CC BY
11
УДК 577.352.315:612.33+591.132.5;619:616.33
Масюк Д.М., кандидат вет. наук, доцент © (plppm@ua.fm) Днтропетровський державный аграрный утверситет
ПОЛ1ПЕПТИДНИЙ СКЛАД Ес-у-РЕЦЕПТОРШ БАЗОЛАТЕРАЛЬНИХ МЕМБРАН ЕНТЕРОЦИТ1В ВЕЛИКО1 РОГАТО1 ХУДОБИ У РАН1Й ПЛОДОВИЙ ПЕР1ОД
Досл1джували особливост1 полтептидного складу Ее-у-рецептор1в плазмолеми ентероцит1в порожньог кишки плодгв великог рогатог худоби 2-, 3-, 4- мкячного вту. Результати ¡муноблотингу показали загальну зб1жтсть складу Ее-у- рецептор1в екстрагованих гз апгкального домену ентероцит1в протягом усього раннього плодового перюду великог рогатог худоби. Полтептидний склад Ее-у- рецептор1в у цей перюд був представлений молекулярними масами 120, 87, 72 I 43 кДа. Найбыьш штенсивно експресованими Ее-у-зв 'язуючими полтептидами е бшок зМм 87 кДа.
Ключовi слова: базолатеральна мембрана, порожня кишка, ентероцити, плоди, плодовий перюд, ¡муноблотинг, Ее-у-рецептори.
Вступ. Визначенню стану природно1 резистентности неспецифiчноl та iмунолоriчноl реактивност новонародженого оргашзму на сьогодш придшяеться особлива увага дослщниюв. У зв'язку з цим особливу роль у забезпеченш iмунного захисту i життездатност новонароджених ввдграють молекулярш мехашзми, яю у зрiлонароджених ссавцiв формуються у плодовий перiод онтогенезу та контролюють розвиток iмунокомпетентних клiтин, синтез i транспорт iмуноглобулiнiв. Одними з найбшьш важливих регуляторiв i транспортерiв одночасно розглядаються iмунорецепторнi бiлки, яю здатнi специфiчно розпiзнавати Fc-фрагменти iмуноглобулiнiв класу G - Fc-y-рецептори [1].
Рецептори для iмуноглобулiнiв були вперше щентифжоваш близько 40 рокiв тому, але !х центральна роль в iмуннiй вiдповiдi стае зрозумiлою тiльки в останне десятил^тя [2]. Fc-y- рецептори е ключовими учасниками як аферентно!, так i еферентно! фази iмунноl вiдповiдi. Вони експресуються рiзними типами кл^ин як складовi критичних елеменив активаци або гальмування iмунноl вщповвд i об'еднують ланки гуморально! i кл^инно1 iмунноl вiдповiдi. Fc-y-рецептори е чутливими сенсорами iмунного статусу оргашзму. Багато тваринних i клiтинних моделей тдтверджують важливу роль Fc-рецепторiв як в активаци, так i у супреси iмунноl вiдповiдi [3].
Повщомлення щодо закономiрностi оргашзаци iмунофункцiональних бшкових структур поляризованих клiтин на раншх стадiях внутрiшньоутробного розвитку е на сьогодшшнш день фрагментарними та нечисельними, а даш щодо визначення полтептидного складу Fc-y-рецепторiв
© Науковий консультант Масюк Д.М., 2008
- доктор бюл. наук, професор, академж УААН Цвшховський М.1. 165
базолатеральних мембран ентероциив плодiв велико! рогато! худоби ввдсутш. Тому, дослщження складу бшюв з Fc-у-зв'язуючою активнiстю на базолатеральному доменi кишкових клiтин велико! рогато! худоби у раншх етапах плодового перюду дозволить з'ясувати механiзми транспорту IgG та розкрити особливостi !х трансцитозу за участю Fc-y-рецепторiв. Це надасть можливiсть встановити формування загальних iмунологiчних механiзмiв у пренатальному онтогенез^ так i специфiку становлення окремих елементiв, що вiдповiдають за формування адаптивно! взаемоди з бiологiчно активними компонентами молозива продуктивних тварин. Тому метою нашо! роботи було визначити особливост полiпептидного складу Fc-y-рецепторiв у базолатеральних мембранах (БМ) ентероциив порожньо! кишки велико! рогато! худоби у раннш плодовий перiод онтогенезу.
