CC BY
10
УДК 619:636.22/28.015.32
Бугай А.О., асистент, Бугай П.О., мапстрант, [email protected] © Днтропетроеський державный аграрный утеерситет
ОСОБЛИВОСТ1 ПРЕНАТАЛЬНОГО СТАНОВЛЕННЯ Л1ЩДНО1 КОМПОНЕНТИ ПЛАЗМОЛЕМИ АБСОРБЦ1ЙНИХ ЕНТЕРОЦИТ1В ПОРОЖНЬО1 КИШКИ ВЕЛИКО1 РОГАТО1 ХУДОБИ
Визначет особлиеост1 динамти л\тдного складу плазмолеми абсорбцшних ентероцит1е плодге ееликог рогатог худоби. Встаноелен маркерн показники, що сегдчать про розеиток полярност1 даного типу клтин.
Ключовi слова: ентероцит, плоди ееликог рогатог худоби, фосфолтди, холестерол, жирн кислоти.
Вступ. В останнш час велика увага в галузi фундаментальних i прикладних наук придшяеться дослщженням структури та функцш плазматичних мембран ентероциив [1, 4, 5]. Це зумовлено центральним положенням плазмолеми цих кл^ин кишечника в транспортних i регуляторних процесах та в реалiзацп генетичних програм, що мае важливе значення у вивченш молекулярних закономiрностей життевих функцш та розвитку патологiчних процеав.
Функцп всмоктування та переносу поживних речовин з кишечника до кровоносного русла обумовлеш, насамперед, поляризовашстю ентероциив з утворенням макродоменiв плазматично! мембрани - аткально! (АМ) та базолатерально! (БМ) мембран.
Дослiдження, якi були проведет рашше [3], показали значш вiдмiнностi лiпiдного складу та функщональних властивостей фракцiй плозмолеми ентероцитiв здорових i хворих на гострi розлади травлення новонароджених телят. Було встановлено, що плазмолема ентероцитiв останнiх е менш поляризованою, нiж у здорових, що вказуе на порушення мембраногенезу цього типу кл^ин у внутршньоутробний перiод розвитку як основно! ланки патогенезу. В той же час, даш щодо лiпiдного складу АМ та БМ абсорбцшних ентероциив плодiв велико! рогато! худоби вiдсутнi, тому результати цих дослщжень дозволять бшьш глибоко вивчити етiопатогенез гострих розладiв травлення у новонароджених телят та розробити комплекс заходiв щодо !х профiлактики та лiкування.
Тому метою нашо! роботи було встановлення змш показникiв лiпiдного складу як маркерiв розвитку поляризованостi абсорбцiйних ентероцитiв порожньо! кишки.
Матер1али та методи. Дослiдження проводились у проблемнш науково-дослiднiй лабораторi! фiзiологi! та функцiонально! морфологi! продуктивних тварин Дншропетровського державного аграрного унiверситету та проблемно!
© Бугай А.О., Бугай П.О., 2008
23
науково! лаборатори внутршшх незаразних хвороб тварин кафедри терапп i клмчно! дiагностики Нащонального аграрного унiверситету. Для дослiджень вщбирали матерiал вiд 27 (3-х, 5-ти та 7-ми мюячних) плодiв велико! рогато! худоби. Пiсля евтаназii плодiв розтинали черевну порожнину, видаляли порожню кишку, промивали !! фiзiологiчним розчином (№С1-ИЕРЕ8, рН 7,4) для видалення вмiсту. Для видiлення ентероцитiв порожню кишку вщдшяли вiд брижi, визначали !! загальну довжину, знаходили середину, вщ яко! вiдмiряли рiвновiддаленi точки у крашальному та каудальному напрямах та вiдрiзали дiлянку кишки. При цьому довжина кишки складала третину вiд загально!. Видiлення абсорбцiйних ентероциив проводили хiмiчним методом [3] в авторськш модифiкацi!' [1].Отримання АМ i БМ ентероцитiв виконували за методом диференцшного центрифугування [2], ступiнь очистки яких проводили шляхом вимiрювання активност маркерних ферментiв (лужно! фосфатази та К-АТРази вiдповiдно). В мембранних препаратах визначали вмют загального бшку, лiпiдiв, холестеролу (ХС), фосфолiпiдiв (ФЛ)та !х фракцiй, жирних кислот (ЖК) загальноприйнятними методами. Статистичну обробку результат проводили з використанням програми Ехсе1 - 97.
