and processing - Kuznet-sova M.S., Shevchenko J.A., Tereshchenko V.P., Fisher M.S., Alsalloum A., Alrkhmoun S.; statistical data processing -Kuznetsova M.S., Shevchenko J.A.; text writing - Kuznetsova M.S.; editing Kuznetsova M.S. Sennikov S.V.; approval of the final version of the article - Sennikov S.V.; responsibility for the integrity of all parts of the article - Kuznetsova M.S.
Введение
Развитие технологий генной модификации клеток человека привело к существенному прогрессу в области иммунотерапии онкологических заболеваний. Возможность изменения структуры или специфичности Т-клеточного рецептора (TCR) значительно расширила границы применимости и повысила эффективность подходов адоптивной Т-клеточной терапии [1, 2]. Многообещающих результатов в лечении B-клеточных лейкозов удалось достичь при использовании Т-клеток с химерным антигенным рецептором (Chimeric antigen receptor, CAR) благодаря тому, что CAR с высокой эффективностью распознает поверхностные антигены и приводит к запуску мощного специфичного иммунного ответа [3].
При этом, однако, для терапии солидных опухолей использование CAR-T-клеток остается малоэффективным в связи с отсутствием поверхностных молекул, подходящих на роль мишеней для CAR. MHC-независимый механизм распознавания антигена CAR-рецептором не позволяет отвечать на внутриклеточные антигены, коими в подавляющем большинстве случаев являются антигены солидных опухолей [4].
В этом отношении преимущество имеют технологии получения TCR-T-клеток, использующие генную модификацию для запуска экспрессии TCR заданной специфичности в Т-клетках, изначально специфичных к другим антигенным детерминантам. Такая модификация позволяет получать из гетерогенной популяции Т-клеток различных специфичностей большие количества Т-лимфоцитов, имеющих идентичный TCR, специфичный к выбранному внутриклеточному опухолевому антигену.
На сегодняшний день доступно множество способов доставки генетической конструкции, кодирующей антиген-специфичный TCR, включая невирусные системы -Sleeping Beauty и PiggyBac, основанные на использовании транспозонов, CRISPR-Cas9, TALEN и др. При этом, однако, получение ретровирусных векторов, коди-
рующих CAR или TCR, по-прежнему является наиболее часто используемым методом как в доклинических, так и в клинических исследованиях [5].
В настоящем исследовании с использованием метода гаммаретровирусной трансдукции получены TCR-T-клетки, специфичные к опухоль-ассоциированному антигену NY-ESO-1. В тестах in vitro проанализированы фенотип и эффекторные функции получаемых клеток для оценки их субпопуляционного состава и противоопухолевого потенциала. Антиген NY-ESO-1 относится к группе раково-тестикулярных антигенов, экспрессия которых имеет место только в иммунопривилегирован-ных органах человека, таких как яички и плацента.
Поскольку семенники и плацента не экспрессируют молекулы MHC, экспрессия NY-ESO-1 теряется в ходе сперматогенеза во время дифференцировки сперматид. Таким образом, данный антиген не экспрессируется в нормальных здоровых тканях, что особенно важно в контексте противоопухолевой терапии, поскольку любой терапевтический потенциал против NY-ESO-1 не будет ограничен последствиями повреждения нормальной ткани [6].
В процессе опухолевого роста появление экспрессии NY-ESO-1 в неопластических клетках является следствием эпигенетического процесса, состоящего из строго контролируемого рекрутирования и последовательного взаимодействия гистондеацетилазы, гистон-метилтрансферазы, ДНК-метилтрансферазы и ряда транскрипционных факторов [7]. Экспрессия NY-ESO-1 характерна для целого ряда опухолей, включая нейро-бластому, миелому, метастатическую меланому, синовиальную саркому, рак мочевого пузыря, рак пищевода, печеночно-клеточный рак, злокачественные опухоли головы и шеи, рак молочной железы и др. [8].
В настоящем исследовании получены TCR-T-клетки, специфичные к пептиду внутриклеточного антигена NY-ESO-1, в значительной степени представленного на поверхности клеток различных злокачественных карцином в комплексе с молекулами МНС. Представлены результаты анализа жизнеспособности, фенотипа, уровня активации и дифференцировки, а также цитотоксичес-кого потенциала исследуемых клеток in vitro.
Материал и методы
Ретровирусные частицы. Для получения TCR-T-клеток, специфичных к пептиду pNY-ESO-1157_165 (SLLMWITQV), лимфоциты человека трансдуцировали вирусными частицами, полученными на базе Высшей школы медицины Университета Миэ (Япония) под руководством профессора Х. Шику. Для получения ви-рионов использовался гаммаретровирусный вектор, кодирующий TCR, специфичный к указанному эпитопу NY-ESO-1. Схема, отражающая структуру вектора, представлена на рис. 1. Вектор был сконструирован и предоставлен профессором Х. Шику (Высшая школа медицины Университета Миэ, Япония).
Получение NY-ESO-1-специфичных TCR-T-лим-фоцитов. Мононуклеарные клетки периферической крови (МНК ПК) получали стандартным методом центрифугирования венозной крови от 6 условно здоровых доноров на градиенте плотности фиколла-урографина. Забор периферической крови здоровых взрослых доноров был одобрен локальным этическим комитетом НИИФКИ Минобрнауки России, решение №139 от 30.05.2022 г.
В лунках 12-луночных культуральных планшетов (TPP, Швейцария) сорбировали реактивы, необходимые для стимуляции пролиферации Т-лимфоцитов: 25 мг/мл ретронектина (Takara Bio, Япония) и 5 мг/мл anti-CD3 антител (Biolegend, США). Выделенные МНК культивировали в концентрации 0,5 • 106 клеток/мл в течение 3 суток в 12-луночных планшетах, содержащих ретро-нектин и антитела к CD3 в среде GT-T551 (Takara Bio, Япония) с добавлением 300 ЕД/мл ИЛ-2 (Ронколейкин, Россия) и 0,6 % сыворотки группы AB.