Матер1ал i методи. Дослiдження проведет на базi проблемно! науково-дослщно! лабораторi! фiзiологi! та функцiонально! морфологи продуктивних тварин Днiпропетровського державного аграрного ушверситету. В дослiдженнях використовували суспензш iзольованих ентероцитiв порожньо! кишки (з !! середньо! частини) 2-, 3-, 4- мюячних плодiв велико! рогато! худоби (отриманих вiд клiнiчно здорових корiв), якi були видiленi хiмiчним методом (цитрат/ЕДТО). Базолатеральнi мембрани отримували методом диференцiального центрифугування [4].
Електрофорез проводили у пластиш ПААГ товщиною 1 мм вiдповiдно з методикою, описаною Laemmli U., 1970.
Iмуноспецифiчне виявлення комплексiв IgG - Fc-y-рецептор проводили за допомогою iмуноблотинга за методикою, запропонованою Towbin H., 1988.
У робой використовувалася програма "LabWork 4.0" (UVP, Велика Британiя, 2001) для сканування i порiвняння штенсивност полiпептидних зон на нiтроцелюлознiй мембраш пiсля проведення iмуноблотингу.
Розрахунки проводились за допомогою ЮМ-сумюного комп'ютера за програмами "Statistica 7.0" та "Excel 2000". Обробку отриманих даних проводили методами математично! статистики для малих вибiрок [5].
Результати дослщження. Дослщження складу бшюв з Fc-у-зв'язуючою актившстю на базолатеральному домеш епiтелiоцитiв порожньо! кишки у раннш плодовий перюд онтогенезу велико! рогато! худоби показали, що вони представлеш основними чотирма полшептидними зонами з Мм 120, 87, 72 i 43 кДа.
Переважаючим за штенсившстю експресп бшком на БМ еттелюциив у плодiв 2-х мюячного вiку е полiпептид з Мм 87 кДа, який проявляе Fc-y-рецепторну активнiсть. Його дольова частка становила 50,8±0,39% вiд загального вмiсту рецепторних бiлкiв (рис. 1).
Наступною за вмiстом полiпептидною фракщею на базолатеральнiй поверхнi кишкових ентероциив на початку раннього плодового перюду, яка виявляла зв'язуючи актившсть до IgG, виявлено бшок з Мм 72 кДа концентращя якого дорiвнювала 19,6±0,26%, що майже в 2,5 рази нижче шж полiпептид з Мм 87 кДа.
166
Слщ зазначити, що концентращя Fc-y-рецепторного бшку з Мм 43 кДа бyлa у межax коливання до одного проценту вщ вмюту рецепторного полiпептидy з Мм 72 кДа та складала 19,5±G,41%. Ця рiзниця за вщносним вмiстом бiлкiв з молекулярними масами 72 та 43 кДа Fc-у-зв'язуючою актившстю дае тдставу до ïx об'еднання, та при розрaxyнкy вщ загального спектру рецепторниx бiлкiв xaрaктеризyвaти ïx, як другу за штенсившстю експресп полiпептидом на базолатеральному домеш епiтелiоцитiв у плодiв 2-x мюячного вiкy. Сумарний вмiст циx рецепторниx бiлкiв становить 39,1±G,61%, що в 1,3 рази менше концентраци Fc-y-рецепторного полшетида з Мм В7 кДа. Сшввщношення мiж Fc-y-полiпептидом з Мм 87 кДа та бшками з молекулярними масами 72 i 43 кДа складало у середньому 2,59:1,G.