Результати дослщження. Результати дослщжень свiдчать, що вже на 3-му мiсяцi пренатального перюду онтогенезу велико! рогато! худоби плазмолема абсорбцшних ентероцитiв вже розмежована на 2 протилежних макродомени -аткальний та базолатеральний, якi вiдрiзняються мiж собою за вмiстом загальних лшвдв, ХС, ФЛ та ЖК складом.
Так, в плазмолемi ентероцитiв порожньо! кишки 3-х мiсячних плодiв сшввщношення мiж лiпiдами та бiлками в АМ е меншим у 4,3 рази в порiвняннi з БМ. Це вказуе на переважання в АМ бшково!, а в БМ - лшщно! компоненти. Аналопчна закономiрнiсть була встановлена i для АМ та БМ ентероциив порожньо! кишки велико! рогато! худоби у постнатальному перiодi онтогенезу, що може свщчити про закономiрнiсть таких особливостей, як необхiднi для здiйснення функцiй гiдролiзу та транспорту поживних речовин абсорбцшними ентероцитами. Основним лiпiдом як АМ, так i БМ ентероцитiв порожньо! кишки 3-х мюячних плодiв велико! рогато! худоби е ХС, вмют якого е вищим у 2-3 раза за такий у плазмолемi ентероциив моногастричних i жуйних тварин у постнатальному перiодi онтогенезу.
У 3-х мшячних плодiв велико! рогато! худоби вмют ХС в АМ абсорбцшних ентероциив е вищим за вмют його в БМ в 1,4 рази. Загальний вмiст ФЛ в плазмолемi абсорбцiйних ентероцитiв 3-х мюячних плодiв велико! рогато! худоби майже не вiдрiзняеться вiд такого у дорослих тварин цього виду та моногастричних тварин. Проте, в БМ ентероциив 3-х мюячних плодiв велико! рогато! худоби вмют ФЛ е нижчим у 5 разiв у порiвняннi з тваринами постнатального перюду онтогенезу, внаслщок чого бшар цього макродомену мае низьку текучють. У 3-х мiсячних плодiв вмют ФЛ в АМ ентероцитiв е вищим за БМ у 2,54 рази, що не характерно для моногастричних та жуйних тварин у тсляутробний перюд життя. Зважаючи на кшьюсш вщмшност у показниках лшщ/бшкового коефiцiенту, ХС та спiввiдношення мiж ХС та ФЛ в
24
плазмолемi ентероциив порожньо! кишки 3-х мюячних плодiв велико! рогато! худоби можна зробити висновок про наявшсть поляризованого транспорту вщ мiсця синтезу сполук до плазмолеми ентероцитiв.
В АМ абсорбцшних ентероцитiв порожньо! кишки 3-х мюячних плодiв велико! рогато! худоби встановлено, що ФЛ спектр представлений 6 основними фракщями: фосфатидилхолiн (ФХ, 52,5 ± 2,67 %), фосфатидилетаноламiн (ФЕ, 23,03 ± 1,82 %), фосфатидилсерин (ФС, 11,36 ± 0,53 %), сфiнгомiелiн (СМ, 9,43 ± 0,43 %), лiзофосфолiпiди (ЛФЛ, 2,3 ± 0,18 %) та фосфатидилiнозитол (Ф1, 1,23 ± 0,09. Значних вщмшностей щодо спектру ФЛ мiж АМ та БМ не виявлено. Встановлено вiрогiдно вищий вмiст в БМ, у порiвняннi з АМ, ФС та Ф1 (на 16 % та 56 %, вщповщно). Незначна рiзниця щодо вмiсту СМ мiж АМ та БМ абсорбцiйних ентероциив порожньо! кишки 3-х мiсячних плодiв може свiдчити про незавершенiсть формування полярностi плазмолеми цих клiтин на даному етат онтогенезу.