На 2-е и 3-и сутки культивирования производили смену половины объема культуральной среды. Для трансдукции в лунки 24-луночных планшетов, предварительно обработанных ретронектином (25 мг/мл), добавляли по 1 мл раствора ретровируса, размороженного на водяной бане при 37 °С и затем разведенного в 4 раза. Планшет с раствором ретровируса центрифугировали в течение 2 ч при температуре 32 °C при 2000 g. Далее из лунок удаляли все жидкое содержимое и добавляли по 1,5-2 • 105 клеток периферической крови, праймированных антителами к CD3. Фракция aнти-CD3-праймированных клеток к этапу трансдукции на 90 % представляла собой CD3+-r-лимфоциты. Планшеты с внесенными суспензиями клеток центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин при температуре 32 °C. После центрифугирования планшеты с клетками помещали во влажную атмосферу с содержанием 5 % CO2 и температурой 37 °С для инкубирования клеток, прошедших первый раунд трансдукции.
На следующие сутки после первого раунда проводили второй раунд трансдукции: клетки переносили в лунки новых 24-луночных планшетов с ретровирус-ными частицами и центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин при температуре 32 °C, после чего инкубировали во влажной атмосфере при 37 °C с содержанием
NY-ESO-1 TCR
SacII
Xhol
LTR LTR
TCR beta P2A TCR alpha
pMS3
Рис. 1. Строение гаммаретровирусного вектора, кодирующего Т-клеточный рецептор, специфичный к эпитопу NY-ESO-1
5 % CO2 в течение 5 ч. По истечении указанного времени клетки переносили в новые 6-луночные планшеты (TPP, Швейцария) в объеме 3,5 мл культуральной среды GT-T551 на лунку с добавлением 300 ЕД/мл ИЛ-2. На 9-10-е сутки трансдуцированные клеточные фракции анализировали методом проточной цитометрии для оценки эффективности трансдукции и фенотипа. На 11-е сутки от начала протокола трансдуцированные клетки подвергали совместному культивированию с клетками опухолевых линий человека, затем анализировали цитотоксический потенциал в тестах in vitro.
Фенотипирование клеток, прошедших трансдук-цию гаммаретровирусным вектором. На 9-10-е сутки от начала протокола клетки, прошедшие 2 раунда трансдукции гаммаретровирусным вектором, кодирующим Т-клеточный рецептор, специфичный к эпитопу NY-ESO-1, анализировали с помощью проточной ци-тометрии с предварительной меткой антителами: анти-СБ3-АР700, анти-СБ4-Ву570, анти-СБ8-РеСу7, анти-СБ45КА-Ву711, анти-СБ62Ь-АР488, анти-СБ95 (Fas)-PerCP-Cy5.5, анти-СБ69-АР647, анти-РБ-1-Ву421, анти-Т1М3-АРС/Су7 (Biolegend, США), а также МНС-тетрамерами, специфичными к исследуемому NY-ESO-1-TCR, конъюгированными со Streptavidin-PE (Biolegend, США), для идентификации NY-ESO-1-специфичных Т-клеток. МНС-тетрамеры были предоставлены профессором Х. Шику (Высшая школа медицины Университета Миэ, Япония).
Для идентификации клеток с поврежденной мембраной исследуемые пробы также метили витальным красителем Zombie Aqua (Biolegend, США). В образцы клеток добавляли антитела в количествах, рекомендованных производителем, и МНС-тетрамеры в разведении стокового раствора 1 : 100, после чего клетки с антителами и тетрамерами инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 20 мин.
По истечении времени инкубации клетки отмывали в 2 мл PBS c NaN3, клеточные осадки ресуспендировали в 200 мкл PBC c NaN3 и анализировали на проточном цитометре Attune NxT (Thermo Fisher, США). Для построения компенсационной матрицы использовали бусы Compensation Beads (Thermo Fisher, США), предварительно инкубированные с используемыми в анализе флуорохром-конъюгированными антителами для проточной цитометрии. Гейтирование популяций, позитивных по исследуемым маркерам, производили с использованием контролей FMO (fluorescent-minus-one).
Анализ противоопухолевой эффекторной функции. Для оценки цитотоксического потенциала исследуемые клетки, прошедших 2 раунда вирусной транс-дукции, подвергали совместному культивированию с клетками опухолевых линий человека, позитивными и негативными по экспрессии антигена NY-ESO-1. В частности, в качестве клеток-мишеней, несущих целевой антиген, были использованы линии клеток мела-номы человека NW-Mel-38 и SK-Mel-37, негативным контролем служила линия клеток рака толстой кишки человека HCT-116 (NY-ESO-1-).
Совместное культивирование клеток-эффекторов с клетками-мишенями проводили в лунках 96-лу-ночного плоскодонного культурального планшета (TPP, Швейцария), для этого по 4 • 103 клеток соответствующих опухолевых линий высевали в лунку планшета и инкубировали в среде RPMI-1640 (Био-лот, Россия), дополненной 10% FCS (Hyclone, США), 2 мМ L-глутамина (Биолот, Россия), 5 • 10-5 мМ мер-каптоэтанола (Sigma, США), 25 мМ HEPES (Sigma, США), 80 мкг/мл гентамицина (KRKA, Словения) и 100 мкг/мл ампициллина (Синтез, Россия), в течение 16-17 ч для обеспечения адгезии опухолевых клеток к пластику.