Рис. 1. bmíct полтептнд1в i3 Fc-y-рецептивною aктивнiстю на БМ ентероци^в порожньоУ кишки 2- мпсячннх плод1в великоУ poraTOÏ худоби,
% (M±m, n=6)
Виxодячи з резyльтaтiв розрaxyнкy окремиx бiлковиx фрaкцiй, якi виявляють рецепторну aктивнiсть до IgG можливо вважати, що нaйбiльш iнтенсивно експресованими Fc-у-зв'язуючими полiпептидaми е бiлки з Мм 87, 72 i 43 кДа. ïx домiнyючий вмшт на БМ ентероцшчв на початку плодового перюду дорiвнювaв В9,9±1,29%. Спiввiдношення сумарного вмюту рецепторниx бiлкiв, якi переважають до Fc-y-рецепторiв iз Мм 87, 72 i 43 кДа становило 1,77:1,G; 4,58:1,G i 4,61:1,G.
Найменшим за вмiстом на бaзолaтерaльнiй дшянщ плазмолеми кишковиx епiтелiоцитiв у 2-x мшячнж плодiв е полiпептид з Мм 12G кДа. Частка цього бшку складае 1G,1±G,21% вiд зaгaльноï концентрaцiï Fc-y-рецепторiв. У порiвняннi з Fc-y-рецепторними бiлкaми з Мм 87 кДа його вмшт був нижче в 5,G рази, а у порiвняннi з 72 i 43 кДа в середньому в 1,94 рази.
167
Сшввщношення мiж сумарною часткою бшьш штенсивно експресованими Fc-y-зв'язуючими бiлками (Мм 87, 72, 43 кДа) на БМ ентероципв на початку плодового перiоду та рецепторним полшептидом з Мм 120 кДа ие1 ж локалiзацil становить 8,86:1,0.
Ан^з вмiсту окремих iмунорецепторних бiлкiв на базолатеральному доменi ентероциив порожньо1 кишки 3-х i 4-х мшячних плодiв велико1 рогато1 худоби дозволив встановити характернi особливостi розпод^ полiпептидiв з Fc-y-зв'язуючою активнiстю.
Найбшьшим за вмiстом на БМ у 3- i 4-х мшячних плодiв е Fc-y-рецепторний бiлок з Мм 87 кДа, частка якого становила вщповщно 51,1±0,37% i 47,1±0,93% (рис. 2).
Рис. 2. Вм1ст полшептид1в ¡з Ес-у-рецептивною активн1стю на БМ ентероцит1в порожньоУ кишки 3- та 4-х мкячних плод1в велико? рогатоУ
худоби, % (М±т, п=6)
Другим за штенсившстю експресп рецепторним полiпептидом домену, який дослщжували у плодiв 3-х мюячного вiку, був бiлок з Мм 72 кДа. Його вмют складав 19,1±0,29%, а у 4-х мюячних плодiв це був полшептид з Мм 43 кДа, який дорiвнював 22,0±0,55%. Концентрацiя цих бшкових фракцiй на БМ кишкових кл^ин була нижча в 2,67 рази (у 3-х мшячних плодiв) та 2,14 рази (у 4-х мюячних плодiв) по вiдношенню до полшептиду з Мм 87 кДа.