Одержанi даш свiдчать, що до складу лшвдв АМ та БМ абсорбцiйних ентероциив порожньо! кишки 3-х мiсячних плодiв входить по 10 ЖК (табл. 4). Основними ЖК АМ е лшолева (С18:2), гептадеценова (С17:1), стеаринова (С18:0) та пальмiтинова (С16:0). Також виявлеш середньоланцюговi ЖК - лауринова (С12:0) та мiристинова (С14:0), як не властивi для плазмолеми ентероциив порожньо! кишки доросло! велико! рогато! худоби (Цвилиховский Н.И., 1989).
Загальна сума насичених ЖК складае 25,70 ± 0,19 %, ненасичених -74,30 ± 0,34 %, а стввщношення мiж ними становить 0,35 ± 0,004.Переважання ненасичених ЖК може бути компенсаторним мехашзмом щодо зменшення в'язкост лiпiдного бiшару АМ внаслщок високого вмiсту в ньому ХС. Сума моноенових ЖК складае 41,92 ± 2,12 %, дiенових - 31,78 ± 2,25 %, а стввщношення мiж ними становить 1,34 ± 0,16.
Результати наших дослщжень показали значнi змiни лiпiдного складу плазмолеми абсорбцшних кл^ин на 5-му мюящ розвитку плодiв у порiвняннi з 3-х мiсячними плодами. Загалом, цi змiни характеризують зменшення в'язкост АМ та БМ ентероцитiв, що впливае на функцюнальну активностi ештелш порожньо! кишки. Суттевий вплив на розвиток травного каналу та формування його функцiональних властивостей мае амнютрофне живлення плоду, яке розпочинаеться з друго! половини внутрiшньоутробного розвитку. Так, лшщ/бшковий коефiцiент у плазмолемi ентероциив порожньо! кишки 5-ти мiсячних плодiв велико! рогато! худоби знизився у порiвняннi з цим показником у 3-х мюячних плодiв на 15% в АМ та у 2,25 рази в БМ, що вказуе на зростання вмюту мембранних бшюв та тдвищення функцiонально! активностi мембранного бшару.
Слiд зазначити, що лшщ/бшковий коефщент в АМ та БМ абсорбцшних ентероциив 5-ти мiсячних плодiв велико! рогато! худоби наблизився до такого у новонароджених та дорослих тварин велико! рогато! худоби. Тому ми припускаемо завершення основного формування властивостей плазмолеми абсорбцшних ентероциив порожньо! кишки з 5-го мюяця пренатального перюду розвитку велико! рогато! худоби. Вмют ХС в обох фракцiях плазмолеми
25
ентероциив порожньо! кишки 5-ти мшячних плодiв, у порiвняннi з цим показником у 3-х мшячних плодiв, знизився: в АМ в 1,24 рази, а в БМ — в 1,32 рази. Також встановлено значне пщвищення вмшту ФЛ, що вважаеться одним з головних адаптивних механiзмiв в процесах онтогенезу еттелш порожньо! кишки. Значне пщвищення плинноси плазмолеми ентероциив порожньо! кишки плодiв на 5-му мшящ розвитку пiдтверджуе показник змши коефiцiенту ХС/ФЛ. Так, у 5-ти мшячних плодiв, в порiвняннi з 3-х мшячними плодами, цей показник в АМ ентероциив знизився в 1,3 рази, а в БМ — у 5,6 раза. Значш кшьюсш змши у вмюи ФЛ плазмолеми абсорбцшних ентероциив порожньо! кишки 5-ти мюячних плодiв велико! рогато! худоби свiдчать про подальший розвиток абсорбтивно! та транспортно! функцiй цих кл^ин.