По истечении указанного времени инкубации из лунок забирали всю среду и добавляли по 20 • 103 клеток (соотношение эффектор : мишень 5 : 1) трансдуцирован-ных и нетрансдуцированных (контроль) культур в среде RPMI-1640, дополненной 10 % FCS, 2 мМ L-глутамина, 5 • 10-5 мМ меркаптоэтанола, 25 мМ HEPES, 80 мкг/мл гентамицина и 100 мкг/мл ампициллина. После 8 ч культивирования с клеткам-мишенями кондиционные среды от совместных культур анализировали с использованием коммерческого набора CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, США) согласно инструкции производителя.
Фенотипирование по маркерам активации и цитотоксичности. Для исследования уровня антиген-зависимой активации и цитотоксического потенциала трансдуцированных Т-лимфоцитов исследуемые Т-клетки культивировали совместно с описанными выше клетками-мишенями в соотношении эффектор : мишень 10 : 1 в течение 4-5 ч, после чего экспрессию маркеров активации и цитотоксичности анализировали с помощью проточной цитометрии.
Для мечения NY-ESO-1-специфичных клеток использовались МНС-тетрамеры, а также монокло-нальные антитела для проточной цитометрии анти-CD3-AF700, анти-CD8-PeCy7, анти-Ш4^570, CD137(4-1BB)-BV711™, анти-CD154(CD40L)-PerCP/ Cy5.5, анти-Ш69^647, анти-CD178(FasL)-BV421™ (Biolegend, США). Для построения компенсационной матрицы использовали бусы Compensation Beads, предварительно инкубированные с используемыми в анализе флуорохром-конъюгированными антителами для проточной цитометрии. Гейтирование популяций, позитивных по исследуемым маркерам, производили с использованием контролей FMO.
Статистическую обработку данных выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, США). Полученные данные проверяли на нормальность тестами Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. Статистически значимые различия между выборками оценивались с помощью дисперсионного анализа ANOVA с применением критериев Сидака или Тьюки для множественного сравнения. Данные представлены в виде медианы и межквартиль-ного интервала, минимума и максимума. Различия считались достоверными при р < 0,05.
Результаты
Эффективность трансдукции и фенотип трансдуцированных клеток
Цитометрический анализ эффективности транс-дукции Т-клеток гаммаретровирусным вектором проводился путем оценки доли клеток, связавшихся с антиген-специфичными окрашивающими реагентами - МНС-тетрамерами, аффинными к NY-ESO-1-специфичному T-клеточному рецептору. Таким образом, эффективность трансдукции оценивалась по относительному количеству Т-клеток, меченных NY-ESO-1-тетрамерами. Анализ показал эффективность трансдукции, равную в среднем 22,13 ± 7,11 % (среднее значение и стандартное отклонение, n = 6), с минимальным значением 13,40 % и максимумом 33,5 %. Жизнеспособность трансдуцированных клеток составила порядка 95,4 %, при этом трансдукция значимо не повлияла на уровень жизнеспособности. Схема гейтирования показана на рис. 2.
На рис. 3 представлены результаты оценки фенотипа трансдуцированных NY-ESO-1-специфичных TCR-T-клеток (здесь и далее - клеток, соответствующих событиям гейта, позитивного по флуоресценции в канале Tetramer-PE) в сравнении с непрошедшими трансдук-цию Т-лимфоцитами (клетки, соответствующие событиям гейта, негативного по флуоресценции в канале Tetramer-PE) с точки зрения уровня дифференцировки и маркеров клеток памяти.
В частности, 48,43 ± 4,75 % клеток (среднее значение и стандартное отклонение, n = 6) представляли собой CD45RA+CD62L+-T-клетки, соответствующие популяциям наивных Т-клеток (TN) и Т-клеток памяти со свойствами стволовых клеток (TSCM), 22,85 ± 4,21 % (среднее значение и стандартное отклонение, n = 6) имели фенотип Т-клеток центральной памяти (CD45RACD62L+; TCM), 13,03 ± 1,44 % клеток характеризовались фенотипом Т-клеток эффекторной памяти (CD45RA-CD62L-; TEM), 14,69 ± 2,65 % клеток (среднее значение и стандартное отклонение, n = 6) являлись дважды негативными по экспрессии CD45RA и CD62L, представляя таким образом субпопуляцию короткоживущих терминально-дифференцированных Т-лимфоцитов (TEMRA). При этом сравнение с популяцией нетрансдуцированных Т-лимфоцитов (клетки, соответствующие событиям гейта non-transdCD3,
О
Singlets Lymphocytes
FSC-A :: FSC-A
x
FSC-H :: FSC-H
FSC-A :: FSC-A x
SSC-A :: SSC-A
Comp-VL2-A :: Live-dead-ZA-A
x
SSC-A :: SSC-A
Э
-A
èi
С
C
I
Jh £
L
-V omp-
o C
106
105
104
103 -
о 3
-103
Live lymph
104
1 "'I
106
Э
Live lymph
106
105
104 -
Transduced CD3 0,17
103
0 3
-103
J8 non-transd CD3 •лчя99,1
104
106
\
105
V
m
104
D
C
103
L0
-V 0 pI -103
C
Comp-RL2-A :: CD3-Alexa Fluor 700-A
Э
Transduced CD3
Transduced CD3
Transduced CD3
1 62L + 45RA + CD3 . 62L + 45RA + CD3
77,5 • . 9,72
'■ ii ШВ0---'
. . ' з JS ядЩ^Щ'-?:.
ш ш Bsik'-'
-ЩёШ* Щйк',:'.
62L - RA - CD3 . 62L + 45RA - CD3
11,4 1,40
250 h
200
150
C
100
50
TIM-3 + CD3 transd PD1 + TIM-3 + CD3
0,04 0
PD1 CD3 transd
p- 4,04
щи.........— ........1—........