Слщ вiдмiтити, що за вмiстом бшюв на БМ у 3-х та 4-х мюячних плодiв наступними е полшептиди з молекулярними масами 43 i 72 кДа вiдповiдно, але !х рiзниця за iнтенсивнiстю експресп з Fc-y-рецепторами (Мм 72 i 43 кДа) вiдповiдного вiку не е суттевою (бия одного проценту), що дозволяе вщнести !х за концентращею до друго1 за штенсившстю експресп групи рецепторних бшюв. Сшввщношення мiж Fc-y-полiпептидом з Мм 87 кДа та рецепторними бшками з молекулярними масами 72 i 43 кДа на базолатеральному домеш у плодiв 3-х мiсячно вiку складало у середньому - 2,69:1,0, а у плодiв 4-х мiсячно
168
в^ - 2,17:1,0. Сумарний вмют Бс-у-рецепторних полiпептидiв (Мм 72 i 43 кДа) макродомену, який дослщжували, складав 38,1±0,46% (у 3-х мiсячних плодiв) та 43,4±0,54% (у 4-х мiсячних плодiв), що вiдповiдно в 1,34 та 1,09 рази менше концентраци бшку з Мм 87 кДа Бс-у-зв'язуючою активнiстю.
Загальна концентрацiя полiпептидiв, яю проявляли домiнуючу експресiю Бс-у-зв'язуючих бшюв (Мм 87, 72 i 43 кДа) на БМ кишкових ентероцитсв у 3-х мiсячних плодiв дорiвнював 89,2±1,01% та у 4-х мкячних 90,4±1,20% вiд загального рецепторного спектру. Сшввщношення переважаючою частки Бс-у-рецепторних пептидiв до бiлкiв iз Мм 87, 72 i 43 кДа становило 1,74:1,0; 4,66:1,0 i 4,71:1,0 (у 3-х мiсячних плодiв) та 1,92:1,0; 4,23:1,0 i 4,11:1,0 (у 4-х мiсячних плодiв).
Iнтенсивнiсть експреси Бс-у-звязуючого полiпептида з Мм 120 кДа на базолатеральному полюс кл^инно! оболонки епiтелiоцитiв була найнижчою як у плодiв 3-х мiсячного, так i 4-х мiсячного вiку та складала вiдповiдно 10,8±0,39% i 9,6±0,26%. У результатi розрахунку концентраци даного бшку (Мм 120 кДа), який проявляв зв'язуючу актившсть до на БМ , у порiвняннi з полiпептидом з Мм 87, його вмшт був нижче в 4,73 рази (у 3-х мюячних плодiв), та 4,92 рази (у 4-х мюячних плодiв). Концентрацiя Бс-у-рецепторного бiлку з Мм 120 кДа була нижчою у плодiв 3-х мюячного вiку в 3,52 рази та у 4-х мюячних в 3,98 рази у порiвняннi з сумарною часткою полiпептидiв з молекулярними масами 72 i 43 кДа. Вщношення домiнуючо! частки рецепторних бшюв (Мм 87, 72, 43 кДа) на БМ ентероциив до найменш експресованого полшептиду (Мм 120 кДа) у 3-х мюячних плодiв дорiвнював 8,25:1,0; та у 4-х мкячних плодiв - 9,46:1,0.
Враховуючи той факт, що Бс-у-рецептори е важливими елементами, якi виконують регуляторну та виконавчу функцп iмунно! системи, ймовiрно це позначилось на !х високому рiвнi на базолатеральнiй поверхнi ентероциив протягом усього раннього плодового перюду i вказуе на участь 1х у процесах рециклiнгу, та може бути показником активност ендоцитозу в епiтелiальних клiтинах [6].
За даними МттецаЬп Б, Кауе1:сИ I. [7] Бс-у-рецептори гетерогеннi та мають чотири класи, якi iдентифiкованi на людських лейкоцитах: БсуМ (СВ64), БсуЯП (СБ32), БсуМП (СБ16) та БсуЫУ. Вони можуть бути рiзними за молекулярною масою, клiтинному розподiлу, спорiдненостi та специфiчностi до IgG iзотопiв. Виявлеш нами полiпептиднi зони на БМ ентероциив плодiв велико1 рогато! худоби з молекулярними масами 120, 87, 72 i 43 кДа, яю здатш зв'язувати IgG, близькi по значенню до Fc-y-рецепторiв гризунiв i людини [8, 9]. Це вказуе на вщповщну видоспецифiчнiсть Fc-y-рецепторiв.