Основними ФЛ АМ ентероциив порожньо! кишки 5-ти мюячних також е ФЕ та ФХ. Проте, вмют ФЕ в АМ ентероциив цих плодiв мае тенденщю до пщвищення у порiвняннi з 3-х мшячними плодами, що може бути пов'язано зi зростанням iнтенсивностi синтезу амшофосфолшвдв. Вмiст СМ в АМ ентероциив 5-ти мюячних плодiв нижчий у порiвняннi з 3-!х мшячних плодiв в 2,7 раза. Це можна пояснити штенсивним амнiотрофним живленням 5-ти мшячних плодiв i наростанням необхщноси передачi сигналу до кл^ини. В той же час, вмют Ф1 в АМ ентероцитiв 5-ти мшячних плодiв у 3,3 раза вищий, у порiвняннi з цим показником у 3-х мюячних плодiв.. Внаслiдок змiн щодо вмiсту ФЛ в плазмолемi ентероцитiв 5-ти мюячних плодiв зменшуеться спiввiдношення мiж кислими та основними ФЛ. Цей показник характеризуе зменшення заряду на поверхш мембрани та зниження !! адсорбцшних властивостей з розвитком ентероциив порожньо! кишки
Змши вмюту ФЛ БМ абсорбцшних ентероциив порожньо! кишки 5-ти мшячних плодiв е ще бшьш вираженими. Так, в БМ встановлено зменшення вмюту ФХ та пщвищення вмюту ФЕ. Внаслiдок цього змшюеться асиметричнiсть розподiлу головних структурних ФЛ мiж АМ та БМ, з переважанням вмiсту ФЕ в БМ, а ФХ в АМ. На користь нашого припущення щодо механiзмiв, яю покращують парацелюлярну проникнiсть, вказуе пщвищення вмюту ЛФЛ в БМ ентероциив 5-ти мюячних плодiв майже на 50 % у порiвняннi з цим показником в БМ ентероциив 3-х мюячних плодiв.
Змши ЖК складу плазмолеми абсорбцiйних кл^ин 5-ти мiсячних плодiв також можна характеризувати як компенсаторш для пщтримання оптимально! плинность мембранного бiшару. Так, поряд зi зниженням вмiсту ХС, в плазмолемi ентероцитiв порожньо! кишки 5-ти мюячних плодiв встановлено пщвищення вмшту насичених ЖК. Спiввiдношення мiж насиченими та ненасиченими ЖК в плазмолемi ентероцитiв порожньо! кишки 5-ти мшячних плодiв, у порiвняннi з 3-х мюячними плодами, значно зросло: в АМ — у 3,5 раза, а в БМ — в 1,6 раза. Також нами встановлено появу транмзомеру лшолево! кислоти, що не описано в лiтературi для шших об'екив дослщжень. При цьому вмiст в плазмолемi ентероцитiв цих плодiв середньоланцюгових ЖК (крiм лауриново! в АМ) пiдвищився на 20—40%, що ще раз свщчить про
26
посилення пapaцелюляpноï проникливост еттелш порожньох' кишки в цей перюд пре^т^ьного розвитку великое' pогaтоï xyдоби.
Онтогенетичнi змiни лшщного бiшapy aбcоpбцiйниx ентеpоцитiв у 7-ми мicячниx плодiв великоï pогaтоï xyдоби cвiдчaть про подгльший розвиток фу^^он^ьн^ влacтивоcтей тa пiдготовкy cлизовоï оболонки поpожньоï кишки до поcтнaтaльного перюду життя. Cлiд зaзнaчити, що змши покaзникiв вiд 5-го до 7-го мюящв розвитку плоду великоï pогaтоï xyдоби менш виpaженi, нiж вщ 3-го до 5-го мicяцiв, що може вкaзyвaти нa зaвеpшення фоpмyвaння оcновниx cтpyктypно-фyнкцiонaльниx елементiв поpожньоï кишки таприюнщ пеpшоï половини геcтaцiï.