0 103 104 105 Comp-BL1-A :: CD62L -Alexa Fluor 488-A
0 103
104
105
103
104
105
Comp-RL1-A :: CD69 -Alexa Fluor 647-A
Comp-VL1-A :: PD-1 - BV421-A
0
0
0
0
Рис. 2. Схема гейтирования КУ-Е8О-1-специфичных ТСЯ-Т-клеток для оценки эффективности трансдукции и фенотипа получаемых клеток. Представленные диаграммы получены для одного из исследуемых образцов и являются примером результатов цитометрического анализа
NY-ESO-1-TCR+
NY-ESO-1-TCR-
-=-1
***
CD45RA+CD62L+ (TN/TSCM-клетки) CD45RA-CD62L+ (TCM) I CD45RA-CD62L- (TEM) CD45RA+CD62L- (TEMRA)
Рис. 3. Субпопуляционный состав in-vitro-генерированных NY-ESO-1-специфичных TCR-T-лимфоцитов. Данные представлены в виде среднего значения (n = 6) Скобками отмечены статистически значимые отличия. Стандартный two-way ANO VA, критерий множественных сравнений Сидака; *** - p < 0,0005.
см. рис. 2Б) показало статистически значимые различия в содержании субпопуляций СБ45КА+СБ62Ь+, Т и Т
СМ ЕМ
Анализ функциональных маркеров выявил, что исследуемые Т-лимфоциты характеризуются высокой долей СБ95+-клеток (88,9 ± 10,2 % для трансдуцированных клеток, 78,3 ± 15,7 % для нетрансдуцированных клеток, среднее и стандартное отклонение, п = 6), а также значительной долей клеток, экспрессирующих маркер ранней активации СБ69 (58,4 ± 28,5 % для трансдуцированных клеток, 61,0 ± 28,6 % для нетрансдуцированных клеток, среднее и стандартное отклонение, п = 6) (рис. 4).
Относительное количество Т1М-3+- и РБ-1+-клеток не превышало 3 % в популяции трансдуцированных клеток и значимо не отличалось от такового в популяции нетрансдуцированных Т-лимфоцитов (рис. 5).
Противоопухолевая цитотоксическая активность NY-ESO-1-специфичных TCR-T-лимфоцитов in vitro
Анализ цитотоксичности исследуемых культур выявил статистически значимо более высокий уровень цитотоксического ответа против клеточных линий, экс-прессирующих целевой антиген, по сравнению с таковым против линии, негативной по экспрессии NY-ESO-1 (рис. 6). Не выявлено значимых отличий между уровнем цитотоксичности в ответ на линию NW-MEL-38 и на линию SK-MEL-37.
Результаты анализа экспрессии маркеров цитоток-сичности и активации на исследуемых клетках после совместного культивирования с опухолевыми линиями клеток представлены на рис. 7. Для маркера CD 154 (CD40L) показано статистически значимое повышение количества позитивных клеток, прошедших транс-дукцию и несущих NY-ESO-1-специфичный TCR, по сравнению с нетрансдуцированными NY-ESO-1-TCR-негативными Т-клетками. При этом значимое отличие в доле CD40L+NY-ESO-1-TCR+-Т-клеток после сокультивирования с клетками линии SK-Mel-37 по сравнению с таковой для NY-ESO-1-TCR+-Т-клеток без мишени, указывает на антиген-специфичную природу повышения доли клеток, экспрессирующих данный маркер. Показано также статистически значимое повышение доли клеток, экспрессирующих FasL, в культуре NY-ESO-1-TCR+-Т-клеток после сокульти-вирования с клетками линии SK-Mel-37 по сравнению с группой NY-ESO-1-TCR+-Т-клеток, не культивированных с клетками-мишенями. В целом, можно отметить тенденцию к увеличению доли позитивных клеток в ответ на культивирование с клетками линии SK-Mel-37 по сравнению с таковой в других исследуемых выборках (в ответ на культивирование с NW-MEL-38, с HCT-116, а также без культивирования с опухолевой линией) что справедливо для всех исследуемых маркеров.
CD95 CD69
Рис. 4. Относительное содержание СБ95+- и СБ69+-клеток в популяциях трансдуцированных (КУ-ЕБО-1+) и нетрансдуцированных (МУ-ЕБО-1") Т-лимфоцитов (п = 6)
Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала, минимума и максимума значений.
ОТ-Е80-1+РБ-1+ ОТ-Е80-1+Т1М3+ ОТ-Е80-ГРБ-1+ ОТ-Е80-ГТ1М3+
Рис. 5. Относительное содержание Т1М-3+- и РБ-1+-Т-лим-фоцитов среди трансдуцированных (КУ-ЕБО-1+) и нетрансду-цированных (КУ-ЕБО-1") Т-клеток (п = 6) Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала, минимума и максимума значений.
60
g 40
о х т
§20 Я
SK-Mel-37 (+) NW-Mel-38 (+)
HCT-116 (-)
Рис. 6. Цитотоксичность трансдуцированных клеток против клеточных линий, позитивных (№Мг-Ме1-38 и БК-Ме1-38) и негативных (НСТ-116) по экспрессии антигена КУ-ЕБО-1 (п = 6) Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала, минимума и максимума. Скобками указаны статистически значимые отличия; * -р <0,05.
а
0
60-,
50
40
а
о
20
10
J.