Висновки. Раннiй плодовий перiод велико! рогато! худоби проявляеться загальною збiжнiстю складу полiпептидiв, якi виявляли зв'язуючу актившсть до
на базолатеральних мембранах абсорбцшних ентероцитiв порожньо! кишки. Бшковий склад Бс-у- рецепторiв у цей перюд представлений молекулярними масами 120, 87, 72 i 43 кДа, що вказуе на специфiчнiсть та гетерогеншсть !х молекулярно! структури. Найбшьш iнтенсивно експресованим
169
Fc-у-зв'язуючими полшептидом е бшок з Мм 87. Його частка у середньому складала бшя 50% (вiд 47,06% до 51,14%). Виявлений вмкт Fc-y- рецеш^в на базолатеральнiй поверхнi ентероцитiв вщображае як процеси поляризаци, диференщаци, спещалiзащ! мембран у раннiй плодовий перюд онтогенезу, так i, ймовiрно, забезпечують своечасне становлення механiзмiв пренатально! iмунолоriчно! реактивностi продуктивних тварин.
Л1тература
1. Roopenian D., Akilesh S. FcRn: the neonatal Fc receptor comes of age // Nature Reviews Immunology. - 2007. - 7. P. 715-725.
2. Brambell F. The transmission of immune globulins from the mother to the foetal and newborn young // Proc Nutr Soc. - 1969. - 28, № 1. - P. 35-41.
3. Nimmerjahn F, Anthony R., Ravetch J. Agalactosylated IgG antibodies depend on cellular Fc receptors for in vivo activity // Proc Natl Acad Sci U S A. -2007. - 104, № 20. - 8433-8437.
4. Масюк Д.М. Особливост фракщонування плазматичних мембран iзольованих ентероципв тонкого кишечника плодiв велико! рогато! худоби// Вкник Нащонального аграр. ушверситету. - Ки!в, 2004. - № 78. - С. 148-152.
5. Кокунин В. А. Статистическая обработка данных при малом числе опытов // Укра!нський бiохiмiчний журнал. - 1975. - Т. 47, № 6. - С. 776-790.
6. Mostov K., Verges M.,Altschuler Y. Membrane traffic in polarized epithelial cells // Current Opinion in Cell Biology. 2000. - 12. P. 483-490.
7. Nimmerjahn F, Ravetch J. Fcgamma receptors: old friends and new family members // J. Immunity - 2006. - 24, № 1. P.19-28.
8. Garcia E., Brown E., Rosales C. Transmembrane mutations to Fc gamma RIIA alter its association with lipid rafts: implications for receptor signaling // J. Immunol. - 2007 - 178, № 5. P. 3048-3058.
9. Dickinson B., Badizadegan K., Wu Z. at al. Bidirectional FcRn-dependent IgG transport in a polarized human intestinal epithelial cell line // The Journal of Clinical Investigation. 1999. - 104. P. 903-911.
Summary D. M. Masyuk
POLYPEPTIDE COMPOSITION OF Fc-y-RECEPTORS OF BOVINE ENTEROCYTE'S BASOLATERAL MEMBRANE IN EARLY FETAL
PERIOD
The polypeptide composition and expression of Fc-y-receptors of enterocytes from bovine intestine at 2-, 3-, 4- month of fetal developing was investigated. The results of immunobloting show common similar composition of Fc-y-receptors extracted from basolateral domen during while early fetal period. Fc-y-receptors polypeptide composition in this period is represented molecular weight 120, 87, 72 and 43 kDa. Maximal expression of Fc-y-receptors polypeptide is molecular weight 87 kDa.
Key words: basolateral membrane, small intestine, enterocytes, fetus, fetal period, immune blotting, Fc- y-receptors.
Стаття надшшла до редакцИ 9.04.2008
170