Лшщ/бшковий коефiцieнт AM ентеpоцитiв поpожньоï кишки 7-ми мicячниx плодiв мaйже не змшився у поpiвняннi з 5-ти мюячними плодaми. Проте, в БM ентеpоцитiв 7-ми мicячниx плодiв вcтaновлено поднльше зменшення цього покaзникa.
Вмют зaгaльниx ФЛ в плaзмолемi aбcоpбцiйниx ентеpоцитiв в пеpiод вiд 5-го до 7-го мюящв розвитку плодiв великоï pогaтоï xyдоби пiдвищивcя: в AM в 1,38 paзи, a в БM - в 1,9 paзa, що можнa пов'язaти з поднльшим збiльшенням фyнкцiонaльноï aктивноcтi мембpaнного бiшapy. Cлiд зaзнaчити, що вмют ХС зменшився в обоx мaкpодоменax плнзмолеми ентеpоцитiв в 2,2 тa 2 рнзи, в AM тa БM ентеpоцитiв, вiдповiдно. Внacлiдок цього коефiцieнт ХС/ФЛ знизився в AM ентероциив у 3 paзи, a в БM - у 3,8 paзa. Отже, плиннicть AM тa БM aбcоpбцiйниx ентеpоцитiв в перюд з 3-го до 7-го мюящв розвитку плодiв великоï pогaтоï xyдоби знaчно пiдвищyвaлacь.
Змiни фpaкцiйного склнду ФЛ плнзмолеми aбcоpбцiйниx ентеpоцитiв в перюд з 5-го до 7-го мюящв розвитку плодiв великоï pогaтоï xyдоби досить незнaчнi i вони стосуються зменшення вмicтy ФС в AM тa БM у 2,2 тa у 2,3 paзa, вщповщно, a тaкож зниження вмicтy ЛФЛ в БM в 1,38 paзa. M^ ввaжaeмо, що нa 7-му мюящ розвитку плодiв великоï pогaтоï xyдоби aбcоpбцiйнi ентероцити e бшьш полярними клiтинaми, нiж нa 3-му тa нa 5-му мicяцяx, оскшьки caме в дaний пеpiод вcтaновлено нaйбiльшy piзницю щодо ФЛ склнду мaкpодоменiв плнзмолеми. Тaк, якщо у 3-x мicячниx плодiв e вipогiднa piзниця щодо AM тa БM ентеpоцитiв тiльки зa 2-мa фpaкцiями ФЛ (ФС тa Ф1), то у 5-ти мicячниx плодiв — зa тpьомa ïx фpaкцiями ^M, Ф1 тa ФХ), a та 7-му мicяцi — зa п'ятьмa фpaкцiями (ЛФЛ, CM, ФС, Ф1 тa ФХ).
Подaльшa поляpизaцiя ентероциив поpожньоï кишки пiдтвеpджyeтьcя змiнaми вмюту ЖK в ïx плaзмолемi та 7-му мicяцi розвитку плодiв великоï pогaтоï xyдоби. Тaк, вмicт cеpедньолaнцюговиx ЖK (С10-С14) у плaзмолемi ентероциив у цей пеpiод розвитку плодa, знижyeтьcя в 2 рнзи. В AM з'являeтьcя apaxiдоновa киcлотa, яга бyлa вiдcyтня в AM ентероциив плодiв 3-x тa 5-ти мюячного вiкy, знижyeтьcя вмicт олеïновоï (в 1,4-1,8 paзa) тa елaïдiновоï (в 4,0-9,0 рнзи) кислот.