□ TCR-T без мишени
■ TCR-T + SK-Mel-37 (+)
□ TCR-T + NW-Mel-38 (+)
■ TCR-T + HCT-116 (-)
Контр без мишени I Контр + NW-Mel-38 (+) Контр + SK-Mel-37 (+) I Контр + HCT-116 (-)
X
m
4-1BB+
CD40L+
CD69+
FasL
Рис. 7. Экспрессия маркеров активации и цитотоксичности на поверхности NY-ESO-1-специфичных ТCR-T-лимфоцитов после сокультивирования с опухолевыми клетками (n = 6)
TCR-T без мишени - трансдуцированные NY-ESO-1-специфичные TCR-T-клетки без сокультивирования с опухолевыми клетками; TCR-T + SK-Mel-37(+) - трансдуцированные NY-ESO-1-специфичные TCR-T-клетки, культивированные с клетками линии SK-Mel-37, экспрессирующей антиген NY-ESO-1; TCR-T + NW-Mel-38(+) - трансдуцированные NY-ESO-1-специфичные TCR-T-клетки, культивированные с клетками линии NW-Mel-38, экспрессирующей антиген NY-ESO-1; TCR-T + HCT-116(-) - трансдуцированные NY-ESO-1-специфичные TCR-T-клетки, культивированные с клетками линии HCT-116, негативной по экспрессии NY-ESO-1; контр без мишени - трансдуцированные NY-ESO-1-специфичные TCR-T-клетки без сокультивирования с опухолевыми клетками; контр + SK-Mel-37(+) - нетрансдуцированные T-клетки, культивированные с клетками линии SK-Mel-37, экспрессирующей антиген NY-ESO-1; контр + NW-Mel-38(+) - нетрансдуцированные T-клетки, культивированные с клетками линии NW-Mel-38, экспрессирующей антиген NY-ESO-1; контр + HCT-116(-) - нетрансдуцированные T-клетки, культивированные с клетками линии HCT-116, негативной по экспрессии NY-ESO-1.
Стандартный two-way ANOVA, критерий множественных сравнений Тьюки. Скобками отмечены статистически значимые различия; * -p < 0,05; ** - p < 0,005; *** - p < 0,0005.
ft*
а
I 30
0
Обсуждение
В настоящем исследовании были проанализированы in vitro популяции NY-ESO-1-специфичных TCR-T-клеток, полученные с использованием транс-дукции гаммаретровирусным вектором, кодирующим NY-ESO-1-специфичный TCR. В конечном счете все исследования, направленные на получение противоопухолевых Т-лимфоцитов, ставят перед собой задачу оценить применимость разрабатываемого подхода для адоптивной терапии злокачественных опухолей. Адоптивная Т-клеточная терапия рака зарекомендовала себя как перспективный подход в иммунотерапии онкологических заболеваний [9]. При этом интерес к подходам с использованием генно-модифицированных Т-клеток, очевидно, обусловлен значительным расширением терапевтических возможностей Т-клеточных препаратов, ранее ограниченных естественным функционалом эф-фекторных иммунокомпетентных клеток.
В контексте терапии солидных опухолей именно ключевым преимуществом TCR-T-клеточных технологий по сравнению с подходами, использующими CAR-Т-клетки, является возможность использования внутриклеточных антигенов в качестве мишеней для терапии [10]. Перенесенные в клетку генно-инженерным путем Т-клеточные рецепторы распознают опухоль-ассоциированные антигены по естественному биологическому пути, т. е. через активацию а-и р-цепей CD3, с необходимостью презентации антигена молекулами MHC. Следовательно, могут распознаваться как поверхностные, так и внутриклеточные антигены, что позволяет использовать широкий спектр мишеней [11].
На сегодняшний день основным методом оценки гетерогенности Т-клеточного пула периферической крови с точки зрения степени дифференцировки является проточная цитометрия [12]. Основным фенотипическим признаком Т-клеток памяти принято считать появление изоформы CD45RO+ взамен изоформы CD45RA+ [13]. При этом экспрессия двух данных маркеров считается взаимоисключающей, в связи с чем в панель зачастую включают один из двух маркеров [13, 14].
В комбинации CD45RO+ или CD45RA+ используют молекулы CD62L и CCR7, опосредующие хоминг клеток в лимфоидные органы [13-15]. Следует отметить, что на сегодняшний день нет единых общепринятых фенотипических критериев разделения клеток памяти на субпопуляции. Полученные в работе NY-ESO-1-специфичные TCR-T-клетки характеризуются значимым снижением содержания наивных Т-клеток и повышением доли Т-клеток центральной и эффекторной памяти. Такой эффект позволяет предположить, что трансдукция гаммаретровирусным вектором в совокупности с тоническим CD3-сигналингом, которым может сопровождаться повышение поверхностной экспрессии TCR [16], приводит к запуску процессов дифференци-ровки T- лимфоцитов.
При этом, что немаловажно, значительная доля полученных клеток сохранила менее дифференцированный
фенотип, поскольку известно, что в ряду от наивных до терминально-дифференцированных Т-лимфоцитов с увеличением степени зрелости снижается способность к самоподдержанию и пролиферации Т-клеток [14]. Между тем множеством клинических исследований показано, что успешность адоптивной Т-клеточной терапии во многом определяется не столько количеством эффекторных клеток с наивысшими показателями цитотоксичности, сколько жизнеспособностью введенных Т-клеток in vivo [17-19].
Важным функциональным признаком получаемых NY-ESO-1-специфичных TCR-T-лимфоцитов является также повышенное содержание клеток, экспрессирую-щих маркер CD95. Данная молекула, известная также как рецептор клеточной гибели Fas, является маркером дифференцировки и активации Т-клеток и зачастую используется в качестве маркера, отличающего субпопуляцию наивных Т-лимфоцитов от Т-клеток памяти со свойствами стволовых [14, 20]. При этом современные исследования показали, что более верным является описание рецептора Fas не как исключительно про-апоптотической молекулы, а как бифункционального сигнального рецептора с тканеспецифичными функциями, способного генерировать как про-, так и анти-апоптотические сигналы в зависимости от клеточного микроокружения [21]. Было обнаружено, в частности, что CD95 влияет на процессы пролиферации, диффе-ренцировки и миграции, а также на продукцию цитоки-нов в различных типах гемопоэтических и негемопоэ-тических клеток [21].
Повышение доли клеток, экспрессирующих поверхностный маркер CD40L, наблюдаемое в популяции TCR-T-клеток после культивирования с клетками линии SK-Mel-37, по сравнению с таковой без предъявления клеток-мишеней, также указывает на антиген-зависимую активацию исследуемых Т-клеток: выраженная транзиентная экспрессия CD40L подробно описана для CD4+-лимфоцитов в ответ на антигенную активацию. Однако рядом современных исследований подтверждено также, что экспрессия CD40L на CD8+-лимфоцитах способствует пролиферации и дифференцировке как CD40L-экспрессирующих CD8+-лимфоцитов, так и сторонних эффекторных CD8+-лимфоцитов, опосредованно через участие дендритных клеток [22].
Таким образом, полученные NY-ESO-1-специфичные TCR-Т-клетки характеризуются преимущественно фенотипом слабо дифференцированных Т-лимфоцитов и проявляют цитотоксическую активность в отношении опухолевых линий, экспрессирующих целевой антиген. Эффективность гаммаретровирусной трансдукции клеток составила порядка 22 %, при этом трансдуцированные клетки сохранили высокий уровень жизнеспособности, обнаружив сдвиг фенотипа в сторону клеток центральной и эффекторной памяти. В ответ на предъявление клеток-мишеней наблюдалось значимое повышение доли активированных Т-лимфоцитов, причем активация происходила антиген-зависимым путем, на что указывает более выраженная активация NY-ESO-1-
специфичных TCR-T-клеток в ответ на совместное культивирование с NY-ESO-1-экспрессирующими опухолевыми клетками.
Заключение
В настоящем исследовании был проведен анализ in vitro фенотипа и эффекторных функций NY-ESO-1-специфичных TCR-T-клеток, полученных путем гамма-ретровирусной трансдукции мононуклеарных клеток периферической крови человека. Результаты исследований показали высокий уровень жизнеспособности полученных клеток, а также влияние трансдукции на
сдвиг фенотипа Т-лимфоцитов в сторону активированных Т-клеток памяти. Несмотря на невысокий уровень содержания NY-ESO-1 -специфичных TCR-T-клеток в культуре лимфоцитов, подвергнутых 2 раундам гамма-ретровирусной трансдукции, полученная культура клеток демонстрирует выраженную способность к генерации цитотоксического ответа против опухолевых клеток антиген-зависимым путем. В совокупности полученные результаты свидетельствуют о способности получаемых клеток к противоопухолевой реактивности и указывают на целесообразность продолжения исследований данного типа клеток in vivo.
■ Литература
1. Manfredi F., Cianciotti B.C., Potenza A., Tassi E., Noviello M., Biondi A., Ciceri F., Bonini C., Ruggiero E. TCR redirected T cells for cancer treatment: achievements, hurdles, and goals. Front. Immunol. 2020; 11: 1689. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.01689
2. Киселевский М.В., Чикилева И.О., Ситдикова С.М., Власенко Р.Я., Караулов А.В. Перспективы применения генетически модифицированных лимфоцитов с химерным Т-клеточным рецептором (CAR-T-клеток) для терапии солидных опухолей. Иммунология. 2019; 40 (4): 48-55. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-140064
3. Nair R., Westin J. CAR T-cells. Adv. Exp. Med. Biol. 2020; 1244: 215-33. DOI: https://doi.org/10.1007/978-3-030-41008-7_10
4. Titov A., Zmievskaya E., Ganeeva I., Valiullina A., Petukhov A., Rakhmatullina A., Miftakhova R., Fainshtein M., Rizvanov A., Bulatov E. Adoptive immunotherapy beyond CAR T-cells. Cancers (Basel). 2021; 13 (4): 743. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers13040743
5. Edes I., Clauss J., Stahn R., Japp A.S., Lorenz F.K.M. TCR and CAR engineering of primary human T cells. Methods Mol. Biol. 2022; 2521: 85-93. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2441-8_5
6. Gnjatic S., Nishikawa H., Jungbluth A.A., Gure A.O., Ritter G., Jager E., Knuth A., Chen Y.T., Old L.J. NY-ESO-1: review of an immunogenic tumor antigen. Adv. Cancer Res. 2006; 95: 1-30. DOI: https://doi. org/10.1016/S0065-230X(06)95001-5
7. Raza A., Merhi M., Inchakalody V.P., Krishnankutty R., Relecom A., Uddin S., Dermime S. Unleashing the immune response to NY-ESO-1 cancer testis antigen as a potential target for cancer immunotherapy. J. Transl. Med. 2020; 18 (1): 140. DOI: https://doi.org/10.1186/s12967-020-02306-y
8. Терещенко В.П., Сенников С.В. Опухолевые ксенотрансплан-таты как модель для доклинических испытаний генетически модифицированных клеточных препаратов. Иммунология. 2021; 42 (6): 730-41. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-730-741
9. Leon E., Ranganathan R., Savoldo B. Adoptive T cell therapy: boosting the immune system to fight cancer. Semin. Immunol. 2020; 49: 101437. DOI: https://doi.org/10.1016/j.smim.2020.101437
10. Rath J.A., Arber C. Engineering strategies to enhance TCR-based adoptive T cell therapy. Cells. 2020; 9 (6): 1485. DOI: https://doi. org/10.3390/cells9061485
11. Flynn J., Gorry P. Flow cytometry analysis to identify human CD4+ T cell subsets. Methods Mol. Biol. 2019; 2048: 15-25. DOI: https:// doi.org/10.1007/978-1-4939-9728-2_2
12. Saxena A., Dagur P.K., Biancotto A. Multiparametric flow cytometry analysis of naive, memory, and effector T cells. Methods Mol. Biol. 2019; 2032: 129-40. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9650-6_8
13. Mahnke Y.D., Brodie T.M., Sallusto F., Roederer M., Lugli E. The who's who of T-cell differentiation: human memory T-cell subsets. Eur. J. Immunol. 2013; 43 (11): 2797-809. DOI: https://doi.org/10.1002/ eji.201343751
14. Кудрявцев И.В. Т-клетки памяти: основные популяции и стадии дифференцировки. Российский иммунологический журнал. 2014; 8 (17): 947-64.