Cпiввiдношення мiж нacиченими тa ненacиченими ЖK в AM ентнероцитсв 7-ми мicячниx плодiв зменшилося нa 35 %, a в БM - у 2 paзи в поpiвняннi з цим покнзником у 5-ти мicячниx плодiв Тaкож, нa 7-му мicяцi
27
розвитку плодiв велико! рогато! худоби в АМ та БМ ентероциив встановлено зниження в 2 рази вмюту дieнових ЖК. Слщ зазначити, що зниження вмюту дieнових ЖК в плазмолемi ентероцитiв порожньо! кишки спостерiгаeться впродовж всього дослщжуваного перiоду пренатального розвитку велико! рогато! худоби, що також можна вважати важливим маркерним показником мембраногенезу цих кл^ин.
Висновки. Дослiджено лiпiдний склад плазмолеми абсорбцiйних ентероцитiв порожньо! кишки плодiв велико! рогато! худоби. Одержат результата розкривають закономiрностi пренатального розвитку травного каналу у велико! рогато! худоби. Найбшьш виражеш змiни фосфолiпiдно! композицi! встановлеш в АМ та БМ абсорбцшних клiтин у перiод з 5-го по 7-й мшящ розвитку плодiв, що вказуе на завершення формування структури та основних функцiональних властивостей плазмолеми ентероципв наприкiнцi 2-го - початку 3-го триместру внутршньоутробного розвитку. Маркерними показниками розвитку лшщного бшару плазмолеми абсорбцiйних ентероцитiв плодiв велико! рогато! худоби е тдвищення в нiй вмiсту загальних фосфолшвдв, фосфатидилiнозитолу, фосфатидилетаноламiну, поява арахiдоново! кислоти в АМ, зниження вмюту холестеролу, фосфатидилсерину, сфiнгомiелiну, зменшення величини сшввщношення мiж кислими i основними фосфолшщами та коефiцiенту фосфатидилсерин/фосфотидилiнозитол, зниження вмюту дiенових та середньоланцюгових жирних кислот.
Лггература.
1. Бугай А.О., Цвшховський М.1. Одержання iзольованих ентероцитiв тонко! кишки плодiв велико! рогато! худоби пщ контролем бiохiмiчних показникiв кл^инних фракцiй // Укр. бiохiм. журн. - 2007. - Т. 79, №2. - С. 130 - 135.
2. Масюк Д. Особливост фракщонування плазматичних мембран iзольованих ентероципв тонкого кишечнику плодiв велико! рогато! худоби // Вюник Нацiонального аграрного ушверситету. - Ки!в, 2004. - № 78. - С.125-129.
3. Цвилиховский Н.И. Выделение, химический состав и транспортные АТФазы щеточной каймы и базолатеральных мембран клеток кишечного эпителия взрослого крупного рогатого скота, новорождённых здоровых и больных диспепсией телят: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Львов, 1989. - 17 с.
4. Haegebarth A., Bie W., Yang R. et al. Protein tyrosine kinase 6 negatively regulates growth and promotes enterocyte differentiation in the small intestine // Mol. Cell. Biol. -2006. - V. 26. - P. 4949-4957.
5. Hoekstra D., Tyteca D., Van Izendoorn S. The subapical compartment: a traffic center in membrane polarity development // J. Cell Sci. - 2004. - V. 117. -P. 2183 - 2192.
Summary Bugay A.O., Bugay P.O.
Dnipropetrovs'k State Agrarian University FEATURES OF PRENATAL DEVELOPMENT OF LIPID COMPOSITION OF BOVINE FETAL JEJUNUM ABSORPTIVE CELLS The features of lipid composition dynamics of bovine fetal absorptive cells are revealed. The marker indices of polarity development this cell type has stated.
Key words: enterocyte, bovine fetus, phospholipids, cholesterol, fatty acids.
Стаття надшшла до редакцИ 4.03.2008
28