15. Myers D.R., Zikherman J., Roose J.P. Tonic Signals: Why Do Lymphocytes Bother? Trends Immunol. 2017; 38 (11): 844-57. DOI: https://doi.org/10.1016/j.it.2017.06.010
16. Gattinoni L., Powell D.J., Rosenberg S.A., Restifo N.P. Adoptive immunotherapy for cancer: building on success. Nat. Rev. Immunol. 2006; 6 (5): 383-93. DOI: https://doi.org/10.1038/nri1842
17. June C.H. Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic. J. Clin. Invest. 2007; 117 (6): 1466-76. DOI: https://doi.org/10.1172/JCI 32446
18. Ramirez N., Beloki L., Ciaiirriz M., Rodriguez-Calvillo M., Es-cors D., Mansilla C., Bandres, E., Olavarria E. Impact of T cell selection methods in the success of clinical adoptive immunotherapy. Cell. Mol. Life. Sci. (CMLS). 2013; 71 (7): 1211-24. DOI: https://doi.org/10.1007/ s00018-013-1463-5
19. Wang Y., Qiu F., Xu Y., Hou X., Zhang Z., Huang L., Wang H., Xing H., Wu S. Stem cell-like memory T cells: The generation and application. J. Leukoc. Biol. 2021; 110 (6): 1209-23. DOI: https://doi. org/10.1002/JLB.5MR0321-145R
20. Strasser A., Jost P.J., Nagata S. The many roles of FAS receptor signaling in the immune system. Immunity. 2009; 30 (2): 180-92. DOI: https://doi.org/10.1016/j.immuni.2009.01.001
21. Paulsen M., Janssen O. Pro- and anti-apoptotic CD95 signaling in T cells. Cell Commun. Signal. 2011; 9: 7. DOI: https://doi. org/10.1186/1478-811X-9-7
22. Laman J.D., Claassen E., Noelle R.J. Functions of CD40 and Its Ligand, gp39 (CD40L). Crit. Rev. Immunol. 2017; 37 (2-6): 371-420. DOI: https://doi.org/10.1615/critrevimmunol.v37.i2-6.100
■ References
1. Manfredi F., Cianciotti B.C., Potenza A., Tassi E., Noviello M., Biondi A., Ciceri F., Bonini C., Ruggiero E. TCR redirected T cells for cancer treatment: achievements, hurdles, and goals. Front. Immunol. 2020; 11: 1689. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.01689
2. Kiselevsky M.V., Chikileva I.O., Sitdikova S.M., Vlasenko R.Ya., Karaulov A.V. Prospectives of application of the genetically modified lymphocytes with chimeric T-cell receptor (CAR-T-cells) for the therapy of solid tumors. Immunologiya. 2019; 40 (4): 48-55. DOI: https://doi. org/10.24411/0206-4952-2019-140064 (in Russian)
3. Nair R., Westin J. CAR T-cells. Adv. Exp. Med. Biol. 2020; 1244: 215-33. DOI: https://doi.org/10.1007/978-3-030-41008-7_10
4. Titov A., Zmievskaya E., Ganeeva I., Valiullina A., Petukhov A., Rakhmatullina A., Miftakhova R., Fainshtein M., Rizvanov A., Bulatov E. Adoptive immunotherapy beyond CAR T-cells. Cancers (Basel). 2021; 13 (4): 743. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers13040743
5. Edes I., Clauss J., Stahn R., Japp A.S., Lorenz F.K.M. TCR and CAR engineering of primary human T cells. Methods Mol. Biol. 2022; 2521: 85-93. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2441-8_5
6. Gnjatic S., Nishikawa H., Jungbluth A.A., Gure A.O., Ritter G., Jager E., Knuth A., Chen Y.T., Old L.J. NY-ESO-1: review of an immunogenic tumor antigen. Adv. Cancer Res. 2006; 95: 1-30. DOI: https://doi. org/10.1016/S0065-230X(06)95001-5
7. Raza A., Merhi M., Inchakalody V.P., Krishnankutty R., Relecom A., Uddin S., Dermime S. Unleashing the immune response to NY-ESO-1 cancer testis antigen as a potential target for cancer immunotherapy. J. Transl. Med. 2020; 18 (1): 140. DOI: https://doi.org/10.1186/s12967-020-02306-y
8. Tereshchenko V.P., Sennikov S.V. Tumor xenografts as the model for a preclinical trials of genetically modified cell therapy. Immunologiya. 2021; 42: 730-41. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-730-741 (in Russian)
9. Leon E., Ranganathan R., Savoldo B. Adoptive T cell therapy: boosting the immune system to fight cancer. Semin. Immunol. 2020; 49: 101437. DOI: https://doi.org/10.1016/j.smim.2020.101437
10. Rath J.A., Arber C. Engineering strategies to enhance TCR-based adoptive T cell therapy. Cells. 2020; 9 (6): 1485. DOI: https://doi. org/10.3390/cells9061485
11. Flynn J., Gorry P. Flow cytometry analysis to identify human CD4+ T cell subsets. Methods Mol. Biol. 2019; 2048: 15-25. DOI: https:// doi.org/10.1007/978-1-4939-9728-2_2
12. Saxena A., Dagur P.K., Biancotto A. Multiparametric flow cytometry analysis of naive, memory, and effector T cells. Methods Mol. Biol. 2019; 2032: 129-40. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-4939-9650-6_8
13. Mahnke Y.D., Brodie T.M., Sallusto F., Roederer M., Lugli E. The who's who of T-cell differentiation: human memory T-cell subsets. Eur. J. Immunol. 2013; 43 (11): 2797-809. DOI: https://doi.org/10.1002/ eji.201343751
14. Kudryavtsev I.V. Memory T cells: main populations and stages of differentiation. Rossiyskiy immunologicheskiy zhurnal. 2014; 8 (17): 947-64. (in Russian)
Сведения об авторах
Кузнецова Мария Сергеевна - канд. биол. наук, ст. науч. сот. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: maria.kuz17.03@gmail.com http://orcid.org/0000-0002-9834-9328
Терещенко Валерий Павлович - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: tervp91@gmail.com http://orcid.org/0000-0002-1620-6447
Шевченко Юлия Александровна - канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: shevcen@ngs.ru http://orcid.org/0000-0001-8773-0599
Фишер Марина Сергеевна - мл. науч. сотр. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация
E-mail: msolshanova@gmail.com http://orcid.org/0000-0001-6261-7557
Курилин Василий Васильевич - канд. мед. наук, вед. науч. сотр. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: 2221910@ngs.ru http://orcid.org/0000-0002-5617-0450
15. Myers D.R., Zikherman J., Roose J.P. Tonic Signals: Why Do Lymphocytes Bother? Trends Immunol. 2017; 38 (11): 844-57. DOI: https://doi.org/10.1016/j.it.2017.06.010
16. Gattinoni L., Powell D.J., Rosenberg S.A., Restifo N.P. Adoptive immunotherapy for cancer: building on success. Nat. Rev. Immunol. 2006; 6 (5): 383-93. DOI: https://doi.org/10.1038/nri1842
17. June C.H. Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic. J. Clin. Invest. 2007; 117 (6): 1466-76. DOI: https://doi.org/10.1172/ JCI32446
18. Ramirez N., Beloki L., Ciaurriz M., Rodriguez-Calvillo M., Es-cors D., Mansilla C., Bandres, E., Olavarria E. Impact of T cell selection methods in the success of clinical adoptive immunotherapy. Cell. Mol. Life. Sci. (CMLS). 2013; 71 (7): 1211-24. DOI: https://doi.org/10.1007/ s00018-013-1463-5
19. Wang Y., Qiu F., Xu Y., Hou X., Zhang Z., Huang L., Wang H., Xing H., Wu S. Stem cell-like memory T cells: The generation and application. J. Leukoc. Biol. 2021; 110 (6): 1209-23. DOI: https://doi. org/10.1002/JLB.5MR0321-145R
20. Strasser A., Jost P.J., Nagata S. The many roles of FAS receptor signaling in the immune system. Immunity. 2009; 30 (2): 180-92. DOI: https://doi.org/10.1016/j.immuni.2009.01.001
21. Paulsen M., Janssen O. Pro- and anti-apoptotic CD95 signaling in T cells. Cell Commun. Signal. 2011; 9: 7. DOI: https://doi. org/10.1186/1478-811X-9-7
22. Laman J.D., Claassen E., Noelle R.J. Functions of CD40 and Its Ligand, gp39 (CD40L). Crit. Rev. Immunol. 2017; 37 (2-6): 371-420. DOI: https://doi.org/10.1615/critrevimmunol.v37.i2-6.100
Authors' information
Maria S. Kuznetsova - PhD, Senior Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: maria.kuz17.03@gmail.com http://orcid.org/0000-0002-9834-9328
Valeriy P. Tereshchenko - PhD, Senior Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: tervp91@gmail.com http://orcid.org/0000-0002-1620-6447
Julia A. Shevchenko - PhD, Leader Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: shevcen@ngs.ru http://orcid.org/0000-0001-8773-0599
Marina S. Fisher - Junior Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: msolshanova@gmail.com http://orcid.org/0000-0001-6261-7557
Vasiliy V. Kurilin - PhD, Leader Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: 2221910@ngs.ru http://orcid.org/0000-0002-5617-0450
Алсаллум Алаа - лаборант-исследователь лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация
E-mail: alaa.alsalloum19996@gmail.com http://orcid.org/0000-0002-4395-5822
Алрхмун Салех - лаборант-исследователь лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация
E-mail: saleh.alrhmoun1@gmail.com http://orcid.org/0000-0003-0788-5385
Акахори Ясуши - PhD, доцент каф. иммунной генной терапии Университета Миэ, Цу, Япония E-mail: yakahori@med.mie-u.ac.jp
Шику Хироши - MD, PhD, зав. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация; проф. каф. иммунной генной терапии Университета Миэ, Цу, Япония
E-mail: shiku@med.mie-u.ac.jp http://orcid.org/0000-0002-0362-755X
Сенников Сергей Витальевич - д-р мед. наук, проф., зав. лаб. молекулярной иммунологии, гл. науч. сотр. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: sennikovsv@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
Alaa Alsalloum - Research Assistant of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: alaa.alsalloum19996@gmail.com http://orcid.org/0000-0002-4395-5822
Saleh Alrhmoun - Research Assistant of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: saleh.alrhmoun1@gmail.com http://orcid.org/0000-0003-0788-5385
Yasushi Akahori - PhD, Assistant Prof. of Immuno-gene Therapy Dept., Mie University, Tsu, Japan E-mail: yakahori@med.mie-u.ac.jp
Hiroshi Shiku - MD, PhD, Head of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation; Prof. of Immuno-gene Therapy Dept., Mie University, Tsu, Japan E-mail: shiku@med.mie-u.ac.jp http://orcid.org/0000-0002-0362-755X
Sergey V. Sennikov - MD, PhD, Professor, Head of Molecular Immunology Lab., Chief Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: sennikovsv@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
